TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CULIACÁN

Departamento de Ingeniería Química-Bioquímica

REPORTE DE PRÁCTICA

UNIDAD 4. Replicación de la información genética

ANÁLISIS E IDENTIFICACIÓN VIRTUAL DE GENES PRESENTES EN

PLÁSMIDOS

Alumno(a):

-Jorge Armando Silva Sánchez

-Oscar Ramón Palazuelos Navarro

Docente
Dr. Jesús Jaime Rochín Medina

Culiacán, Sinaloa 28 de octubre de 2022

 ÍNDICE

Resumen --------------------------------------------------------------------------------- 1

Introducción --------------------------------------------------------------------------------- 2

Objetivo --------------------------------------------------------------------------------- 3

Procedimientos --------------------------------------------------------------------------------- 4

Resultados --------------------------------------------------------------------------------- 8

Conclusiones --------------------------------------------------------------------------------- 12

Propuesta ---------------------------------------------------------------------------------- 13

Referencias --------------------------------------------------------------------------------- 15

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 Resumen

La recombinación genética se efectúa cuando un gen de interés ingresa a un

plásmido, formando así un plásmido recombinante. Esta técnica es utilizada por diversos

investigadores para la síntesis de proteínas en organismos, abarcando áreas como la

agricultura, biomedicina y tecnología sanitaria.

En esta práctica se simuló por medio de técnicas virtuales la formación de un

plásmido recombinante con un gen de interés, analizando su mecanismo de recombinación

e identificando los genes presentes en el plásmido.

Para esta investigación se focalizó en el gen de la proteína verde fluorescente,

producida por la medusa Aequorea victoria. Este gen tiene la capacidad de sintetizar a la

GFP o proteína verde fluorescente, la cual otorga a las células la propiedad de la

fluorescencia.

Después de concretar el plásmido recombinante y corroborar su exitosa unión del

gen de interés, se planteó una propuesta en beneficio al diagnóstico de enfermedades;

donde el gen que sintetiza a la GFP, permite identificar ciertas células invisibles al aplicar

fluorescencia en ellas.

Palabras clave:

 Tecnología del AND recombinante

 Plásmido
 Proteína verde fluorescente (GFP)
 Enzima de restricción
 Tecnología Sanitaria

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 Introducción

El ADN recombinante es la tecnología utilizada para la unión y recorte de

secuencias de ADN de interés. Su campo de aplicación abarca la estimulación de la síntesis

proteica en cualquier organismo vivo para un beneficio específico, desde el fortalecimiento

de un cultivo contra plagas hasta la expresión de una proteína fluorescente que permite

identificar células cancerígenas.

Con el paso del tiempo los científicos han estudiado la manera de manipular la

información genética de cualquier tipo de organismo vivo, siendo esto una herramienta

primordial en la creación de alternativas médicas para el control y prevención de

enfermedades.

La tecnología del ADN recombinante sustenta su mecanismo de acción en el uso de

un plásmido modificado genéticamente a beneficio de la proteína que se quiera sintetizar;

dicho plásmido es transportado por medio de una bacteria que se volverá recombinante y al

infectar al objeto en cuestión, la expresión del gen sintetizará la proteína deseada.

“El plásmido es una molécula pequeña de ADN circular que se encuentra en las

bacterias y algunos otros organismos microscópicos. Los plásmidos están separados

físicamente del ADN cromosómico y se replican de manera independiente”. (Aarti,2022)

Para esta investigación se enfocará en el caso de la proteína verde fluorescente,

donde utilizando un análisis virtual se simulará la creación de un plásmido recombinante

que contenga el gen sintetizador de dicha proteína.

La proteína verde fluorescente (o GFP, por sus siglas en inglés, Green Fluorescent

Protein), es producida por la medusa Aequorea victoria, la cual emite bioluminiscencia de

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un color verdoso, este gen ha logrado tener avances importantes para los investigadores

logrando otorgar una nueva dimensión visible al ojo humano.

El gen que codifica esta proteína es el gen de la GFP, dicho gen puede ser

introducido a un organismo vivo por medio de la infección de una bacteria, la cual contiene

un plásmido recombinante.

En esta práctica se buscará efectuar este mecanismo de recombinación, usando

nuestro gen de interés como objeto de estudio, para poder analizar su posible realización en

la praxis real y emitir una propuesta sustentada en la recombinación con nuestro gen para

un beneficio de la sociedad.

Objetivo

Utilizar técnicas virtuales para el análisis e identificación de genes presentes en

plásmidos con el fin de comprender el mecanismo de acción de la tecnología recombinante

y asi generar una propuesta en beneficio a la tecnología sanitaria.

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 Procedimiento

Recopilación del material a usar

Para la presente práctica necesitaremos acceder a la página web “jugando a

ingenieros genéticos”, con el fin de encontrar las figuras que nos serán de utilidad para

llevar a cabo una construcción de ADN Recombinante.

Realización de preparativos

Una vez teniendo las figuras, procederemos a recortarlas como se nos indica; es

importante utilizar tijeras o cúter para poder tener una mayor precisión al momento de

recortar. Primeramente, empezaremos a cortar los segmentos de ADN del plásmido, las

cuales son seis tiras (figura 3); continuamente recortaremos el ADN de la célula donante

del gen (figura 4), ya que este gen será el que introduciremos dentro del plásmido. Luego

recortaremos nuestras enzimas de restricción (figura 5), las cuales nos ayudarán a realizar el

corte en nuestro ADN. Por último, obtendremos las figuras de las cajas Petri con cultivos y

distintos antibióticos, estas nos serán de utilidad para comprobar la eficacia de la resistencia

a antibióticos de nuestro plásmido recombinante.

Figura 1. Recorte de segmentos de ADN para la formación del plásmido.

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Preparación del plásmido

Usando las figuras recortadas realizaremos la construcción del plásmido; para esto

solo utilizaremos las piezas de la figura 1, donde necesitamos adherir de forma lineal las

tiras de izquierda a derecha, formando un círculo que simule la estructura del plásmido.

Figura 2. Plásmido.

Recombinación

Debemos realizar un corte simultáneo entre el ADN del plásmido y ADN de la

célula donante del gen, esto con ayuda de las enzimas de restricción buscando un sitio en el

cual puedan actuar en los dos ADN para unirse entre sí y tener una coincidencia de

nucleótidos entre ambos ADN. Es importante resaltar que no debemos de eliminar lugares

donde estemos descartando genes de resistencia, pues se quiere tener la mayor cantidad de

ellos.

Una vez teniendo los segmentos finales de ADN cortados, ensamblaremos los sitios

de cortes del ADN del plásmido con el ADN de la célula donante del gen apoyándonos de

cinta adhesiva. Aquí muy importante que los nucleótidos coincidan con sus respectivos

pares de bases, por el contrario, estos no se unirán de manera adecuada al ADN.

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 Análisis del plásmido recombinante

Una vez insertado el gen de interés efectuaremos una observación primorosa a

nuestro plásmido, aseverando que se encuentren tanto el origen de replicación del plásmido

como todos los genes de resistencia a antibióticos de la bacteria.

Con la información recabada, elegiremos la caja Petri con los antibióticos que

nuestro plásmido recombinante es capaz de resistir, tomando en cuenta los genes de

resistencia que contiene.

Finalmente emitiremos una conclusión basada en la composición final de nuestro

plásmido y el efecto de la posible expresión proteica del gen que escogimos.

Figura 3. ADN del plásmido sin modificar, con sus genes de resistencia y su origen de

replicación.

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Figura 4. ADN de la célula donante del gen y el gen codificador de la proteína de interés.

Figura 5. Enzimas de restricción.

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 RESULTADOS

Tabla 1. Resultados generales de la recombinación

Genes/segmentos Tipo de Enzimas de restricción Imagen del plásmido

preservados en el corte utilizadas recombinante

plásmido recombinante

 Genes de Cohesivos Para el ADN de la

o
resistencia: pegajosos célula donante del gen:

a. Ampicilina  HPAII

b. Kanamicina

c. Tetraciclina Para el ADN del

 Origen de plásmido:

replicación  HPAII

 Gen codificador

de la GFP

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Figura 6. ADN Recombinante

El plásmido recombinante obtenido se obtuvo por medio de la unión del ADN de la

célula donante del gen, y el ADN del plásmido. Los cortes realizados se ejecutaron con la

enzima de restricción HPII, dicha enzima corta de forma cohesiva y se utilizó para todos los

sitios de corte, tanto en el ADN del plásmido como en el de la célula donante del gen

codificador. Esto no quiere decir que se deba utilizar solamente una de forma obligatoria, si

no que en este caso esta única enzima nos funcionó para ensamblar los pares de bases

adecuadamente, y preservar los genes que nos interesaban. Así mismo, los sitios de corte se

realizaron considerando mantener de forma intacta el origen de replicación del plásmido y

el gen codificador de la proteína de interés, además de tratar de conservar la mayor cantidad

de genes de resistencia a antibióticos posibles.

Se analizó la secuencia de nuestro plásmido recombinante y pudimos concretar los

genes que se preservaron en su estructura final: gen de resistencia a la ampicilina, gen de

resistencia a la kanamicina, gen de resistencia a la tetraciclina, secuencia de origen del

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plásmido y por ultimo el gen de interés, el cual se optó por utilizar el gen codificador de la

GFP, o por sus siglas en inglés “Green fluorescent protein”.

Esto nos indicó que la bacteria recombinante procedente del plásmido obtenido

tendrá una resistencia a los antibióticos ampicilina, tetraciclina y kanamicina. De tal manera

que, al colocarla en un antibiograma con estos antibióticos, su proliferación se llevará a

cabo de forma positiva. (Figura 7).

Figura 7. Cajas Petri con cultivos y antibióticos.

Hasta este punto se logró comprender el proceso de la obtención del plásmido

recombinante, sin embargo, este plásmido debe ser introducido a una bacteria para poder

lograr el verdadero objetivo de la tecnología del ADN recombinante, que es sintetizar una

proteína o producto de interés.

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 Este proceso comienza con la estimulación de las bacterias por medio de un golpe

de calor, la cual permite que algunas de estas acepten el plásmido. Las bacterias que

aceptaron el plásmido se aislarán y multiplicarán, obteniendo así solo bacterias

recombinantes que tienen el gen codificador de nuestra proteína de interés.

A partir de aquí ya depende del fin que queramos darle a nuestra recombinación.

Por ejemplo, si queremos sintetizar alguna proteína en un cultivo, existen diferentes

técnicas para adherir esta bacteria recombinante, como lo es la infección del suelo donde se

desarrolle la planta, o por métodos directos como una micropistola. El cultivo infectado

empezará a sintetizar la proteína que deseamos, pues el gen que se encuentra en la bacteria

recombinante comenzará a expresarse.

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 CONCLUSIONES

En este análisis virtual se determinó la formación de un plásmido recombinante con

un gen de interés por nombre “gen de la proteína verde fluorescente”.

Por medio de técnicas virtuales nos fue posible el reconocimiento del mecanismo de

acción utilizado en la recombinación genética, de tal forma que, nos permitió plantear

diferentes propuestas en la implementación de genes a organismos biológicos, con el fin de

que se sinteticen proteínas específicas para un propósito biotecnológico.

La explicación de este mecanismo de inserción del gen de interés se designó gracias

a la simulación práctica de la construcción del plásmido recombinante.

Dicho plásmido recombinante se construyó pensando en la preservación de los tres

genes de resistencia a antibióticos (gen de resistencia a la kanamicina, gen de resistencia a

la tetraciclina), el origen del plásmido y por último el gen de interés (gen de la GFP).

Los resultados obtenidos demuestran un plásmido recombinante con los genes de

resistencia a los antibióticos mencionados, esto nos permitió inferir que la bacteria que se

volverá recombinante luego de la introducción de nuestro plásmido, tendrá mayores

probabilidades de supervivencia en el organismo que esta infecte, pues habrá menos

sustancias químicas que impidan su crecimiento; esto permitiría una reproducción

bacteriana más segura donde la proteína proveniente del gen de interés, se sintetice con

mayor eficacia.

Conociendo la capacidad de la tecnología recombinante y su fundamento de acción,

sumado a la comprobación exitosa de la inserción del gen de interés al plásmido, se podrían

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plantear propuestas del uso de esta novedosa área de investigación en beneficio de la

tecnología sanitaria y la salud.

PROPUESTA A SOLUCION DE PROBLEMAS

La medicina moderna dedica gran parte de su tiempo a la constante innovación en la

búsqueda y creación de métodos para el tratamiento de enfermedades. Uno de los

problemas que frena a estos procesos es la imposibilidad de análisis y rastreo de células

invisibles al ojo humano como células T y B, neuronas y células madre cancerígenas,

siendo estas dos últimas de mayor relevancia a nuestro criterio, en el campo de la

biomedicina y el diagnóstico precoz de enfermedades.

Nuestra propuesta nace de esta problemática, ¿Qué pasaría si la proteína verde

fluorescente sintetizada en organismos vivos por la activación de nuestro gen permitiera

observar el comportamiento de células invisibles como las neuronas?

Partiendo del fundamento de que se podría lograr construir una bacteria

recombinante con el gen de la GFP y los respectivos genes de resistencia antibiótica

adheridos a un plásmido, es posible pensar en la elaboración de un producto modificado

genéticamente, infectando el suelo con la bacteria recombinante donde este se desarrolle y

así obtener un alimento transgénico que, al ser ingerido, permita al organismo del

consumidor sintetizar la proteína verde fluorescente.

Imaginemos que tenemos un grupo de ratones. En sus primeras semanas de vida los

ratones son nutridos con el alimento transgénico portador del gen de la GFP; dicho gen se

expresaría y la síntesis de la proteína verde fluorescente comenzaría a sintetizarse en su

organismo volviéndose parte de la composición de las células que se designó estudiar, las

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neuronas, por ejemplo. Estas neuronas que de forma normal no lo harían, llevan

incorporadas en su estructura a la fluorescencia. Entonces aplicamos luz ultravioleta, las

moléculas son excitadas por radiación electromagnética e increíblemente obtenemos unas

neuronas que emiten luz visible.

El abanico de posibilidades que te permitiría poder ver el comportamiento y

movimiento de las neuronas es abismal. Se descubriría la causa de enfermedades como el

Alzheimer, Parkinson o trastornos cerebrales como la esquizofrenia.

No cabe duda de que la tecnología del ADN recombinante es el futuro de la

biomedicina. Sin embargo, existe una estrecha línea de moralidad que impide por completo

el avance de esta rama de la investigación en seres humanos. Sabemos que se puede lograr,

pero alterar el material genético de un organismo vivo para obtener una ventaja física

podría considerarse por muchos, que prácticamente es jugar a ser dioses. Esperamos que

esta tecnología se mantenga al margen de la bioética y se explore su potencial benéfico a la

salud humana que promete.

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 Referencias

Pérez Millán, M. I., & Becú-Villalobos, D. (2009). La proteína verde fluorescente ilumina la

biociencia. MEDICINA (Buenos Aires), 69(3), 370-374.

López Domínguez, J., Moran Sarmina, K. M., Placier Sosa, D., & López Monteon, A.

(2018). TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE. Kuxulkab’, 23(47), 41-47.

Disponible en: https://doi.org/10.19136/kuxulkab.a23n47.2627

National Human Genome Research Institute. (2022). Plásmido. Disponible en:

https://www.genome.gov/es/geneticsglossary/Plasmido#:~:text=Un%20pl

%C3%A1smido%20es%20una%20mol%C3%A9cula,se%20replican%20de

%20manera%20independiente

Las células madre tumorales se pueden rastrear gracias a su fluorescencia. (2014). Agencia

SINC. Disponible en:

https://www.agenciasinc.es/Noticias/Las-celulas-madre-tumorales-se-pueden-

rastrear-gracias-a-su-fluorescencia

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