Lucía Alba Ordóñez 3ºGBTG

TEMA 2: PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

1. HOSPEDADORES PARA LA PRODUCCIÓN E PROTEONAS RECOMBINANTES

La obtención de proteína recombinante se suele hacer mediante sistemas de superproducción

con clonación del gen de interés y expresión en un hospedador. En ocasiones se emplea el propio
productor (se requiere una expresión más elevada e inducible puesto que producirán en caso
contrario la cantidad que necesiten). Los principales en orden decreciente son: bacterias,
levaduras, hongos filamentosos, células vegetales, células animales, plantas y animales.

Las baterías y
levaduras permiten
tener mayor
rendimiento, con
cantidades enormes,
mientras que de las
células de insecto y de
mamíferos obtenemos
menos cantidades
Modificaciones post-traduccionales

pero tienen mejoras

en la complejidad para
la producción de estas
proteínas.

1.1. Producción de proteínas recombinantes en bacterias

La producción microbiana de proteínas presenta las siguientes VENTAJAS:

- Capacidad de crecimiento sobre sustratos de bajo coste.

- Crecimiento rápido.
- Crecimiento hasta alta densidad celular.
- Escalado a nivel industrial relativamente sencillo.
- Altísimo nivel de producción.

No obstante, tenemos también algunas DESVENTAJAS:

- No hay mucha modificación postraduccional en bacterias.

- Acumulación de proteínas mal plegadas en cuerpos de inclusión.

Entre los hospedadores bacterianos más usados tenemos a E. coli:

1
Lucía Alba Ordóñez 3ºGBTG

- E. coli es el hospedador más utilizado del cual tenemos un amplio conocimiento de su

fisiología. Posee sistemas genéticos muy desarrollados y sistemas de producción muy
eficaces. El problema es que es una Gram-negativa por lo que cuenta con LPS
(endotoxinas), peligrosas para los humanos. Además tiene una capacidad limitada de
secreción al medio.

Tenemos igualmente otros hospedadores:

- Bacillus spp: Gram-positiva, secreción. No obstante tenemos que eliminar sus proteasas
extracelulares, que podrían degradar las proteínas recombinantes.
- Streptomyces: Gram-positiva, secreción, medicamentos. Es una productora de
antibióticos muy segura.
- Lactococcus: Gram-positiva, alimentos.
- Caulobacter crescentus: secreción. Tiene una capa S proteica con una señal de secreción
que secreta muchísima proteína.
- Enterococcus y Methylobacterium: metilotrofas. Fuentes de C muy económicas.

2. SISTEMAS DE EXPRESIÓN

Un sistema de expresión es un sistema generado mediante tecnología del ADN recombinante

consistente en un vector provisto de elementos reguladores, un fragmento de ADN clonado y un
organismo hospedador que, en condiciones adecuadas, promueven la producción a altos niveles
de una o más proteínas, normalmente de origen diferente al organismo hospedador (proteína
heteróloga).

2.1. Componentes de un sistema de expresión bacteriano

MCS

Se necesita un vector de expresión que contenga una región promotora, un gen regulador que
controle dicha región, terminadores de la transcripción (TT) flanqueando al promotor y al MCS
(sitio múltiple de clonación para meter el gen que nos interesa bajo el promotor y).Estos
terminadores no son esenciales, pero pueden evitar que se de la transcripción completa del
plásmido si no estuviera el terminador siguiente al gen o la producción de proteínas quiméricas
si no estuviera el que precede al promotor debido a secuencias presentes aún de la última
transcripción.

Las características deseables de los sistemas de expresión son las siguientes:

- Nivel de expresión inducido alto (para obtener mayor rendimiento), pero nivel de
expresión basal bajo (para evitar toxicidad).
- Posibilidad de inducción gradual o parcial.

2
Lucía Alba Ordóñez 3ºGBTG

- Condiciones de cultivo flexibles.

- Regulación simple y económica. Sistemas inducibles
- No alteración de la fisiología global del microorganismo.

2.2. Señales en cis en sistemas de expresión de E.Coli

Promotores

Son los principales determinantes de la regulación de la producción, normalmente son

promotores dependientes de σ70 (excepción: promotores dependientes de ARN polimerasas de
fagos, como el promotor σ10 de T7 . Suelen ser promotores fuertes, con alta semejanza a la
secuencia consenso y suelen ser promotores inducibles, que se activan en respuesta a una señal
química (o física) aplicada al medio de cultivo.

Señales de inicio de la traducción

La Shine-Dalgarno presenta una secuencia similar a la consenso,complementaria al extremo 3’

del ARN ribosómico, para poder emparejarse y a una distancia de 4-12 nucleótidos del codón de
inicio. Entre esta y los codones de incio (eficacia → AUG > GUG > UUG ) existe un espaciador.

La traducción está fuertemente influenciada por la presencia de estructuras secundarias en el

ARN en la región de inicio de la traducción (plegamientos de la cadena monocatenaria sobre sí
misma).

Otras señales

Los terminadores suelen utilizarse por delante y por detrás del sistema para aislar la
transcripción del sistema del contexto en que se encuentra.

Las señales de secreción se emplean para que la proteína sea secretada al medio o al espacio
periplásmico mediante la inclusión de las señales correspondientes (un péptido señal en el
extremo amino de la proteína). Si se desea que la proteína sea secretada al medio o al espacio

3
Lucía Alba Ordóñez 3ºGBTG

periplásmico deben incluirse las señales correspondientes (normalmente un péptido señal en el

extremo amino de la proteína)

Las etiquetas (tags) para purificación: son secuencias de aminoácidos de longitud variable con
propiedades que permiten la purificación de la proteína producida mediante cromatografía de
afinidad.

3. PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN E. COLI

3.1. Sistemas basados en P lac: Características del promotor P lac silvestre

Es un sistema inducible de control negativo, inducible por lactosa (compuesto metabolizable) o

IPTG (Se requiere una permeasa para la introducción de lactosa en la célula, que inactiva el
represor lacI. Sin embargo, se puede usar como inductor IPTG que no lo requiere) y reprimible
por glucosa, la inducción es gradual y el promotor no es muy fuerte(no es suficiente con la
presencia de IPTG, ya que el promotor plac no es muy fuerte , se requiere además el concurso
activador de CRP en presencia de AMPc, es decir, ausencia de glucosa.

El represor lacI se une a múltiples operadores, tres en concreto. O1 es el principal, situado muy
cerca del promotor, y su deleción impide totalmente la represión. n. En presencia de lactosa o
IPTG, y en ausencia de glucosa, el represor LacI deja libre el promotor. O1. Por otra parte, O2 y
O3 se encuentran más lejos y su deleción individual reduce la represión entre un 25-50%. Su
deleción simultánea genera consecuencias similares a la deleción de O1. Es decir, Si eliminamos
diversos operadores la represión es cada vez menos eficaz, lo que provoca niveles basales
mayores.

Hoy en día el promotor Plac no se emplean, sino sus variantes:

Promotor PlacUV5: inducible por lactosa o IPTG (caro), la inducción es

gradual y el promotor no es muy fuerte. Cuenta con una expresión basal
alta. Es independiente de glucosa, no necesita la activación por parte de
CRP

Promotores PTRC y PTAC: inducible por lactosa o IPTG (caro), la inducción

es gradual, el promotor es muy fuerte y la expresión basal es alta. Es
independiente de glucosa, no necesita la activación por parte de CRP. Se
expresa a niveles muy altos, por lo que es interesante cuando la proteína
a producir no hace daño al organismo. Son de los promotores más fuertes
existentes.

4
Lucía Alba Ordóñez 3ºGBTG

También se pueden usar variantes del represor lacI:

- lacIq : mutación del promotor lacI que expresa 10 veces más lacI que el promotor
silvestre. Se usa para contrarrestar los altos niveles basales, reduce los niveles basales
de expresión( niveles altos como con los promotores trc y tac)
- lacIts: Como el IPTG es muy caro, se busca alternativa. Se trata de una proteína de lacI
termosensible, mutaciones estructurales que desestabiliza la estructura sin romperla
entera. Tenemos que a temperatura permisiva, reproble normalmente, pero a
temperaturas altas, la proteína se desestabiliza y no reprime, es decir se inactiva al
represor a alta temperatura (42ºC). Permite sustituir al IPTG por la inducción térmica.

3.2. Sistemas basados en la ARN polimerasa del fago T7

Es una polimerasa codificada

en el genoma fago T7, que se
caracteriza por ser mucho
más simple que las
polimerasas bacterianas.

- Tiene una transcripción

muy selectiva: solo transcribe
los promotores del fago, por
lo que si tenemos un gen de
interés en E.Coli , detrás de un
promotor de T7, y
expresamos la polimerasa de
T7 en E.Coli, toda la
transcripción va a estar fijada en el promotor, ya que E.Coli naturalmente no tiene
promotores de T7 delante de ninguno de sus genes.
- Elongación muy procesiva y 5 veces más rápida que la ARN polimerasa bacteriana: una
vez que empieza a elongar el transcrito, la probabilidad de lo deje sin terminar es muy
baja. Es tan procesiva que es posible que se salte terminadores, lo que puede suponer
un problema.
- No es sensible a rifampicina: la rifampicina es un inhibidor de la ARN polimerasa
bacteriana, esto permite usar rifampicina para inhibir la transcripción de la polimerasa
bacteriana de todos los demás genes de la bacteria y así están todos los recursos
disponibles para la ARN polimerasa de T7 para transcribir el gen de interés.
- El problema fundamental es que los niveles de expresión basales son muy altos, no se
puede usar con proteínas potencialmente tóxicas. Siempre se producirá una mínima
parte de polimerasa de T7, y como esta es tan procesiva se sintetiza proteína con
facilidad incluso en condiciones de represión.

Combinado con el promotor Plac puede empelarse un sistema de expresión basado en la

ARN polimerasa de T7. Este sistema consta de: el gen 1, que codifica para la ARN polimerasa
de T7 bajo el control de placUV5 integrados en el genoma bacteriano, un plásmido lacIq con
el gen de la lisozima de T7 y un plásmido con el gen de interés bajo el promotor de T7. Para
que Plac UV5 esté lo más apagado posible, tenemos lacIq que produce 10 veces más

5
Lucía Alba Ordóñez 3ºGBTG

represor, siempre que no hay IPTG. Pero aun así, los niveles siguen siendo alto, para ello se
utiliza la lisozima de t7, que inhibe de la polimerasa de T7, es decir su propia lisozima rompe
el peptidoglicano e inhibe su actividad, por lo que así lo que conseguimos es bajar los niveles
basales. De esta manera, si inducimos la expresión del promotor de lacUV5, producimos la
RNA polimerasa de T7.

Ojo: añadimos IPTG para retirar la represión y producir la polimerasa T7, pero si queremos
añadir rifampicina para anular la transcripción de los demás genes, no podemos a la vez que
el IPTG, ya que el gen 1 esta bajo un promotor si es transcrito por la polimerasa bacteriana
y no obtendríamos transcribir el gen 1 con la polimerasa T7.

3.3. El promotor araBAD (PBAD)

El promotor de la arabinosa es un
promotor que en principio es parecido a
lac, tiene un sitio de CRP que el sistema
requiera que no haya glucosa, y sitios de
unión de una proteína reguladora llamada
AraC

- AraC: no es solo un represor, es un

represor y un activador. En condiciones de
represión (no hay arabinosa), AraC se une
a a O1 y O2, provocando un dobles en la
molécula de ADN y uniendo esos dos
sitios en forma de puente. En cambio en
presencia de arabinosa esa estructura
deja de ser estable, y favorece otra forma
dimérica donde quedan unido O1 y I,
donde este último activa la transcripción.
- Conseguimos una represión muy eficaz, una transcripción muy eficaz y una transición
entre ambos gradual, a medida que aumentamos concentración de arabinosa,
disminuimos la probabilidad derepresión y aumentamos la probabilidad de activación.
Además de una expresión basal muy baja y un inductor muy económico (arabinosa más
barato que IPTG).
- Pero lo inconvenientes son: que es activado por CRP (reprimible por glucosa y una
expresión inducida no tan alta como otros sistemas. ( normalmente este sistema se usa
cuando creemos que la proteína a producir puede causar daños en el organismo).

Esta grafica nos muestra el funcionamiento del sistema AraC-PBAD

6
Lucía Alba Ordóñez 3ºGBTG

3.3. Sistema en cascada NahR-Psal-XylS2-Pm

Es un sistema de expresión cuyo propósito es combinar el nivel basal bajo con un nivel inducido
elevado. Se basa en promotores de utilización de degradación de compuestos aromáticos.

Es un sistema inducible de control positivo, con una regulación en cascada basado en los
promotores Psal y Pm.

- Psal: Es un promotor procedente de la ruta del naftaleno, el cual degrada a salicilato está
regulado por un activador NahR que es inactivo a menos que haya Salicilato. Es decir el
Salicilato es un inductor que activa a NahR.
- Pm: es un promotor procedente del sistema de regulación de los operones de
degradación de xilenos. Es activado por un activador llamado XylS, que es inactivo a
menos que haya 3-metil-benzoato.

Entonces contamos con 2 sistemas de regulación y dos inductores diferentes. A través de

mutagénesis dirigida se ha conseguid variantes de XylS que además de seguir respondiente al 3-
metil benzoato, ahora también responde a salicilato. Existe un alelo de este gen, xylS2, que
responde a salicilato, simplemente por una mutación. A parir de esto, se crea un sistema en
cascada:

Tenemos un sistema de regulación que regula a un segundo sistema que a su vez regula a los
genes de interés. En el módulo regulador, utilizamos Psal, inducible por salicilato, pero detrás de
Psal ponemos XylS2, que codifica a la variante del activador XylS. Por otra parte en el módulo de
expresión, utilizamos Pm y detrás el gen de interés, así Pm se induce también por salicilato
usando XulS2 como activador. La misma señal: salicilato, opera en los dos niveles.

A través de este sistema lo que conseguimos es multiplicar los niveles de inducción.

En este ejemplo, se esta produciendo B-galactosidasa. Vemos

como sobre Psal y XylS2 por separado, y vemos que en la
cascada se aumenta la producción de proteina.

El sistema en cascada mejora las prestaciones de sus

7
componentes por separado
Lucía Alba Ordóñez 3ºGBTG

4. PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN BACTERIAS DISTINTAS DE E. COLI

Producción con secreción de proteínas recombinantes en bacterias Gram-positivas: las

bacterias gran positivas tiene la posibilidad de super producir proteínas pero con secreción al
medio. Además algunos organismo tiene sistemas específicos que favorecen el plegamiento de
las proteínas producidas, al ser gran positivas no presentan exotoxinas y son aptas para
producir proteínas de uso terapéutico o para alimentación.

4.1. Algunos sistemas de expresión de bacterias Gram-positivas

Los sistemas de
expresión en Gram
positivas están mucho
menos desarrollados que
en E.Coli

4.2. Sistemas de secreción en bacterias Gram-positivas: Bacillus subtilis

Esta capacidad de secreción deriva de un sistema super sofisticado que garantiza la secreción,
plegamiento y procesamiento y la eliminación de proteínas mal plegadas.

El sistema de secreción está formado por: Sec (secreta las proteínas sin plegar gracias a
chaperonas a medida que se sintetiza), TAT (secreta proteínas plegadas), SunT-SpaT y Com.
Contará con translocasas para que la proteína sintetizada atraviese la membrana, chaperonas de
secreción para impedir el plegamiento y señales peptidasas. Los puentes disulfuro presentes en
las proteínas no se forman en el citoplasma debido a su carácter reductor, sino a la acción de
tiol-disulfuro oxidorreductasas que los generan durante la secreción.

Al producir proteínas heterólogas puede pasar que las proteasas las degraden, la solución a esto
es mutar las proteasas. El problema de esto es que las proteasas son esenciales para controlar
la actividad de las autolisinas, que deben romper el peptidoglicano solo en determinados
momentos. Eso este regulado por proteólisis de las propias autolisinas, por lo que si tenemos un

8
Lucía Alba Ordóñez 3ºGBTG

mutante de las proteasas, las autolisinas se descontrolan y romperían el peptidoglicano sin

control. Por lo tantos las cepas productoras deben tener mutaciones en las proteasas y también
en algunas autolisinas claves para impedir la lisis.

5. PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN LEVADURAS

Las levaduras como organismos productores presentan las siguientes ventajas:

- Secreción eficaz al medio de cultivo

- Mejor plegamiento de proteínas eucarióticas
- Modificación correcta de muchas proteínas eucarióticas
- Aptas para producir proteínas de uso terapéutico o para alimentación

5.1. Sistemas de expresión en Saccharomyces cerevisiae

Se usan vectores denominados anfibios, ya que son

capaces de replicarse tanto en E. coli como en esta
levadura. Para ello, los vectores empleados cuentan con
dos orígenes de replicación: un origen de replicación de E.
coli y otro de S. cerevisiae. Se suelen emplear dos tipos de
orígenes de replicación de levadura:

- ARS-CEN, de bajo número de copias. Cuenta con

centrómero, de manera que se reparte como cualquier
cromosoma. (Alta estabilidad)
- Círculo de 2μ, de alto número de copias. Obtenido del
plásmido 2 micras, presente en levaduras de manera
natural. (Poca estabilidad)

Los marcadores de selección más empleados suelen ser de dos tipos:

- Marcadores biosintéticos, de auxotrofías. Son los más comunes. Se trata de genes

esenciales para la biosíntesis de determinados compuestos, de manera que empleando
levaduras que carezcan de los genes de biosíntesis que porte el vector, pueda
seleccionarse los transformantes.
- Marcadores de resistencia a antibióticos, como geneticina, higromicina o nourseotricina.

9
Lucía Alba Ordóñez 3ºGBTG

En cuanto a los promotores, destacan:

- PADH1 (potente, de hecho demasiado, con lo que no se puede regular bien, y es

constitutivo).
- PMET3 (reprimido por metionina; debido a que es necesario retirarla del medio para
activar el sistema, es más complejo).
- PPHO5 (reprimido por fosfato inorgánico; debido a que es necesario retirarlo del medio
para activar el sistema, es más complejo).
- PCUP1 (inducido por iones Cu2+, usándose concentraciones bajas pero suficientes en
orden de evitar daños celulares).
- PGAL1 (muy fuerte , se induce por galactosa y se reprime por glucosa).

En cuanto al terminador, se emplea Ter CYC1 (propio de la citocromo oxidasa). La señal de

secreción por excelencia, por otro lado, es la del pre-propéptido del factor sexual alfa, que se
libera naturalmente al medio.

5.2. Sistema de expresión en Pichia Pastoris:

El metanol se puede utilizar como fuente de carbono y energía, ya

que esta es una levadura metilotrofa. Es la fuente de carbono más
barata que hay. Tiene la ventaja respecto a la anterior de que esta
levadura hace menos fermentación y por tanto genera más
biomasa. No existen plásmidos autorreplicativos en esta especie.
Por ello, se emplean plásmidos con origen de replicación en E.
coli, pero sin origen de levadura, siendo necesario que sean
integrativos.

Los marcadores de selección empleados son del mismo tipo que para S. cerevisiae. En cuanto a
los promotores, cabe señalar los siguientes:

- PAOX1 (alta eficiencia, inducible por metanol).

- PGAP (alta eficiencia, constitutivo).
- PFLD1 (alta eficiencia, inducible por metanol o metilamina).
- PPEX8 (eficiencia moderada, inducible por metanol u oleato).
- PYPT1 (baja eficiencia, constitutivo).

El terminador más típico es el propio de la alcohol oxidasa 1 (TerAOX1). Por último, cabe indicar
que las señales de secreción más destacables son la señal de la fosfatasa alcalina (PHO1) de
Pichia y la del pre-propéptido del factor sexual alfa, de S. cerevisiae.

Sistema de expresión integrativo en P. pastoris

10
Lucía Alba Ordóñez 3ºGBTG

La integración del plásmido en el genoma de P. pastoris puede llevarse a cabo de dos maneras:

• Se introduce como un plásmido circular, con el gen clonado, y se hace una

recombinación del gen de auxotrofía del plásmido con el del genoma de Pichia, que es
defectuoso. Para seleccionar el transformante, se selecciona en un medio sin el
nutriente para el que el mutante sea auxótrofo (en el ejemplo histidina). La levadura en
que se haya integrado se convierte en protótrofa. El problema es que, al igual que es
fácil de integrar, es fácil de desintegrar, con lo que continuamente hay que estar
reseleccionando (mantener prototrofía, ya que al ser solo un evento de recombinación,
puede escindirse.).
• La otra forma es mucho más estable tras integrar. Se coge el plásmido y se corta en el
Bgl II, quedando una secuencia lineal desde el promotor de AOX1, hasta el terminador
del gen AOX1. En este caso la recombinación no es a través del gen de auxotrofía (en el
ejemplo, his4), ya que la estirpe debe de carecer completamente del gen. Se recombina
con el gen AOX1 del genoma, vía el promotor y el terminador, ya que el vector cuenta
con los del gen AOX1. Así, se sustituye el gen AOX1 por el gen de interés. Como resultado,
será mutante para AOX1, con lo que no podría usar metanol en principio. Sin embargo,
tiene otro gen, AOX2, con lo que puede seguir empleando metanol. La ventaja con
respecto a la anterior, es la estabilidad.

6. FACTORES QUE AFECTAN A LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES.

1. Factores relacionados con el fondo genético y el vector: Genotipo de la estirpe

hospedadora y Número de copias.
2. Factores relacionados con la regulación de la expresión génica: Promotor, Terminador
transcripcional, Señales de traducción y Uso de codones :distintos codones pueden
corresponder a un mismo aminoácido pero la probabilidad de que se traduzca de cada
uno es distinto en cada organismo (que no suficientes ARNt porque no es propio del
organismo hace que se produzcan mal proteínas que no sean del organismo)
3. Factores relacionados con las condiciones de cultivo: Temperatura, Tasa de crecimiento
y Otras condiciones de cultivo.

7. PROBLEMAS EN LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES Y SOLUCIONES

PROBLEMA CAUSA SOLUCIÓN POSIBLE

Pérdida de la viabilidad 1- Alta expresión basal de una 1.1- Usar un sistema de
proteína tóxica expresión con control estricto de
la expresión basal
1.2- Usar un promotor más débil
(como el de arabinosa) 1.3-
Producir a temperatura y/o
concentración de inductor más
baja. Si el inductor es “todo o
nada”, no vale, sólo con
inducción gradual.
Baja producción, poca 1- Promotor ineficaz 1- Usar un sistema de expresión
proteína 2-Degradación del ARNm más fuerte
3- Iniciación de la traducción 2- Expresar en un mutante
ineficaz. La SD no se está defectivo en ARNasa E (inicia la

11
Lucía Alba Ordóñez 3ºGBTG
detectando bien o ha
formado una estructura
secundaria.
4- Degradación de la proteína
5- Uso de codones diferente
al de E. coli
Producción inestable 1- Interferencia de
transcripción y replicación
plasmídica
2- Proteína con efectos
deletéreos (tóxicos)
Proteína de mala calidad 1- Cuerpos de inclusión. Es lo
más común, suele pasar por
la superproducción y rapidez
(chaperonas saturadas): Las
altas tasas de producción
hacen que la célula no tenga
tiempo suficiente para plegar
correctamente las proteínas
puesto que sus chaperonas
se encuentran saturadas. Por
ello al centrifugar para
separar los restos celulares
de las proteínas, éstas se van
al pellet
2- Sin puentes disulfuro : las
proteínas citoplasmáticas de
E. coli (y en otras bacterias)
no poseen puentes disulfuro,
ya que los azufres de las
cisteínas están reducidos.
3- Sin modificación
postraduccional
degradación del ARNm). Al ser
una enzima esencial, no
podemos eliminarla
completamente, usamos
mutantes termosensibles
3- Modificar RBS (sitio de unión
del ribosoma), por otro más
eficaz. Eliminar posibles
estructuras secundarias en el
RBS.
4- Expresar en mutantes
defectivos en proteasas (Lon,
OmpT)
5- Expresar ARNt raros (vector
pRARE). Eliminar codones raros
(ADN sintético)
1- Integrar en el cromosoma o
usar tiempo de inducción corto
(evitar que se pierda el
plásmido)
2.1- Acortar el tiempo de
producción
2.2- Usar un tag autoagregante
(secuencia corta que se añade a
la proteína para que se agregue
a cuerpos de inclusión). Después
puede intentarse corregir el
plegamiento.
1- Bajar la temperatura,
coexpresar chaperonas o
resolubilizar los cuerpos de
inclusión con urea o agentes
desnaturalizantes como la
guanidina
2- Secreción al periplasma,
coexpresión de disulfuro
isomerasas o uso de mutantes
de los genes gor y trxB
(codificantes de la glutatión
reductasa y tiorredoxina
reductasa, reducción de puentes
disulfuro. Los mutantes en estos
genes no podrán reducir las
cisteínas de los puentes
disulfuro)
3- Usar un sistema de expresión
eucariótico
12
Lucía Alba Ordóñez 3ºGBTG

Diferencias en el uso de codones de arginina entre E. coli y humanos

Todos los aminoácidos pueden estar codificados por más de un codón, pero hay codones que no
se usan mucho llamados “codones raros” y otros que son abundantes. Dependiendo del
organismo existirá distinta concentración de cada tRNA en función de si es muy utilizado o no.

8. ETIQUETADO DE PROTEÍNAS PARA SU PURIFICACIÓN

Etiqueta o tag: Son proteínas o péptidos capaces de unir un ligando que se fusionan a la
proteína de interés para facilitar su purificación. Se puede etiquetar en el extremo amino
(añadiéndola antes del MCS) o en el extremo carboxilo (clonándola después del MCS). Lo más
importante es que la proteína siga funcionando si no podemos eliminar el tag.

Las etiquetas más frecuentes son las siguientes:

- Tags cortos:
o Etiqueta de 6 histidinas (HIS6): 48%. 6
aas. Afinidad por cationes divalentes
como Co2+ o Ni2+
o FLAG Tag: 10%. 8 aas. Reconocido por
unos anticuerpos monoclonales, anti-
FLAG.
- Tags largos
o Glutatión-S-transferasa (GST): 20%. 218
aas. Afinidad por glutatión (GSH)
o Maltose Binding Protein (MBP): 8%. 396
AAs. Afinidad por amilosa.

13
Lucía Alba Ordóñez 3ºGBTG

o Sistema IMPACT: Inteína (secuencia de aminoácidos que tiene la capacidad de

autoproteolizarse en determinadas condiciones) de levaduras con un dominio
de unión a quitina. 134-454 AAs. Autoeliminable.

La eliminación del tag de purificación puede realizarse mediante corte proteolítico o mediante
la autoeliminación de un tag de inteína (el sistema IMPACT).

En el primer caso se realiza una

cromatografía obteniendo una matriz unida
al tag y, a su vez, adherida a la proteína de
interés. Posteriormente se eluye añadiendo
otro componente que tenga aún más
afinidad por el tag y se corta la unión con
una proteasa específica (el tag cuenta con un
sitio de corte para algunas proteasas). Sin
embargo, en muchos casos el sitio de corte
queda enmascarado por el plegamiento y no
es accesible.

El segundo caso se basa en un usar este mismo sitio de corte pero añadiendo proteasas
directamente como eluyente una vez la proteína con la etiqueta se haya pegado a la matriz,
obteniendo la proteína purificada. La matriz se regenera con 1% SDS o 0.3 M NaOH.

14
Lucía Alba Ordóñez 3ºGBTG

15