Fermentaciones industriales

1.- Introducción

     En este capítulo vamos a utilizar la producción de vino como esquema para estudiar los
principios básicos de la microbiología industrial y de la biología de microorganismos. Más
adelante estudiaremos otros procesos de producción industrial con un mayor detalle.

     La microbiología industrial está dedicada a la utilización comercial de microorganismos e

incluye procesos que tienen gran importancia económica, ambiental y social.

     Tradicionalmente se ha utilizado la palabra fermentación en microbiología industrial para

describir los procesos de cultivo de microorganismos con propósitos industriales. Sin embargo,
no hay que confundir esta utilización del térmico con el proceso bioquímico de fermentación
consistente en la regeneración del poder reductor (NADH) por un procedimiento no oxidativo
(estos procesos se estudiarán más adelante en el curso). La fermentación que tiene lugar en la
producción del vino, en este sentido, comprende ambos significados: por un lado, se trata
bioquímicamente de un proceso de fermentación (producción de alcohol a partir de glucosa en
condiciones anaerobias) y es una fermentación industrial en el sentido de que se trata de un
proceso industrial llevado a cabo por microorganismos.

     El desarrollo de una fermentación industrial incluye dos tipos de procesos denominados, por
sus nombres en inglés, procesos upstream y procesos downstream. Los procesos upstream
comprenden la selección y preparación del microorganismo, la preparación del medio de
cultivo y de las condiciones de fermentación (cultivo). Los procesos downstream incluyen la
purificación del producto y el tratamiento de los residuos de la fermentación.

     En el proceso de fermentación del mosto de uva para producir vino, podemos distinguir los
procesos upstream de la selección y preparación de cepas de levadura, tratamiento del mosto y
acondicionamiento de loas condiciones de fermentación. Los procesos downstream
comprenden, en este caso, el tratamiento del vino para su clarificación y el de los residuos del
proceso.

     Los productos fabricados por fermentaciones industriales pueden agruparse grosso modo en
dos clases:

 (1) los productos de gran volumen y bajo valor (en este grupo se incluyen los productos
alimenticios, bebidas, aditivos alimentarios y algunos productos químicos producidos
por fermentación) y,

 (2) los productos de bajo volumen y alto valor (los fármacos, por ejemplo).

     Por otro lado, hay que señalar que tienen origen en fermentaciones industriales un gran
número de productos de uso cotidiano que pertenecen a diferentes grupos:

 (1) alimentos (derivados lácteos y de vegetales fermentados), bebidas (vino, cerveza,

etc.), aditivos alimentarios (vinagre, ácido cítrico, carotenos, etc.).
  (2) productos farmacéuticos: antibióticos ß-lactámicos (penicilinas y cefalosporinas),
antibióticos aminoglicósidos y tetraciclinas; compuestos antitumorales y otros fármacos
(lovastatina, por ejemplo, utilizada para controlar la producción de colesterol).

 (3) Enzimas microbianas tales como proteasas, amilasas, etc.

 (4) Productos químicos tales como alcoholes, polisacáridos, disolventes (acetona),

lípidos, productos base para la producción de plásticos, etc.

 (5) Productos recombinantes diseñados por ingeniería genética.

     Además de estas utilidades, los microorganismos se usan industrialmente en ciertos

procesos de microbiología ambiental tales como el tratamiento de residuos sólidos y líquidos y
en biorremediación. Estos aspectos serán tratados más adelante en este curso.

2.- Producción de vino

     Se trata de una fermentación para la fabricación de un producto de gran volumen y bajo
valor añadido. En el proceso, un hongo (Saccharomyces cerevisiae) crece utilizando el azúcar
(glucosa) presente en el mosto de uva para producir alcohol. El proceso puede esquematizarse
como sigue:

     Vamos a utilizar el estudio de la fermentación del vino para revisar los factores que
intervienen en un proceso industrial estudiando en los próximos apartados

 El microorganismo (hongos)
 El crecimiento de microorganismos
 El medio de cultivo
 El proceso de fermentación

2.1.- El microorganismo: Saccharomyces cerevisiae. Los hongos

     La levadura Saccharomyces cerevisiae es un hongo ascomiceto unicelular. Los hongos son
organismos eucarióticos (sus células tienen una organización interna en orgánulos
membranosos) quimioheterótrofos. A continuación vamos a explicar el concepto de
quimioheterótrofo y a describir los principales grupos de hongos.

     Los organismos necesitan carbono y energía para poder crecer. En la naturaleza las fuentes
de energía pueden ser químicas (energía presente en los enlaces de compuestos químicos) o
lumínica (energía de la luz que se transforma en energía química). Por otra parte, las reaccines
de óxido-reducción que tienen lugar en los seres vivos requieren donadores de electrones que
pueden ser orgánicos o inorgánicos.

Por último, el carbono puede encontrarse de dos formas, como carbono orgánico y
como carbono inorgánico (CO2). La combinación de estas posibilidades da lugar a las
diferentes categorías de microorganismos en función de su nutrición:
 Fuente de Fuente de Fuente de
Tipo de nutrición Ejemplo
energía electrones carbono

Quimiótrofos Química - - -
Fotótrofo Luz - - -
Organótrofo - Comp. orgánico - -

Litótrofo -
Comp. inorgánico - -

Autótrofo - - Inorgánico
-

Heterótrofo - - Orgánico
-
Bacterias, hongos,
Quimioorganó
Química Comp. orgánico Orgánico
(hetro)trofo
animales.
Quimioliot(auto)
Química Comp. inorgánico Inorgánico
trofo Algunas bacterias

Fotolito(auto)trofo Luz Comp. inorgánico Inorgánico

Bacterias, plantas, algas
Fotoorgano (hetero)
Luz Comp. orgánico Orgánico
trofo Algunas bacterias, algas

    Como puede verse, las bacterias presentan una gran versatilidad metabólica. Mucho mayor
que la que presentan plantas, animales u hongos. En cualquier caso, los principales
microorganismos de interés aplicado industrial pertenecen al grupo de los quimioheterótrofos.

     El microorganismo responsable de la fermentación alcohólica de la producción del vino es

la levadura S. cerevisiae. Las levaduras son hongos unicelulares, a diferencia de otro tipo de
hongos a los que conocemos como filamentosos. Sin embargo, biológicamente, ambos tipos de
hongos (unicelulares o filamentosos) son similares. Las levaduras se multiplican en los medios
de cultivo como células aisladas individuales que se dividen y, de esta forma, aumentan su
número. En el caso de los hongos filamentoso, sin embargo, las células se encuentran
contenidas dentro de unos tubos formados por la pared celular. Estos tubos se denominan hifas
y van creciendo por sus puntos (crecimiento apical) y ramificándose para formar la colonia que
denominamos micelio. Por consiguiente, los hongos filamentosos tienen un crecimiento
micelial, mientras que las levaduras no.

     Es importante tener en cuenta que en el crecimiento micelial, sólo el borde de la colonia (las
puntas de las hifas) crece. La parte central de una colonia micelial está formada por células
viejas mientras que el borde de la colonia está formado por células jóvenes. Las células jóvenes
se encuentran en trofofase (fase de alimentación y crecimiento), mientras que las células viejas
se encuentran en idiofase (fase de diferenciación). Cuando observamos una colonia micelial
(por ejemplo una colonia de moho sobre una naranja), el crecimiento de la colonia se produce
sólo por el borde de la parte mohosa y en la parte central de la colonia se produce la
diferenciación que dará lugar a la formación de las esporas y a la aparición del color verdoso
característico.
     Las células jóvenes desarrollan la mayoría de la actividad metabólica del hongo, liberando
enzimas al medio y absorbiendo los nutrientes. La zona central, por otra parte, tiene células en
las que se acumulan las substancias de reserva que pueden ser necesarias para que el micelio
colonice nuevas zonas pobres en nutrientes (por ejemplo, cuando el moho de una fruta
comienza a extenderse por la fuente de plástico en la que se encuentra) o cuando el hongo se
diferencia (por ejemplo, cuando produce esporas o cuerpos fructíferos).

     El crecimiento de un hongo como levadura o como hongo filamentoso está, en algunas
ocasiones, regulado por condiciones ambientales, de forma que un mismo hongo puede crecer
en ciertas situaciones como levadura y en otras como hongo filamentoso (por ejemplo, los
hongos patógenos ustilago maydis y Candida albicans).

     Otro aspecto importante a tener en cuenta es que la pared celular de los hongos (levaduras y
filamentosos) es diferente de la de las bacterias y de la de las plantas. La pared celular de
bacterias está formada por peptidoglicano, mientras que la de hongos por quitina y
polisacáridos (glicanos) y la de las plantas por celulosa.

     Por último hay que recordar que como organismos eucarióticos que son, los hongos tienen
su núcleo diferenciado en el interior de la célula, tienen varios cromosomas, la división celular
se produce por mitosis (proceso que no ocurre en bacterias) y la producción de células sexuales
por meiosis.

     La clasificación de los hongos es muy compleja y aquí vamos a ver sólo lo más simple para
poder seguir el curso. La clasificación se basa en dos criterios: (1) si las hifas están tabicadas
(divididas en células) o no y (2) dentro de los hongos con hifas tabicadas, en la organización de
las esporas sexuales.

 Los hongos con hifas no tabicadas se denominan Ficomicetos (esta nomenclatura y

clasificación, repito, puede encontrarse de forma diferente en distintos libros). Los
ficomicetos son hongos inferiores (en algunos casos se discute si son hongos o no) y
viven en ambientes acuosos. Destacan los géneros Mucor que participa en la
producción de algunos tipos de alimentos y Phytophthora alguno de cuyos miembros
son patógenos vegetales (P. infestans, por ejemplo).

 Los hongos superiores se pueden agrupar en tres clases

o Ascomicetos. En ellos las esporas sexuales (ascosporas) se encuentran en el
interior de una bolsa o asca. Son ejemplos de ascomicetos la levadura S.
cerevissiae, los hongos filamentosos Neurospora, y hongos comestibles como
las trufas. Son el grupo de hongos más abundante.

o Basidiomicetos. En ellos las esporas sexuales (basidiosporas) se encuentran en

el exterior de unas estructuras com forma de maza denominadas basidios.
Pertenecen a este grupo levaduras como el patógeno humano Cryptococcus
neoformans que produce meningitis en pacientes inmunodeprimidos, el
patógeno vegetal Ustilago maydis que produce tumores en los granos del maíz,
hongos superiores con cuerpos fructiferos complejos (setas) tales como el
champiñón (Agaricus bisporus) y la seta de chopo (Pleurotus ostreatus), etc.

o Deuteromicetos. Tradicionalmente se conocían como hongos imperfectos

porque en ellos no se había podido encontrar la forma sexual y, por
 consiguiente, no se sabe si producen ascosporas o basidiosporas. Actualmente y
mediante el uso de técnicas de análisis del ADN se ha podido determinar que la
mayoría de ellos pertenecen al grupo de los ascomicetos y, por alguna razón,
han perdido la posibilidad de realizar la reproducción sexual.

Alguno de los hongos más importantes en microbiología industrial son

deuteromicetos: Penicillium productor de la penicilina, Aspergillus productor de
ácido cítrico y de lovastatina; también se encuentran en este grupo hongos
patógenos vegetales como Trichoderma y Verticillium, y hongos patógenos
oportunistas animales tales como Candida albicans

2.2.- Crecimiento celular

     En este apartado vamos a revisar el estudio de la cinética del crecimiento de

microorganismos que crecen aislados. Esta es la forma de crecimiento de la levadura (hongo
unicelular) y de las bacterias.

     Es importante conocer la cinética de crecimiento de los cultivos microbianos porque es

necesario poder predecir cómo va a evolucionar un cultivo, cómo va a ir consumiéndose el
substrato y cómo se va a ir acumulando el producto de una fermentación. Sin conocer estos
factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un fermentador de 10.000 litros, por ejemplo,
con el coste que ello supone, puesto que no podemos predecir qué va a pasar, cuándo va a
completarse el crecimiento, cómo se va a acumular el producto, etc.

     Las células aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado van
utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez que pueden,
sintetizando sus propios componentes celulares y dividiéndose en cuanto han podido duplicar
su masa y su material genético. El tiempo que tarda una célula en hacer todo lo anterior es lo
que conocemos como tiempo de generación y puede variar desde unos 20 minutos en
condiciones óptimas hasta varios meses en condiciones del suelo. Cada vez que transcurre un
tiempo de generación, el número de células se duplica, siguiendo, por tanto, un incremento
exponencial.

Si llamamos N0 al número de células inicial, y g al número de generaciones transcurridas, el

número de células final (N) será:

Llamando T al tiempo de generación y t al tiempo de cultivo transcurrido, la ecuación anterior

puede transformarse en la siguiente:

Las ecuaciones exponenciales son muy difíciles de manejar gráficamente, por ello es mejor
transformarlas en algo más simple, como puede ser una recta.

Para transformar las ecuaciones anteriores en una recta, tomamos logaritmos en los dos
términos y resulta:
Esto es: el logaritmo del número de células crece linealmente con el tiempo a razón de una
constante igual a ln2/T. Si el tiempo de generación T es muy grande, el crecimiento tendrá
poca pendiente (será lento) y si T es pequeño el crecimiento será rápido.

     En un crecimiento equilibrado, todos los parámetros de crecimiento evolucionan en

paralelo. Esto es: el incremento en el número de células, en la biomasa de cultivo y en la
acumulación de metabolitos primarios, proteínas, ácidos nucleicos etc., es paralelo. Por tanto,
en la ecuación anterior N puede representar cualquiera de estos factores.

Otra forma de representar la cinética es considerando el incremento en el número de células

(dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuación que describe la cinética es
la siguiente:

esto es: el incremento del número de células (dN) por unidad de tiempo (dt) es proporcional al
número de células presentes en el cultivo (N). A la constante de proporcionalidad (µ) se le
denomina tasa de crecimiento y puede considerarse algo así como la probabilidad de que una
célula se divida en un tiempo determinado.

Integrando la ecuación anterior durante el tiempo de cultivo, se transforma en la siguiente

función exponencial:

la transformación de esta ecuación en una recta (tomando logaritmos) rinde lo siguiente:

esto es: el incremento del logaritmo del número de células aumenta linealmente con el tiempo
siendo la constante de proporcionalidad µ. Comparando esta ecuación con  la similar
presentada más arriba, podemos concluir que µ = ln2/T y, por consiguiente, que T = ln2/µ. Es
decir, que hay una correlación inversa entre el valor de la tasa de crecimiento (µ) y el tiempo
de generación.

     Estas ecuaciones nos permiten predecir cuál será el número de células, masa celular, etc.
después de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos µ; o bien, poder calcular la tasa de
crecimiento µ a partir de medidas experimentales del  incremento en el número de células,
biomasa, etc.
El gráfico  representa la variación de la biomasa (o número de células, etc.) de un cultivo (línea
roja) a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un substrato cuya concentración
(línea azul) decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa. Esta relación de
proporcionalidad puede expresarse de la forma siguiente:

donde dS indica la variación de la concentración del  substrato. Al valor Ys lo denominamos

rendimiento de utilización del substrato, ya que mide la cantidad de biomasa que puede
producirse por unidad de substrato consumido:

El rendimiento de utilización de diferentes substratos puede ser diferente (hay substratos, o

alimentos, que "engordan" más que otros), varía entre diferentes microorganismos (en un símil
antropomórfico: hay personas que engordan más que otras comiendo lo mismo) y varía
también en función de otras condiciones ambientales o fisiológicas (no engorda lo mismo uno
al comer algo si está sano o enfermo o si está en verano o en invierno). También varía el
rendimiento en función de que el metabolismo sea oxidativo o fermentativo (estos conceptos
serán revisados más adelante).

     Podemos calcular el rendimiento de la utilización del substrato en función de la cantidad de

substrato añadido al cultivo, o en función de la cantidad de carbono presente en ese substrato
(por ejemplo). Asimismo, podemos calcular la cantidad de biomasa total gramos de células,
por ejemplo) o de carbono presente en las células (aproximadamente el 505 de la masa celular
corresponde a carbono).
Haciendo las transformaciones que se indican a la derecha sobre la fórmula que relaciona la
variación de biomasa con la de substrato, llegamos a la definición de un nuevo concepto qs
denominado tasa específica de consumo de substrato por el organismo.

  La tasa específica de consumo de substrato la podemos considerar la "velocidad" con la que el

organismo consume el substrato. Evidentemente, cuanto mayor sea la tasa de consumo mayor
será la velocidad de crecimiento (µ). Asimismo, cuanto mayor sea el rendimiento del substrato
consumido, también mayor será la tasa de crecimiento.

     Sin embargo, hay una cierta compensación entre la tasa de consumo del substrato y el
rendimiento de forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de substrato
tienen rendimiento más bajos (o cuando se dan las condiciones para una alta tasa, el
rendimiento disminuye). A esta correlación inversa se le conoce con el nombre de efecto
Pasteur.

     Por último, nos falta relacionar la tasa de crecimiento (µ) con la concentración de substrato
(S). En condiciones de substrato abundante, la concentración de este no afecta al valor de µ;
pero cuando el substrato se hace limitante, sí existe ese efecto. La expresión matemática que
relaciona ambos parámetros se conoce con el nombre de ecuación de Monod y es la siguiente:

   En esta ecuación la tasa de crecimiento (µ) depende de la máxima que puede alcanzar el
microorganismo, de la concentración de substrato y de un valor K s que representa la
concentración de substrato a la que se alcanza una tasa de substrato a la que se alcanza una tasa
de crecimiento igual a la mitad de la máxima.

La ecuación de Monod tendrá mucha importancia al tratar de cultivos continuos. Para que se
cumpla esta ecuación el rendimiento debe ser independiente de la concentración de substrato.

2.3.- Fases del crecimiento de un cultivo

     En este apartado vamos a revisar el estudio de la cinética del crecimiento de

microorganismos que crecen en un cultivo realizado en un volumen finito. a esto se le
denomina cultivo batch y podríamos traducirlo por cultivo discontinuo por contraposición con
el cultivo continuo que desarrollaremos más adelante. El desarrollo de un cultivo discontinuo
se ajusta al representado en la siguiente figura:
 Se pueden distinguir cuatro fases en el cultivo:

(1) la fase lag en la que el microorganismo se adapta a las nuevas condiciones y pone
en marcha su maquinaria metabólica para poder crecer activamente. La duración de esta fase es
variable y en general es mayor cuanto más grande sea el cambio en las condiciones en las que
se encuentra el microorganismo.

(2) La fase exponencial cuya cinética explicamos en la página anterior.

(3) La fase estacionaria en la que no hay aumento neto de microorganismos, lo que no

significa que no se dividan algunos, sino que la aparición de nuevos individuos se compensa
por la muerte de otros.

(4) La fase de muerte en la que el número de microorganismos vivos disminuye de

forma exponencial con una constante k que depende de diferentes circunstancias.

En la fase de muerte decimos que el número de microorganismos vivos disminuye

exponencialmente. Pero ¿qué es un microorganismo vivo en términos microbiológicos?.
Consideramos vivo al microorganismo que puede multiplicarse (dividirse), y muerto al que ha
perdido irreversiblemente la capacidad de dividirse. Es importante entender este concepto
porque los microorganismos microbiológicamente muertos no tienen porqué estar
metabólicamente inactivos.

2.4.- Medida del crecimiento microbiano

     Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo diferentes parámetros algunos de los
cuales presentaré a continuación. No debemos olvidar que en condiciones de crecimiento
equilibrado todos los parámetros del cultivo evolucionan de forma proporcional y, por
consiguiente, midiendo uno de ellos (el de medida más fácil) podemos medir el resto.

   En este apartado revisaremos los principales métodos de recuento de microorganismos. Una

información más completa puede encontrarse en la conexión     Métodos de recuento.
     Los métodos para el seguimiento de la evolución de un cultivo microbiano pueden
clasificarse en directos e indirectos. Los métodos directos se basan en la medida de la
evolución del número de células vivas (técnicas de plaqueo) o del número de partículas
(técnicas microscópicas y de contadores de partículas). Los métodos indirectos se basan en la
medida de algún parámetro del cultivo que nos permite deducir información sobre la evolución
del número de microorganismos. La elección de un método de seguimiento del cultivo en
concreto depende de las características del cultivo y del proceso.

     Entre los métodos principales de recuento de microorganismos podemos destacar:

1.- Las técnicas de recuento microscópico de células sin fijar usando microscopía de contraste
de fae. Para ello se cuenta el número de partículas en un volumen determinado usando una
célula de Petroff-Hauser o de Neubauer (portaobjetos modificado en e que una rejilla nos
permite conocer el volumen que estamos observando). El procedimiento es rápido y sencillo;
pero no permite distinguir células vivas inmóviles de células muertas.

2.- Contaje de partículas utilizando sistemas automáticos del tipo Coulter Counter. La
operación de estos sistemas es sencilla (método de empleo) y permite rápidamente determinar
el número de patículas presentes en una suspesión y la distribución de sus tamaños. El
problema es que no distingue entree células vivas y muertas ni entre células y agregados de
material insoluble presente en la suspensión del cultivo.

3.- Técnicas de recuento en placa, basadas en colocar en un medio de cultuivo adecuado un

volumen determinado de muestra. Cada una de las células aisladas dará lugar, después de la
incubación correspondiente, a una colonia de forma que el número de estas nos permitirá
estimar el número de células presentes en la muestra plaqueada (sembrada). El sistema es fácil
de utilizar en el caso de células aisladas (no sirve en el caso de hongos filamentosos, por
ejemplo). Puede realizarse sembrando en superficie (extendiendo un volumen dado de muestra
sobre el medio de cultivo sólido) o en profundidad (mezclando un volumen dado de muestra
con el medio de cultivo antes que solidifique). Esta última opción permite realizar el recuento
de microorganismos microaerófilos que no crecen bien en la superficie de las placas de cultivo.
Para que el sistema de recuento en placa tenga validez estadística, es necesario contar entre 30
y 300 colonias con objeto de disminuir el error de la medida.

4. Técnicas turbidométricas basadas en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los

que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las
partículas en suspensión (células) y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un
equipo similar al que se emplea en la medida de la absorbancia de luz por disoluciones
coloreadas (colorímetro, por ejemplo). Las medidas se hacen a una longitud de onda adecuada
(normalmente en el entorno de 550 nm) y los valores se suelen denominar valores de densidad
óptica. La limitación de este sistema, por otra parte muy sencillo, es que no distingue células
vivas de muerta y que normalmente no es capaz de detectar densidades celulares menores a
10.000 células por mililitro.

5.- Medida de peso seco. El sistema consiste en la filtración del cultivo a través de una
membrana que retenga las células y su posterior desecación hasta peso constante. El sistema,
obviamente, no diferencia células vivas de muertas y su sensibilidad es limitada.

6.- Medida del ATP. Es una medida relativamente sencilla basada en la emisión de luz por la
luciferasa de luciérnaga (Photimus pyralis) en presencia de O2 y de ATP. De esta forma se
puede medir la concentración de ATP en un volumen dado de cultivo. Esta medida es
interesante porque la concentración de ATP decae rápidamente en las células muertas, de
forma que esa medida indirecta detecta únicamenta las células vivas.

     Los sistemas de medida del crecimiento celular se han adaptado técnicamente para poder
ser utilizados como sistemas online. En una opración on line no es necesario extraer la muestra
del cultivo para realizar la medida. Esto es muy importante en el caso de fermetaciones en gran
volumen porque permite realizar medidas en tiempo real y disminuye los riesgos de
contaminación.

     Antes de cerrar este apartado hay que señalar que en la naturaleza hay muchísimos más
microorganismos de los que podemos detectar por la mayoría de los sistemas de recuento. De
hecho, se estima que en el suelo o en el agua podemos cultivar únicamete proporciones
menores al 1% de los microorganismos vivos. Esto es debido a varias causas entre las que se
cuenta la falta de medios de cultivo adecuado, la dependencia de otros microorganismos para el
cultivo debido a procesos de sintrofía y la oligotrofía (inhibición por altas concentraciones de
nutrientes) que muestran algunos microorganismos.

 2.5.- Factores ambientales que afectan al crecimiento de microorganismos

     Una vez visto cómo podemos seguir la evolución de un cultivo, vamos a recordar que en un
proceso de crecimiento equilibrado todos los parámetros del cultivo evolucionan manteniendo
unas proporciones constantes. Por tanto, la medida (seguimiento) de cualquiera de los factores
nos permite seguir la evolución de los otros.

     ¿Qué factores ambientales influyen en el crecimiento microbiano?. A continuación vamos a

revisar los que son estrictamente ambientales y más adelante revisaremos los relacionados con
los nutrientes del cultivo. Entre los factores ambientales destacan los siguientes:

Temperatura

     Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada. Si consideramos la

variación de la velocidad de crecimiento () en función de la temperatura de cultivo, podemos
observar una temperatura mínima por debajo de la cual no hay crecimiento (dX/dt = 0); a
temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la
temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura óptima a la que  es máxima (para
las condiciones de concentración de substrato en que se trabaja, ver la discusión anterior al
respecto). Por encima de esta temperatura óptima, la velocidad de crecimiento decae
bruscamente (µ  0) y se produce la muerte celular.

     El incremento de µ con la temperatura se debe al incremento generalizado de la velocidad

de las reacciones enzimáticas con la temperatura. Se denomina coeficiente de temperatura a la
relación entre el incremento de la velocidad de reacción y el de temperatura. En términos
generales, la velocidad de las reacciones bioquímicas suele aumentar entre 1.5 y 2.5 veces al
aumentar 10ºC la temperatura a la que tienen lugar. La ausencia de crecimiento (µ=0) a
temperaturas muy bajas se debe a la reducción de la velocidad de crecimiento y al cambio de
estado de los lípidos de la membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos (algo
parecido a la precipitación del aceite a bajas temperaturas) impidiendo el funcionamiento de la
membrana celular. La muerte celular a altas temperaturas se debe a la desnaturalización de
proteínas y a las alteraciones producidas en las membranas lipídicas a esas temperaturas.
     Es importante tener en cuenta que a temperaturas muy bajas, el metabolismo celular es muy
bajo y las células paran de crecer; aunque no tienen porqué comenzar a morir. Sin embargo,
cuando la temperatura es superior a la óptima, se produce la muerte celular rápidamente (como
veremos más adelante) y las células no pueden recuperar su capacidad de división si baja
posteriormente la temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por frío.

     Hay varios tipos de microorganismos en función de sus temperaturas de crecimiento

mínima, máxima y óptima.

Tipode Temp. Temp. Temp.

microorganismo mínima óptima máxima
Psicrófilo -5  +5 12 - 15 15 - 20
Psicrótrofo -5  +5 25 - 30 30 - 35
Mesófilo 5 - 15 30 - 45 35 - 47
Termófilo 40 - 45 55 - 75 60 - 90

     Además de los indicados existen organismos hipertermófilos que pueden crecer a
temperaturas cercanas o incluso superiores a 100ºC en condiciones de alta presión. Son
microorganismos muy importantes desde el punto de vista ambiental; pero no tienen
aplicaciones actuales en agronomía o en microbiología industrial.

     Los microorganismos psicrótrofos son mesófilos que pueden crecer a temperaturas bajas.
Esto es importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando
alimentos, son capaces de crecer en condiciones de refrigeración (4 - 8ºC) y de producir
infecciones en los consumidores del alimento (30 - 35 ºC).

     Los microorganismos deben ser cultivados a la temperatura adecuada para que su
crecimiento sea el deseado. En cualquier caso, hay que tener en cuenta los problemas derivados
de las altas temperaturas y controlar la de los fermentadores para evitar la esterilización de los
cultivos. Estas altas temperaturas, por otro lado, tienen interés aplicado en el campo de la
termodestrucción de microorganismos y en algunos procesos de fermentación en los que el
incremento de temperatura que se produce es capaz de eliminar los microorganismos mesófilos
patógenos presentes.

Importancia de los microorganismos de ambientes extremos

     La mayor parte de los microorganismos de importancia aplicada tanto en microbiología

industrial como alimetaria son mesófilos, psicrófilos o psicrótrofos. En los procesos de
compostaje, el papel de los termófilos es importante, y también hay que conisderar la presencia
de esporas termorresistentes en el estudio de los tratamientos térmicos de termodestrucción de
microorganismos en alimentos.

     Sin embargo, es creciente el número de productos que se producen partiendo de

microorganismos termófilos porque producen proteínas termorresistentes que tienen gran
utilidad en procesos aplicados. Quizá el mejor ejemplo de esto es la ADN polimerasa Taq
obtenida a partir de la eubacteria termófila Thermus aquaticus. Esta enzima permite sintetizar
in vitro ADN a alta temperatura lo que ha sido esencial para el desarrollo de la tecnología de la
reacción en cadena de la polimerasa (conocida por sus iniciales en inglés: PCR) lo cual ha
supuesto un avance en la biología molecular, el diagnóstico y la detección de microorganismos
en los ambientes más variados.

2.5.1. Aplicación de la temperatura en la termodestrucción de microorganismos

    Un aspecto aplicado muy importante de la temperatura es su utilización para la esterilización

por calor. Es necesario esterilizar ciertos ambientes o instrumentos, o eliminar de ellos una
parte muy importante de su carga microbiana. Esto se puede hacer con facilidad y de forma
controlada mediante tratamientos términos. En esta sección veremos cómo se puede predecir
cómo será la evolución de las poblaciones microbianas como consecuencia de su exposición a
latas temperaturas.

     Habíamos visto en su momento que durante la fase de muerte, la desaparición de

microorganismos seguía la cinética descrita en la ecuación siguiente:

esto es: la fase de muerte también sigue una cinética exponencial y puede ser sometida a un
tratamiento matemático similar al usado para el tratamiento matemático del crecimiento. Si
representamos la variación del logaritmo del número de células supervivientes a un tratamiento
térmico realizado a una temperatura dada en función del tiempo de tratamiento, se obtiene una
gráfica como la siguiente:

el descenso del logaritmo de supervivientes es lineal con el tiempo. La recta tiene una
pendiente que permite calcular la velocidad de termodestrucción. Se define el valor D como el
tiempo necesario para que el número de supervivientes caiga al 10% del valor inicial (o, lo que
es lo mismo, para que el logaritmo del número de supervivientes se reduzca en una unidad). Si
consideramos N0 como el número de células al inicio del tratamiento y Nx el número de células
supervivientes después de un tratamiento de x minutos a una temperatura t, el tiempo de
termodestrucción se calcula de la siguiente manera:

Las unidades del D son minutos. El tiempo de termodestrucción (D) varía para cada
temperatura (de ahí el subíndice t) de forma que a mayores temperaturas el valor de D es
menor, es diferente para distintos microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones
fisiológicas.

Si aumentamos la temperatura de tratamiento, el valor de D disminuye de forma logarítmica tal

y como se indica en la siguiente gráfica:

De manera análoga a como el valor D indicaba el tiempo necesario para lograr que el número
de supervivientes se redujera al 10% de la población inicial, el valor z indica el incremento en
la temperatura (medida en número de grados) necesario para que el valor D se reduzca a la
décima parte del inicial. La fórmula incluida en la gráfica permite calcular el valor z cuando
conocemos el incremento de temperatura (t2-t1) y los respectivos valores D.

Los valores d y z varían para cada microorganismo y para cada condición. Las esporas, por
ejemplo, tienen valores D mucho más altos que las células vegetaticas de los mismos
microorganismos. Los microorganismos presentes en los alimentos, por otra parte, suelen tener
valores D más altos que cuando se cultivan en condiciones de laboratorio. Para poder
determinar las condiciones en las que hacer un tratamiento térmico para destruir
microorganismos es necesario dominar los conceptos de los valores D y z (ver problemas).

Otro valor que tiene gran importancia aplicada en el estudio de la microbiología de la

termodestrucción es el parámetro F que corresponde al tiempo equivalente (medido en minutos
de tratamiento a 250ºF, o 121.1ºC) a todo el calor recibido considerando su capacidad de
destruir microorganismos. Al valor de la integral del calor recibido se la denomina F0. Cuando
consideramos que el calentamiento es un proceso instantáneo, se puede calcular usando la
siguiente fórmula:

Es muy importante saber trabajar correctamente con los conceptos anteriores. Para ejercitarse
hay una colección de problemas en este enlace.

Otros tratamientos tecnológicos para destruir microorganismos (radiación, por ejemplo) son
susceptibles de tratamientos matemáticos similares a los descritos en esta sección.

2.5.2. Consideraciones sobre las bajas temperaturas

Los microorganismos se comportan a bajas temperaturas de forma diferente según se trate de

condiciones de refrigeración (0ºC-8ºC) o de congelación (por debajo de -20ºC).

En condiciones de refrigeración los microorganismos mesófilos y termófilos detienen su

crecimiento (µ=0) y se mantienen durante largo tiempo sin morir. Los psicrófilos y psicrótrofos
pueden crecer en estas condiciones y llegar a producir poblaciones importantes (esta es una
causa de deterioro de alimentos conservados en refrigeración).

En condiciones de congelación, la formación de cristales en el interior de las células produce

unas altas mortalidades que reducen el tamaño de la población. En el momento de la
congelación se produce la muerte rápida de muchos microorganismos y, a tiempos más largos,
la tasa de muerte se reduce aunque el número de viables sigue disminuyendo. En esta segunda
fase, la mortalidad es más rápida cuando la temperatura de congelación es más alta (más
próxima a valores de -20ºC) qwue cuando es menor (valores de -80ºC).

La tolerancia a la congelación de diferentes microorganismos puede variar.

No se puede considerar la congelación un procedimiento de esterilización sino sólo (en el caso

de microbiología de alimentos) un procedimiento de conservación.

Se pueden conservar largo tiempo cultivos de microorganismos o de células eucarióticas

congelados en medios que contengan agentes crioprotectores como el glicerol.

problemas de cálculo de cinética de termodestrucción de

microorganismos

21 de marzo de 2002
1.- Determinar el valor del tiempo decimal de termodestrucción a 116 ºC (D116) de un
microorganismo a partir de los siguientes datos de supervivencia al tratamiento

Duración del Número de

tratamiento viables

5 340.0

10 65.0

15 19.0

20 4.5

25 1.3

(Resultado: D116 = 8 minutos)

2.- El valor D120 para un microorganismo es de 3.0 minutos. Si tenemos una

contaminación inicial de 8 x 1012 células por gramo. ¿Qué valor de contaminación
tendrá la muestra después de un tratamiento térmico a 120ºC de 18 minutos?

(Resultado: 8 x 106 células por gramo)

3.- Cuando el valor de D se calcula a 121.1ºC (D121.1) se denomina frecuentemente valor

Dr. Calcular el valor de F0 para un tratamiento de una conserva destinado a reducir en un
factor de 1012 el riesgo de presencia de esporas de Clostridium botulinum (Dr = 0.21
minutos).

(Resultado: 2.52 minutos)

4.- Explicar qué se deduce de los datos de la tabla siguiente en la que se someten
diferentes tipos de alimentos a tratamientos térmicos a distintos valores de pH.

 
Valor de D (min.)

pH Espagueti en Macarrones Paella

salsa de tomate con queso

4.0 0.128 0.127 0.117

 4.2 0.143 0.148 0.124

4.4 0.163 0.170 0.149

4.6 0.223 0.223 0.210

4.8 0.226 0.261 0.256

5.0 0.260 0.306 0.266

6.0 0.491 0.535 0.469

7.0 0.515 0.568 0.550

5.- Para un microorganismo determinado el valor D104.4 es 113.0 min. y Dr es 2.3 min.
Calcular el valor z.

(Resultado: 9.9 ºC)

6.- Calcular el valor de F0 de un tratamiento térmico para una muestra sabiendo que D90
= 15 min. y z = 18 ºC.

(resultado: 3.4 minutos)

RENDIMIENTO ENERGÉTICO DE LAS

FERMENTACIONES
   

FERMENTACIÓN LÁCTICA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

C6H1206 + 2ADP + 2Pi C6H1206 + 2ADP + 2Pi

2C3H603 + 2ATP + 2H2O 2C2H50H + 2ATP + 2CO2

G0' = - 47 kcal/mol G0' = - 56.3 kcal/mol

     

Rendimiento energético (cond. Rendimiento energético (cond.

estándar): estándar):
(14.6/47.0)x100   =  31% (14.6/56)x100  =  26%