TEMA-4.

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Franklin1422

Biología Molecular y Citogenética

1º Laboratorio Clínico y Biomédico

POLITÉCNICO

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
FRANKLIN RAMOS PICO

TEMA 4. CITOGENÉTICA HUMANA Y ANÁLISIS

CROMOSÓMICO
4.1 INTRODUCCIÓN:
Cariotipo: es el conjunto de cromosomas de una especie de un individuo o de una célula
ordenados de acuerdo a su tamaño (posición del centrómero) y morfología.
Al final se colocan los cromosomas sexuales, independientemente de cual sea su tamaño.
El término se puede aplicar a tres niveles

Reservados todos los derechos.

● Cariotipo de especie: es el que está constituido por el conjunto normal de
cromosomas que caracteriza una especie determinada y es el patrón con el que hay
que comparar los cariotipos individuales y celulares para detectar mutaciones y
anomalías.
● Cariotipo del individuo o constitucional: es el conjunto de cromosomas
representativo del individuo, es decir aquel que contiene la mayor parte de las
células de su organismo.
● Cariotipo de célula: es el conjunto de cromosomas que contiene una célula.
Las indicaciones para realizar un cariotipo constitucional dependen de la edad y el momento
del desarrollo del individuo.
Independientemente de la edad, en pacientes con cualquier tipo de cáncer puede estar
indicando realizar un cariotipo de las células tumorales (cariotipo tumoral)

4.2 CARIOTIPO ESTÁNDAR DE SANGRE PERIFÉRICA:

Los cromosomas son más accesibles en ciertos tejidos específicos:
- sangre periférica
- piel (fibroblastos)
- células fetales
- médula ósea
El cariotipo constitucional estándar de un individuo se obtiene a partir de una muestra de
sangre periférica.
El procedimiento se desarrolla en 4 fases:
- Cultivo de linfocitos
- Obtención de extensiones metafásicas
- Tinción de los cromosomas
- Análisis de los cromosomas teñidos.

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 4.2.1 CULTIVO DE LINFOCITOS:
Se utilizan:
● La muestra: sangre periférica anticoagulada con heparina (no usa EDTA)
● Medio de cultivo: RPMI 1640, DMEM y Ham F10, suplementados con suero bovino
fetal, L-glutamina y antibióticos.
● Recipiente: Frasco roux o tubo para cultivo.

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El procedimiento del cultivo se realiza en varios pasos:
1. Siembra: añadir sangre heparinizada al medio de cultivo (1-5;1.10)
2. Adición de fitohemaglutinina: se une a linfocitos T y provoca su desdiferenciación a
linfoblastos. La cantidad a añadir depende del fabricante.
3. Incubación: a 37ºC y 5% Co2 durante 72h.
4. Detención de la mitosis en metafase: entre 2 h y 90 min antes de finalizar el periodo
de incubación, se añade colchicina (o colcemid) detiene la mitosis en metafase por
destrucción de los microtúbulos del huso acromático.

4.2.2 OBTENCIÓN DE EXTENSIONES DE METAFASES:

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Pasos del proceso:
1. Sacrificio del cultivo: el contenido del frasco de cultivo se trasvasa a un tubo falcon
cónico de 15 ml y se centrifuga a 1500 rpm durante 5-10 min.
Se elimina el sobrenadante, dejando una pequeña cantidad en la que se resuspende
el botón celular.
2. Choque hipotónico e incubación: se añade al tubo 5 ml de cloruro potásico 0,075M
se incuba según protocolo, se centrifuga a 1500 rpm 5-10 min.
Elimina sobrenadante.
Las células se cargan de agua y se hinchan.
En las células en las que se ha detenido la división en metafase, los cromosomas se
distribuyen por todo el volumen de la célula, separándose.
3. Fijación y lavado: Se realiza con fijador de Carnoy.
Añadir 5 ml de fijador al tubo con las células.
Mezclar y reposar 5 min. Centrifugar a 1500 rpm 5 min.
Eliminar el sobrenadante. realizar 2-3 lavados adicionales con el fijador hasta obtener
un botón celular blanco y limpio.
4. Obtención de extensiones por goteo: resuspender las células en fijador de carnoy.
Se carga la suspensión celular en una pipeta pasteur y se dejan caer una o dos gotas
sobre el portaobjetos (mantenidos en metanol) húmedo a una altura aproximada de
30 cm.
Al chocar la gota con el cristal, las células se rompen y los cromosomas se dispersan
sobre el cristal.
Dejar secar los portaobjetos para su posterior tinción.

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 5. Envejecimiento de las preparaciones: El envejecimiento de las preparaciones se
consigue con calor, calentando las preparaciones extendidas sobre el portaobjetos
(65ºC durante 1-2 días, a 37ºC durante 3-4 días o 100ºC durante una hora)

4.2.3 TINCIÓN Y BANDEO CROMOSÓMICOS:

A continuación las extensiones se tiñen por los métodos convencionales:
- Tinción de giemsa: inversión del porta en una solución de giemsa al 3% en tampón

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fosfato a pH 6,7 durante 3-4 min. Lavar con agua.
De esta forma se controla la calidad de las metafases antes de proceder a las técnicas de
bandeo:
- Bandeo G: Los procedimientos empleados dependen del laboratorio de citogenética.

4.3 ANÁLISIS CROMOSÓMICO:

De esta forma se obtiene el cariotipo.
El cariotipo evalúa el número y estructura de los cromosomas para poder detectar las
posibles anomalías,
La metodología usada consiste en:

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- El recuento y análisis cromosómico de metafases completas.
Para realizar un cariotipo se analizan un mínimo de 20 metafases completas
visualizadas con el objetivo 100x.
Al menos 5 de ellas se fotografían.
Las metafases fotografiadas se someten a un análisis completo, comparando cada
cromosoma con su homólogo banda a banda para detectar cualquier cambio.
- El ordenamiento y emparejamiento.
Finalmente, los cromosomas se ordenan por parejas de homólogos, constituyendo
un cariotipo,
El ordenamiento y emparejamiento se realiza en virtud de las características
morfológicas y el patrón de bandas G de los cromosomas metafásicos.

- CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE LOS CROMOSOMAS HUMANOS:

Los cromosomas se ordenan:
- Tamaño de mayor a menor
- Posición del centrómero
1. metacéntricos
2. submetacéntricos
3. alocéntricos
- Presencia de constricciones secundarias
- Al final se colocan los cromosomas sexuales, independientemente de cual sea su
tamaño..

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 El cariotipo humano se ordena en 8 grupos de cromosomas:

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Grupos cromosómicos Cromosomas Tipos de cromosomas

A 1,2,3 Metacéntricos grandes

B 4,5 Submetacêntricos grandes

C 6,7,8,9,10,11,12 Submetacéntricos medianos

D 13,14,15 Acrocéntricos grandes

E 16,17,18 Submetacéntricos pequeños

F 19,20 Metacentricos pequeños

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G 21,22 Acrocéntricos pequeños

- PATRÓN DE BANDAS G:
Es especialmente importante en el grupo C, debido a la gran similitud morfológica que
poseen algunos cromosomas.

4.3 AUTOMATIZACIÓN DEL ANÁLISIS CROMOSÓMICO:

La citogenética automatizada requiere la implantación de técnicas de análisis de imagen
(cariotipadores).

4.3.1 NOMENCLATURA CITOGENÉTICA Y FÓRMULA CROMOSÓMICA:

La fórmula cromosómica proporciona la descripción del cariotipo de un individuo.
Se especifica el número de cromosomas en una célula somática, seguida de una coma y el
número de cromosomas sexuales.
Se siguen las siguientes pautas:
● Sin anomalias:
- Se inicia con el número total de cromosomas, seguido de una coma.
- A continuación se especifican los cromosomas sexuales.
● Anomalías numéricas:
- Se refleja directamente en la fórmula.
- Si la anomalía numérica afecta a los autosomas, se informa a continuación de
los cromosomas sexuales, separada de ellos por una coma:
➔ Monosomías se señalan con el signo -
➔ Trisomías se señalan con el signo +

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 ● Anomalías estructurales:
- Las anomalías estructurales se informan a continuación de las numéricas.
- Las que afectan a un único cromosoma (deleción, duplicación, inversión,
cromosoma en anillo) se informa con la abreviatura de la alteración seguida
del número del cromosoma afectado entre paréntesis y de la banda o bandas
afectadas por la mutación también entre paréntesis.
- Las que afectan a dos cromosomas (translocaciones) se informan con la

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abreviatura de la alteración, seguida de los números de los cromosomas
afectados entre paréntesis y separados por un punto y coma, seguidos de los
puntos de rotura y reunión en cada cromosoma, entre paréntesis y separadas
por punto y coma los de cada cromosoma.
➔ Las translocaciones no recíprocas la abreviatura utilizada es “ins”, se
coloca primero el aceptor y después el donante (separados por punto
y coma).
➔ Las translocaciones recíprocas, el orden de los cromosomas es
primero los cromosomas sexuales (si están implicados) y los
autosomas de menor a mayor.

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● Mosaicismos:
Se inicia con la abreviatura “mos”, se describen todas las líneas celulares, empezando
por las anormales y terminando por la normal. Las líneas celulares se separan entre
sí por el signo /. Para conocer la proporción en la que se encuentra cada línea celular
se pone entre corchetes el número de metafases analizadas.

4.4 CARIOTIPO DE ALTA RESOLUCIÓN:

Se obtiene a partir de cromosomas en profase tardía o prometafase.
- Grado de condensación menor
- Número mayor de bandas.
- Aumenta la sensibilidad del cariotipo.
- Sincronización del cultivo de linfocitos:
➔ Bloqueo en fase S de las células proliferantes (metotrexato)
➔ Evolución sincronizada de las células bloqueadas en fase S.
- Añadido de colchicina. Para evitar la formación del huso acromático.
- Incubación. Garantiza la presencia de cromosomas en profase o prometafase.

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