Tecnicas-de-citogenetica.

pdf

Trigemina

Genética

1º Medicina

Facultad de Medicina
Universidad de Buenos Aires

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 Gracia po lee ! @trigemin <3

Técnicas de citogenética

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Se usan para ver los cromosomas, cantidad y estructuras de estos.
Al cariotipo se lo presenta primero con el número de cromosomas y luego con el par sexual; ej. ‘cariotipo
femenino 46, XX’.
Clasificación de cromosomas según posición de centrómeros:
- Metacentrico: el centrómero está en el centro.
- Submetacéntrico: el centrómero está desplazado.
- Acrocéntrico: el cromosoma está casi en el borde. En estos sus brazos cortos tienen una condensación y
tienen los organizadores nucelolares (genes codificantes de ARNr). Serían los del grupo D y G.
- Telocéntrico: no está en especie humana, el centrómero está en el extremo teniendo solo un brazo.
Clasificación según tamaño:
Los cromosomas van disminuyendo de tamaño conforme avanza el número;

Cromosomopatías: Reservados todos los derechos.

Son mutaciones grandes, que afectan y pueden ser visualizadas a nivel cromosómico mediante citogenética.
Patrón de bandeos:
Se tiñen los cromosomas con Giemsa, el cual se une a secuencias ricas en A-T y lo hace con distinta intensidad
dependiendo de la concentración de A-T. Esto permite identificar bandas en los distintos cromosomas.
Las bandas G+ son las ricas en A-T, se replican tardíamente y no tienen genes constitutivos.
Cariotipo con bandeo G
1- Se toma una muestra de sangre y se separan cels. Sanguíneas de linfocitos.
2- Se inyectan los linfocitos (cels q se usan para esto en gral) con un químico (mitógeno/FdeC) que hace q
salgan de G0, pasen el punto de restricción y entren en S, incitando su proliferación, y se los pone en un
ambiente favorable.
3- Se inyecta colchicina que inhibe polimerización microtúbulos, lo q detiene cels. en estado de metafase.
4- Se cambia el ambiente en el que están a uno con gran concentración de sal.
5- Luego este líquido con cels en metafase y mucha sal se lo spredea como gotas en vidrio, lo que hace que
explote la cel y libere los cromosomas.
6- Se tiñen con Giemsa y se ponen en portaobjetos para poder visualizarlo por microscopio.
7- Se ordenan los cromosomas por soft y se ven en computadora.

a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5183080
 Gracia po lee ! @trigemin <3

Para que un cromosoma pueda ser visto con un menor grado de resolución se pueden agregar enzimas que los
descompacten, permitiendo que se vean más bandas y un cromosoma más largo.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Aplicación: permite ver si hay anomalías numéricas de cromosomas, algunas modificaciones
(deleciones/duplicaciones) grandes de 3-5MB.
Siempre que se ve una alteración lleva a patología, ya que hablamos de tamaños grandes.

FISH (hibridación in situ por sonda fluorescente)

Reservados todos los derechos.

Puede realizarse en metafase o interfase. No se necesita q los cromosomas estén separados, se puede hacer en
la cel insitu.
1- Obtención y cultivo de la muestra.
2- Se toma una secuencia de ADN, sonda, a la cual se la hace fluorescente.
3- Se hace pretratamiento en el ADN de las cels y sondas para que se desnaturalice y puedan hibridarse.
4- Se da hibridación entre sonda por complementariedad de bases (razón técnica) con una zona específica
del cromosoma, haciendo que brille cuando el cromosoma está condensado.
5- Se lava para quitar las sondas que no se unieron.
6- Se visualiza en microscopio. Normalmente deberían verse 2 fluorescencias, ya que la región de la sonda
corresponde a una parte de un cromosoma, por ejemplo, y nosotros somos diploides. Si ve 1 banda o 3
ya hay problema.

si lees esto me debes un besito

a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5183080
 Gracia po lee ! @trigemin <3

Hay distintos tipos de sondas; dirigidas a centrómeros, regiones subteloméricas, locus específicos (si sospecho
de una mutación por un fenotipo) o sondas de cromosomas para identificar cada uno.
Aplicación:
Puede usarse para ver número de cromosomas, deleciones específicas, ver el sexo de un individuo, etc.
Detectan cambios de 104 a 106 pares de bases.
No necesita que esté en fase M la cel, por lo q es más práctica.
Desventajas:
No se pueden ver pequeñas mutaciones, como cambios de base, etc ya que la sonda al ser muy grande se

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
puede pegar igual. Lo que puede llevar a resultados falsos ya que se puede ver amplificación igual.
Multibanding fishing
Se usa fishing pero con un color distinto para cada banda, pareciendo un bandeo, permitiendo ver
reordenamientos, inversiones, deleciones grandes, etc.

MLPA (amplificación de PCR por multiplex)

Se usan sondas con un fluoroforo y, dependiendo del largo de la sonda, se pueden ver aberraciones en el
número de copias genómicas.

Reservados todos los derechos.

Se usan varios PCR al mismo tiempo y permite ver copias anormales de hasta 50 secuencias para evaluar un gen
largo enetero (usando 50 sondas distintas, con distinta longitud para poder visualizarlo dsps).
Aplicaciones:
Para detectar mutaciones, metilación, deleciones, duplicaciones, detectar variaciones en número de copias, etc.
Se usa en gral para cáncer y aneuploidías.
Método:

1- Hago sondas con homología de base para una secuencia específica de cada gen, a esta sonda la divido
en dos y le agrego una punta con fluorescencia la cual va ser de distinta longitud entre las distintas
sondas. Estas dos partes de la misma sonda están diseñadas para unirse a secuencias continuas.
2- Desnaturalizo la cadena de ADN que voy a evaluar.

si lees esto me debes un besito

a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5183080
 Gracia po lee ! @trigemin <3

3- Se hibrida la sonda con la secuencia de ADN, EN CASO DE ESTAR PRESENCIA LA SECUENCIA.

4- Uso una ligasa para unir las dos porciones de sonda entre sí y luego amplifico por PCR esta sonda.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
5- Si hay amplificación y puedo verla es porque la secuencia no fue deleteada. Si no veo amplificación es
porque no hubo ligamiento de las dos partes de la sonda, lo que una de las secuencias a la q se unía una
d las partes no está.
6- Luego estas 50 sondas distintas (o la cantidad q sean) se ordenan por tamaño (cada una corresponde a
una secuencia distinta) y se evalúan en un rango de amplificación, siendo 1 el valor normal y esperado.

Reservados todos los derechos.

normal

deleciones en 45-50
Los valores que dan corresponden a distintas mutaciones;

Aplicaciones:
Tiene alta sensibilidad y especificidad a microdeleciones/duplicaciones, es cmo hacer 50 fish a la vez.
Se pueden ver hasta 50 regiones en un solo estudio.

a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5183080
 Gracia po lee ! @trigemin <3

Micromatrices de ADN (array-CGH)

Array:
Un array es un conjunto de sondas conocidas fijadas ordenadamente en un soporte sólido. Estas pueden ser
clones de ADN, producto de PCR o sintéticas.
Así en el soporte puedo ordenar mediante impresoras los distintos conjuntos de sondas de cromosomas
distintos en una parte distinta. Luego puedo desnaturalizarlos e hibridarlos para amplificarlos o ponerles un
fluoróforo, así dsps en compu puedo analizarlos.
Fundamento:

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Comparación entre genoma de paciente y un control normal.

Reservados todos los derechos.

Método:
1- Se tiene un microarray dividido en cuadrantes correspondientes a cada cromosoma, y con distintas
secuencias del cromosoma en cada cuadrante.
2- Se toma una muestra de un paciente y se divide en secuencias su ADN, a las q se marca con un
fluoróforo verde. Se toma una muestra control y se divide en mismas secuencias y se marca con
fluoroforo rojo.
3- Se desnaturalizan las secuencias muestra y se las pone en el array para que puedan hibridarse a las
secuencias cromosómicas.
4- Se ilumina la placa y se pueden ver 3 cosas:
a. Si se ve amarillo es que se unieron ambas muestras en mismo porcentaje.
b. Si se ve verde es q predomina la muestra control, lo q implica q paciente tiene deleción. Si todo
el cuadrante es verde, hay una deleción de cromosoma, si es solo una de las secuencias del
cuadrante es deleción de secuencia.
c. Si se ve rojo es q predomina la muestra del paciente, lo q implica q paciente tiene duplicación.
Si todo el cuadrante es rojo (o la mayoría), hay una duplicación de cromosoma, si es solo una de
las secuencias del cuadrante es duplicación de secuencia.
Aplicación: esta permite ver secuencias chicas de entre 200-50 Kb. Permite ver falta o exceso de material, pero
no permite ver las balanceadas.

si lees esto me debes un besito

a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5183080
 Gracia po lee ! @trigemin <3

Desventajas:
Con esto no se pueden ver traslocaciones (alteraciones balanceadas), etc ya que no está ordenado. No se puede
saber el mecanismo de por qué sucedió la mutación ya que no sabemos si fue traslocada a otra parte o se
deleteó posta, etc.
Así esta técnica debería ser comparada con otras.
No siempre que se ve un color predominante lleva a patología ya que son secuencias muy chicas.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Reservados todos los derechos.

si lees esto me debes un besito

a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5183080