MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ADN

Protocolos de extracción de ácido desoxirribonucleico de un solo tubo

Durante los procedimientos de extracción de un solo paso, los agentes químicos o físicos logran la lisis de las
células, y el extracto obtenido se usa para genotipar sin ningún paso de purificación. La extracción indirecta se
logra mediante la precipitación selectiva de proteínas y otros contaminantes, o por quelación de sustancias
inorgánicas. Las ventajas de estos métodos son que son simples, rápidos, se pueden automatizar fácilmente
para obtener un alto rendimiento y, debido al número limitado de pasos, tienen menos posibilidades de
contaminación que los métodos de dos pasos.

FTA
Un método de un solo paso que no requiere un paso de purificación es la tarjeta FTA. A finales de la década de
1980, Lee Burgoyne, de la Universidad de Flinders en Australia, desarrolló el papel FTA como un método para
almacenar ADN (Burgoyne et al. 1994). FTA originalmente significaba "Fitzco/Flinder Technology Agreement“,
en la actualidad se refiere a “Flinders Technology Associates”.

El papel FTA es un papel absorbente a base de celulosa que contiene cuatro sustancias químicas que lisan las
células, desnaturalizan proteínas, previenen el crecimiento de bacterias y protegen al ADN de la oxidación y los
daños causados por radiación UV.

El uso de papel FTA simplemente implica agregar una mancha de sangre al papel y permitir que la mancha se
seque. Las células se lisan al contacto con el papel y el ADN de los leucocitos se inmoviliza dentro de la matriz
del papel. Posteriormente se toma un fragmento de papel de la mancha de sangre de la tarjeta FTA y se coloca
en un tubo para lavar. El ADN unido se puede purificar luego lavándolo con el reactivo de purificación FTA
(Whatman, Clifton, NJ) para eliminar la hemoglobina y otros inhibidores de la reacción de PCR. Esta purificación
del punzón de papel se puede ver visualmente porque a medida que se lava el papel, el color rojo de
hemoglobina se elimina con el sobrenadante. El punzón limpio se agrega directamente a la reacción de PCR. El
fragmento de papel FTA se agrega directamente a la reacción de PCR sin realizar los lavados, ya que los
sistemas de amplificación múltiplex cuentan con agentes que reducen la acción de inhibidores.

Las secciones de la tarjeta de FTA se eliminan con un punzón (generalmente de 1,2 mm o 2 mm de diámetro),
se agregan al reactivo de purificación de FTA, se mezclan y se incuban a temperatura ambiente durante 5
minutos; se pueden agregar uno o más discos perforados a la extracción. (b) El líquido se elimina y se
reemplaza con reactivo de purificación nuevo; Este proceso se repite dos o tres veces. (c) Los discos se lavan
dos o tres veces en TE (10 mm Tris-HCl, 0.1 mm EDTA, pH 8.0). (d) Finalmente, se retira el TE y los discos de
FTA, que contienen el ADN, se dejan secar a temperatura ambiente o con calor suave (aproximadamente 50 °
C). Los discos ahora se pueden agregar directamente a una reacción de PCR

Ventajas
 Barato y rápido de procesar
 Recolección simple: la preservación de los ácidos nucleicos de la degradación a temperatura ambiente
permite una recolección conveniente en el laboratorio o en el campo.
 Almacenamiento a temperatura ambiente: los ácidos nucleicos se conservan automáticamente sin
necesidad de refrigeración. El ADN almacenado en tarjetas FTA a temperatura ambiente durante más
de 17.5 años ha sido amplificado con éxito por PCR, 22 años para sangre y 12 de saliva.
 Automatizable: la automatización el fraccionamiento de los círculos de FTA para preparar fácilmente
para PCR en una variedad de instrumentos de manejo de líquidos.
Desventajas
 No se utiliza para indicios y huesos
SwabSolution kit
El kit SwabSolution ™ se usa para el procesamiento rápido de hisopos que se amplificarán utilizando los
sistemas STR PowerPlex. El kit SwabSolution ™ contiene el reactivo SwabSolution ™, que se utiliza para generar
un extracto de saliva en hisopo. El kit SwabSolution ™ también contiene el reactivo AmpSolution ™, que debe
agregarse a las amplificaciones con ciertos sistemas PowerPlex® cuando se realiza la amplificación directa de
ADN de los hisopos. Las funciones descritas que realiza este kit son lisar las células y desproteinizarlas para que
el ADN sea accesible, y así se pueda ampificar directamente la muestra, sin ningún proceso de purificación.

Algunas características positivas de este kit son:

• Proceso simple y rápido

• Es posible la cuantificación (QPCR)
• Hay algunos estudios que reportan que este kit sirve para procesar otro tipo de muestras como so
colilla, mascarilla, muestras de cabello, recortes de uñas y artículos manchados de sangre
• El ADN puede almacenarse a 4ºC hasta por 6 meses.

Chelex

Un procedimiento alternativo y económico para la extracción de ADN que se ha vuelto popular entre los
científicos forenses es el uso de una suspensión de resina quelante que se puede agregar directamente a la
muestra (por ejemplo, sangre, manchas de sangre o semen). Introducido en 1991 a la comunidad forense de
ADN, Chelex 100 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) es una resina de intercambio iónico que se agrega como
suspensión a las muestras (Walsh et al. 1991). El método Chelex de extracción de ADN es más rápido que el
método de extracción orgánica. Además, la extracción de Chelex implica menos pasos y, por lo tanto, menos
oportunidades para la contaminación de la muestra.

Chelex se compone de copolímeros de estireno divinilbenceno que contienen iones de iminodiacetato

apareados que actúan como grupos quelantes en la unión de iones metálicos polivalentes como el magnesio.

Los iones iminodiacetato actúan como grupos quelantes en la unión de iones metálicos polivalentes como el
magnesio. Al eliminar el magnesio de la reacción, se inactivan las nucleasas y protegen a las moléculas de ADN.

La resina quelante Chelex funciona en soluciones básicas, neutras y débilmente ácidas de pH 4 o superior.

La extracción Chelex 100 es rápida y fácil de realizar. (a) A la muestra se agrega a 1 ml de TE (1 mm EDTA, 10
mm Tris: pH 8.0) y se incuba a temperatura ambiente durante 10-15 minutos, para eliminar posibles
contaminantes e inhibidores. (b) El tubo se centrifuga a alta velocidad y se elimina el sobrenadante. (c) El
sedimento celular se resuspende en la solución Chelex® al 5%, el tubo se incuba a 56 ° C durante 15 minutos. La
proteinasa K, que digiere la mayoría de las proteínas celulares, y luego se coloca a 100ºC durante 8 minutos,
para asegurar que todas las células se hayan lisado y que la proteína se haya desnaturalizado.. El tubo se
centrifuga a alta velocidad durante 2-3 minutos para sedimentar detritos celulares. (d) El sobrenadante
contiene el ADN y puede usarse directamente en una PCR

La suspensión Chelex® 100 es alcalina, con un pH entre 9.0 y 11.0, y como resultado, el ADN que se aísla
usando este procedimiento es monocatenario.
Ventajas

 Se obtiene ADN de alto peso molecular

 Se pueden trabajar pequeñas cantidades de muestra
 Productos químicos no peligrosos utilizados

Desventajas

 Una de las principales desventajas de Chelex es que no es eficiente en la eliminación de

inhibidores.
 No es adecuado para el almacenamiento a largo plazo porque la resina pierde su
capacidad de unión con los iones metálicos.
 El ADN degradado no es adecuado para la extracción utilizando el método Chelex porque
el calentamiento puede causar interrupciones en el ADN degradado.

A selectivity series for cations in an acetate buffer system at pH 5 is:

Pd+2>Cu+2>>Fe+2>Ni+2>Pb+2>Mn+2>> Ca+2 = Mg+2 >>> Na+

The selectivity for various cations in aqueous solutions at pH 4 is:

Hg+2>Cu+2>Pb+2>>>Ni+2>Zn+2>Cd+2>Co+2>Fe+2> Mn+2>Ca+2>>>Na+

The selectivity at pH 9 in the presence of 1.5 M (NH4 ) 2 SO4 is: Co+2>Ni+2>Cd+2>Cu+2>Zn+2>Ca+2>>>Na

Proteinadas termoestables

El uso de proteinasas termoestables es otro método de extracción de un solo paso. Las proteinasas
termoestables son activas a altas temperaturas y, por lo tanto, pueden ser utilizadas para alterar las
membranas celulares en ausencia de detergentes o agentes reductores, ofreciendo un método de extracción
de ADN de un solo paso de varios tipos de muestras forenses. Las muestras se mantienen a 75 ° C con
proteinasa de Bacillus termofílica cepa EA1 durante 15 minutos seguido de 15 minutos a 96 ° C para inactivar la
proteinasa. Nucleases cuando se libera de las células se inactivan debido a la alta temperatura y luego son
hidrolizadas por el EA 1. La enzima EA1 ahora está disponible en ZyGEM, Hamilton, Nueva Zelanda, como la
familia de kits forensicGEM ™.

Se ha obtenido una extracción exitosa con este método de sangre, manchas de sangre en diferentes sustratos,
saliva, hisopos de botellas de cerveza, muestras de rastros táctiles y otros tejidos. 109) Sin embargo, las
muestras como colillas de cigarrillos y manchas de sangre en mezclilla negra no proporcionaron perfiles de STR
interpretables principalmente debido a la presencia de inhibidores.

Los kits de extracción de un tubo adicionales con soluciones de lisis patentadas también están disponibles
comercialmente. QuickExtract™ DNA Extraction Solution, MasterAmp™ Buccal Swab Kit Epicentre (Madison,
Wisconsin) y el kit de PCR Extract-N-Amp™ Blood PCR Kit de Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri) son ejemplos.
Extracción diferencial

La extracción diferencial fue descrita por primera vez en 1985 por Peter Gill y sus colegas (Gill et al. 1985). Este
método es utilizado comúnmente hoy por el Laboratorio del FBI y otros laboratorios forenses para separar las
fracciones masculinas y femeninas en casos de agresión sexual que contienen una mezcla de ADN. Al separar la
fracción masculina del perfil de ADN de la víctima, es mucho más fácil interpretar el perfil de ADN del autor en
un caso de violación.

Las muestras de evidencia de agresión sexual pueden contener mezclas de espermatozoides y células
epiteliales, provenientes del perpetrador y de la víctima respectivamente.

Este método utiliza las propiedades de las membranas de las células para poder realizar la separación. La
membrana de los espermatozoides es rica en proteínas con puentes disulfuros y el DTT rompe los puentes
disulfuro de proteínas que forman las membranas nucleares de los espermatozoides, mientras que las células
epiteliales puede ser lisadas utilizando solamente SDS y PK.

El procedimiento de extracción diferencial implica romper preferentemente las células epiteliales femeninas
con incubación en una mezcla de SDS (presencia de un detergente fuertemente aniónico (SDS), provoca la lisis
celular) / proteinasa K (degrada las proteínas al romper los enlaces peptídicos). Los núcleos de esperma se lisan
posteriormente mediante tratamiento con una mezcla de SDS / proteinasa K / ditiotreitol (DTT). El DTT rompe
los puentes disulfuro de proteínas que forman las membranas nucleares de los espermatozoides. La extracción
diferencial funciona porque los núcleos de esperma son impermeables a la digestión sin DTT.

Promega Corporation (Madison, WI) ha desarrollado un método automático Differex que implica el uso de
perlas magnéticas de ADN IQ para mantener el gránulo de esperma en su lugar, mientras que una solución de
separación mantiene el tampón de digestión y el ADN epitelial lejos del gránulo de esperma durante los pasos
de lavado (Knox & Olsen 2008). Se pueden procesar hasta 40 muestras en una placa de 96 pocillos en menos de
5 horas con Differex.

La extracción diferencial funciona bien en la mayoría de los casos de agresión sexual para separar las fracciones
masculinas y femeninas entre sí (Figura 2.5). Sin embargo, algunos perpetradores de agresiones sexuales han
tenido una vasectomía, en cuyo caso hay ausencia de espermatozoides. El semen azoospérmico, es decir, sin
células espermáticas, no puede separarse de la fracción femenina con extracción diferencial. En el caso de los
perpetradores azoospérmicos, el uso de marcadores específicos del cromosoma Y permite deducir los perfiles
de ADN masculino en presencia de exceso de ADN femenino.

Si no se separan las partes masculina y femenina de una muestra de agresión sexual, se obtiene una mezcla de
ambos, el perpetrador y la víctima.

Ventajas

 Resultados confiables debido a la separación de completa de las fracciones masculina y femenina.

 No requiere monitoreo visual.
 Automatizable

Desventajas

 Con muestras muy antiguas o dañadas se debe reducir tiempos de incubación.

  Procedimiento relativamente largo
 Se necesita concentración del perito

Otros enfoques

La Figura 2.6 compara varios otros enfoques para separar las células y / o ADN de la víctima y el autor en la
evidencia de agresión sexual. Se han desarrollado métodos para capturar directamente los espermatozoides,
incluida la microdisección por captura con láser (ver más abajo). Al separar físicamente las células de esperma
del perpetrador de las células epiteliales de la víctima, el ADN del perpetrador puede enriquecerse y aislarse
incluso de una vasta preponderancia de las células de la víctima. La digestión de las células epiteliales de la
víctima para tratar de aumentar el rendimiento del ADN del autor también ha tenido éxito (Gavin et al. 2009).

Microdisección de captura con láser

Las células de esperma se pueden capturar selectivamente usando un procedimiento clínico conocido como
microdisección de captura con láser (LCM), que se usa comúnmente para seleccionar células tumorales del
tejido circundante en portaobjetos de microscopio. Las células de esperma de la evidencia de agresión sexual
diseminadas en portaobjetos de microscopio se pueden recolectar con microdisección con captura láser para
realizar pruebas de STR confiables (Elliott et al. 2003, Sanders et al. 2006). Cuando se observan células
espermáticas en el campo de visión del microscopio, se activa un pequeño láser y se coloca una delgada
película de plástico sobre el portaobjetos en el punto específico de contacto con la luz láser para capturar o
encerrar la célula de interés. Al mover el portaobjetos del microscopio, se recogen docenas de células de
esperma en esta película delgada que se encuentra directamente encima de la muestra. La película de
recolección luego se transfiere a un tubo donde el ADN del esperma aislado se puede extraer y amplificar
usando la reacción en cadena de la polimerasa. Otros métodos de LCM catapultan las células identificadas
directamente en un tubo de recolección. Las células masculinas no espermáticas también se pueden detectar
con técnicas de hibridación fluorescente in situ (FISH) que permiten la captura selectiva de células masculinas
versus femeninas de una población de células mixtas (Anslinger et al. 2007). Si bien el uso de FISH y LCM
aumenta el costo del trabajo de casos forenses, estas técnicas clínicas pueden permitir la resolución de casos
especiales que de otro modo no serían posibles.

Se han publicado varios avances en el campo de la extracción diferencial. Una revisión reciente sobre la
biología, el desarrollo y la proteómica de los espermatozoides y el líquido seminal resume cómo estos avances
pueden mejorar los procedimientos de extracción diferencial. (139) Como es el caso con todos los materiales
probatorios, maximizando el rendimiento del ADN recuperado y minimizando la coextracción de inhibidores es
una alta prioridad. Un estudio interlaboratorio sobre comparaciones de protocolos en muestras de agresión
sexual demostró que el rendimiento de ADN masculino y femenino fue muy variable como se esperaba,
aunque sorprendentemente> 90% del ADN masculino presente en las muestras se perdió. (140) Recuperación
del material celular de los sustratos Es el primer paso crítico para maximizar el rendimiento. Las modificaciones
en el tampón de elución pueden dar lugar a mejoras en la recuperación. (141,142) La calidad y cantidad de
ADN se ve afectada aún más por las condiciones ambientales originales, así como las condiciones de
almacenamiento.

Varios estudios se han centrado en reducir la transferencia de ADN masculino a la fracción de células epiteliales
femeninas supuestamente debido a la lisis prematura de espermatozoides durante el paso de lisis de células
epiteliales. (16,142–144) Se han estudiado modificaciones a los procedimientos de extracción diferencial para
permitir la mejora de la separación mientras maximiza el rendimiento (139,145,146) Otros han dirigido sus
esfuerzos a la separación de los tipos de células antes de la lisis diferencial por filtración gravitacional,
centrífuga o al vacío. (139,142) Además de las actualizaciones descritas en la Sección 2.3.1, avances en
diferentes enfoques microfluídicos, (147 150) se ha publicado el uso de nuevos dispositivos de torunda de
nylon flocado, (151) y tecnologías de ciclo de presión para una extracción diferencial mejorada. (152)

CONCLUSIONES
 En la última década se han conseguido grandes avances en los métodos de extracción de ADN y la
química de amplificación por PCR para el análisis forense. Las mejoras en estos métodos han llevado a
una transición de los métodos orgánicos tradicionales a métodos simplificados y automatizados. De
hecho, las aplicaciones de PCR directas donde no se requiere extracción de ADN se están
implementando en todo el mundo.
 Las técnicas de extracción se adaptan más fácilmente a la automatización y esto ha llevado a una
expansión de plataformas de extracción de ADN semi y totalmente automatizadas con equipos
robotizados. Con esto es posible procesar casi todos los tipos de muestras de evidencia biológica que
contienen pequeñas cantidades de muestra.
 Los nuevos métodos para las extracciones diferenciales también han conducido a una mejor separación
y análisis de muestras de agresión sexual.
 Se han desarrollado métodos que pueden extraer simultáneamente ácidos nucleicos totales (ADN y
ARN) debido en gran parte a la relativamente nueva identificación de fluidos corporales basada en
ARN, fuente de origen de tejido y ensayos de estimación de edad que se han desarrollado utilizando
perfiles de ARNm (55). , 56) El mismo extracto se puede usar para aplicaciones basadas en ARN y ADN
(91) incluyendo perfiles de STR; métodos de metilación epigenética relativamente nuevos (153-156) y
métodos informativos de identidad, fenotipo y ascendencia.