Análisis INSTRUMENTAL

MANUAL DE LABORATORIO
Química y Farmacia
REGLAMENTO DEL LABORATORIO

1. El alumno deberá presentarse puntualmente a la hora de inicio del laboratorio.

2. Durante el desarrollo del práctico, es obligatorio el uso del delantal y gafas de
seguridad.
3. Como norma de seguridad, los alumnos dejarán sus pertenencias en los
casilleros con candado que se encuentran en el exterior del laboratorio. Por
ningún moti vo dentro del laboratorio o sobre los mesones de trabajo.
4. Frente al uso de algún reacti vo, el alumno debe tomar las precauciones
indicadas por el profesor y/o ayudante, como asimismo las señaladas por el
fabricante. Ante cualquier duda, más vale preguntar.
5. Se dispondrá de recipientes para los desechos. ÚSELOS
6. Se recomienda el uso del cuaderno de laboratorio ya que le ayudará a recopilar
toda la información realizada en el laboratorio para posteriormente elaborar el
informe que se entregará la semana siguiente al laboratorio, el cual será
evaluado.
7. La no entrega oportuna del informe será califi cada con la nota mínima.
8. Evaluaciones y ponderaciones se detallan a conti nuación:

Tipo de Evaluación Ponderación Ponderación NP

Controles Laboratorio 60%

30%
Informes Laboratorio 40%

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ELABORACIÓN DE LOS INFORMES

1. Portada
 Nombre de la acti vidad de Laboratorio.
 Nombre de los autores y número de grupo de trabajo.
2. Resumen
 Párrafo breve que describe lo más relevante del trabajo prácti co.
3. Introducción

 Corresponde al fundamento teórico en que se basa el trabajo realizado en el

laboratorio. Incluya las expresiones (numerar cada una de ellas) que dan
cuenta de las propiedades fi sicoquímicas que se trabajan de forma
experimental. Al fi nalizar esta sección se debe enumerar los objeti vos
propuestos para el experimento que realizó en el laboratorio.

4. Parte Experimental: Incluya los siguientes aspectos:

 Materiales y reactivos uti lizados: dar los nombres de todos los materiales y
reactivos con su concentración uti lizados para realizar el experimento.
 Datos experimentales: presentar todos los datos recopilados durante el
desarrollo del laboratorio.
5. Resultados
 Presentación de datos: tablas, fi guras, gráficos, etc. No olvidar enumerar y
nombrar.
 Cálculos, ejemplos de cálculos y tratamiento de error. Hacer referencia a las
expresiones matemáti cas.
 Debe incluir las ecuaciones químicas de las reacciones del análisis, así como
también las ecuaciones algebraicas que muestren como se calcularon los
resultados.
6. Discusión
 Evaluar los resultados obtenidos y discuti rlos con base en datos encontrados
en literatura. Estas refl exiones deben ser apoyadas por bibliografí a. Debe dar
una opinión de lo logrado y de lo no logrado, justi fi cando en cada caso en
base a los fundamentos teóricos.
7. Conclusión
 Escribir claramente las conclusiones, en forma detallada, que se obti enen a
partir de la experiencia realizada en base a los objeti vos del trabajo práctico.
8. Bibliografí a: Colocar toda la bibliografí a consultada en formato Vancouver.

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Laboratorio 1

Determinación potenciométrica de la concentración en una disolución de H 3PO4.

Objetivos
1. Conocer algunos conceptos teóricos, procedimientos y lenguaje para la medición de
pH.
2. Aprender el uso, cuidado y calibración de un electrodo medidor de pH.
3. Construir una curva de ti tulación experimental para la determinación de la
concentración de H 3 PO 4 , por valoración potenciométrica.

Introducción
Los métodos potenciométricos de análisis se basan en las medidas del potencial de las
celdas electroquímicas en ausencia de corrientes apreciables. Desde hace mucho
tiempo las técnicas potenciométricas se han uti lizado para la detección de puntos
finales en métodos volumétricos de análisis.
El equipo requerido para los métodos potenciométricos incluye un electrodo de
referencia, un electrodo indicador y un dispositi vo para medir el potencial.
En una valoración (o ti tulación) potenciométrica el potencial de un electrodo indicador
adecuado se puede uti lizar para establecer el punto de equivalencia de una valoración.
En este caso se mide el potencial de un electrodo indicador adecuado en función del
volumen de ti tulante. El punto final potenciométrico es ampliamente aplicable y
proporciona datos más precisos que los métodos que utilizan indicadores. Este tipo de
valoraciones es muy útil en la valoración de soluciones coloreadas, turbias y para
detectar la presencia de especies insospechadas en solución.
La utilidad del pH como una medida de la acidez o basicidad de un medio acuoso y la
amplia disponibilidad de electrodos indicadores de pH (electrodos de vidrio), han
hecho que las medidas potenciométricas sean una de las medidas más uti lizadas en el
análisis químico.
Las valoraciones potenciométricas presentan ventajas como la obtención de datos más
confi ables que los obtenidos en las ti tulaciones tradicionales uti lizando indicadores
químicos. Además, al basarse en el volumen de ti tulante agregado que provoca un
cambio rápido en el potencial cerca del punto de equivalencia, estas no dependen de
los valores absolutos de E celd a . Una desventaja que presentan las valoraciones
potenciométricas manuales es el mayor consumo de tiempo que aquellas que
involucran indicadores.

En la figura 1 se observa un sistema tradicional de valoración potenciométrica manual. En donde

se registra el potencial de la celda en milivolts o pH.

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 Figura 1. Equipo valoración potenciométrica.

Parte experimental

Materiales y reactivos
 Bureta graduada de 50 mL
 pH metro
 Placa Agitadora
 Barra magnética
 Probeta graduada de 100 mL
 3 vasos de precipitado de 150 mL
 Piseta con agua desionizada
 Solución de NaOH 0.10 mol/L, estandarizada previamente
 Muestra problema (H 3 PO 4 )

Procedimiento experimental

Parte A: Determinación potenciométrica de la concentración en una disolución de

H 3 PO
1.
Mida exactamente 5 mL de H 3 PO 4 y viértala en un matraz de 50 mL, lleve con agua
desionizada al volumen total.
2.
Tome una alícuota de 10 mL de la solución preparada y viértala en el vaso
precipitado de 100 mL. Añada 75 mL de agua desionizada. Introduzca la barra
magnética e instale el vaso sobre el agitador magnéti co. Agite suavemente.
Sumerja el electrodo en la solución.

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3.
Anote el pH inicial. Valore con la solución de NaOH que se halla en la bureta
graduada adicionando 0.5 mL cada vez, anote el valor de pH después de cada
adición. Conti núe hasta pH 12. Tabule volumen de NaOH versus pH.
4.
Grafi que pH versus Volumen (en mL) de solución de NaOH y determine en forma
aproximada el punto de equivalencia de la solución.
5.
Repita la valoración, reduciendo el volumen de las alícuotas a 0 .2 mL en las
cercanías del punto de equivalencia (1 o 2 mL antes y después de la zona de
infl exión de la curva). Repita 1 vez más.
6.
Construya una tabla que incluya: pH/V (Volumen de NaOH (mL))
7.
Grafi que cada conjunto de datos versus volumen de NaOH agregado.
8.
Calcule el volumen fi nal (punto final) para la muestra.
9.
Determine gráfi camente el volumen del punto final. Gráfi co 2º derivada.
10.
Con todos los datos obtenidos calcular la concentración del ácido problema en:
g de ácido fosfórico en los 100 mL de solución.
11.
Calcule el valor de pKa 1 , Ka 1 , pKa 2 y Ka 2 del H 3 PO 4.
12.
Establezca los equilibrios involucrados.,

Recuerde el correcto uso de cifras significativas y tratamiento de datos

estadísticos (promedio, desviación estándar, entre otros).

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Laboratorio 2

Determinación de paracetamol por Espectrofotometría de Absorción Molecular

Ultravioleta-Visible

Objetivos
1. Conocer la instrumentación y el manejo de un espectrofotómetro.
2. Obtener, interpretar y calcular el rango de concentraciones de trabajo en un
espectro.
3. Utilizar métodos de cuanti fi cación por curva de calibración y de adición estándar.

Introducción
La espectrofotometría, se utiliza a menudo como método de análisis (Figura 1).
La radiación electromagnéti ca se puede considerar como una forma de energía radiante
que se propaga como onda transversal con un movimiento ondulatorio. La distancia
entre las ondas se describe en términos de longitud de onda (). La región ultravioleta-
visible es una parte muy pequeña del espectro electromagnéti co y se extiende desde el
ultravioleta cercano (195 – 400 nm) y el visible (400 – 780 nm)

Figura 1. Componentes principales de un espectrofotómetro de ultravioleta visible.

La canti dad de radiación absorbida por una especie química se puede relacionar con la
concentración de la sustancia que se analiza, mediante la Ley de Beer:

𝐴=𝐶×𝑏×𝑘
Donde:
A = absorbancia
C = concentración del analito
b = el paso óptico
k = la constante de proporcionalidad.

La constante de proporcionalidad k se denomina absorti vidad (a) si la concentración de

la sustancia a analizar se expresa en gramos/litro y absorti vidad molar () si la
concentración del analito se expresa en mol/litro.
Es posible realizar cálculos cuanti tati vos cuando dos especies absorbentes de la
solución tienen espectros que se superponen. De acuerdo con la ley de Beer, la
absorbancia total de una mezcla a determinada longitud de onda será igual a la suma de

7
las absorbancias individuales de las especies que absorben.

En la mayoría de los análisis químicos se mide la respuesta del procedimiento analítico

a canti dades conocidas de analito (llamadas patrones o estándares) y basándose en
ellas se puede interpretar la respuesta a una muestra de contenido desconocido. Para
este fin se prepara una curva de calibrado, que es un gráfico que muestra la respuesta
de un método analíti co en función de canti dades conocidas de analito.
Las disoluciones que conti enen concentraciones conocidas de analito se llaman
disoluciones patrón o estándar. Las disoluciones que conti enen todos los reactivos y
disolventes usados en el análisis, pero sin analito, se llaman disoluciones blanco o
simplemente blancos. Los blancos miden la respuesta del procedimiento analíti co a las
impurezas o especies interferentes que existan en los reactivos.
La curva de calibrado descrita, que se construye obteniendo la respuesta del método
frente a soluciones de analito exactamente conocidas y crecientes, se denomina curva
de calibración de patrón externo. Para determinar la concentración de analito en una
muestra problema se grafica directamente “señal vs concentración de analito”. Es
deseable que la señal de la muestra problema se encuentre en la zona lineal de la curva.

Señal

Zona Lineal

Concentración
Figura 1. Curva de calibrado de patrón externo

El método de adición patrón consiste en añadir cantidades conocidas de analito a la muestra

problema, cuyo contenido en analito se quiere determinar. A partir del aumento de señal se
deduce cuánto analito hay en la muestra problema. Este método requiere una respuesta lineal
frente al analito.
Este método es especialmente apropiado cuando la composición de la muestra es
desconocida o compleja y afecta a la señal analíti ca. La matriz es todo lo que hay en la
muestra problema además del analito. Se define como efecto de matriz el cambio que
experimenta una señal analíti ca por todo lo que hay en la muestra además del analito.
La composición de la matriz afecta la magnitud de la señal analíti ca. Puede ser que la
matriz contenga componentes desconocidos que, como tales es imposible incluir en las
disoluciones patrón al construir la curva de calibrado. Si se agrega un volumen pequeño
de solución concentrada de patrón a una muestra desconocida, no varía
signifi cati vamente la concentración de la matriz, esto debido a que la matriz ejerce el
mismo efecto sobre el mismo analito añadido que sobre el que hay en la muestra
problema.

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 Señal

Señal de la muestra
sin patrón añadido

Volumen de patrón añadido

Figura 2. Curva de calibrado de adición estándar o patrón

Así, para determinar la concentración del analito en la muestra problema se puede

utilizar el gráfico anterior donde se gráfica directamente la señal vs el volumen añadido
de disolución estándar:

La concentración buscada para la muestra es:

𝐶𝑥 = 𝛼 × 𝐶𝑠𝑡
𝛽 × 𝑉𝑥
Donde:
 = intercepto
CSt = concentración del estándar
 = pendiente
VX = volumen añadido de la muestra (mL)

La estructura química del acetaminofeno, paracetamol, es:

Parte experimental

Materiales y Reactivos
 Equipo espectrofotómetro UV-Visible
 Cubeta de 1 cm de paso óptico
 Matraces aforados de 25 mL
 Pipetas aforadas de 5 y 10 mL
 Propipeta
 Piseta con agua desionizada
 Estándar de paracetamol

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Procedimiento experimental

Espectro de absorción de una solución de Paracetamol

1. Determine la canti dad necesaria para preparar 100 mL de una solución patrón de
Paracetamol por pesada.
2. Realizar un barrido automáti co de longitudes de onda entre 190-400 nm para la
solución patrón. Menú barrido.
3. Observar el espectro obtenido en el espectrofotómetro.
4. Establecer la longitud de onda de máxima absorbancia en su equipo.
5. Con los datos obtenidos de A para la solución de Paracetamol, calcular los rangos
de concentración para preparar una curva de calibración en la zona de menor
error (20 y 70% T).
6. Diseñar un esquema de dilución para preparar 5 puntos para la curva de
calibración en matraces de 25 mL.

Ley de Beer: Curva de calibración

Se va a comprobar si las sustancias bajo estudio obedecen la Ley de Beer al graficar la

absorbancia vs concentración, para una serie de soluciones con diferentes
concentraciones conocidas. El ancho de la cubeta (1 cm) y la longitud de onda se
manti enen constantes. Prepare las soluciones previamente determinadas.
1. Ajuste el 0 de absorbancia colocando blanco en el haz de medición.
2. Medir A (%T) para cada una de las soluciones preparadas anteriormente.
3. Registrar los datos de A vs C en una tabla confeccionada en su cuaderno.
4. Graficar y calcular la ecuación de la recta por ajuste de mínimos cuadrados.
Determinar el coeficiente de correlación.
5. Preparar la muestra problema en forma similar a las soluciones estándares.
6. Medir la A de la muestra problema en forma inmediata.
7. Calcular la concentración de la muestra recibida, considerando la dilución
efectuada.

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Laboratorio 3

Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). Determinación de Teofilina

(Metil Xantina)

Objetivos
1. Conocer y manejar un equipo HPLC.
2. Determinar el contenido de Teofi lina o Ibuprofeno en una muestra problema.

Introducción
La cromatografí a de líquidos es una técnica que permite separar fí sicamente, identi fi car
y cuanti fi car los disti ntos componentes de una mezcla. La separación está basada en la
distribución y afinidad de los componentes de la mezcla en dos fases, una estacionaria
(fase estacionaria) y otra que se mueve (fase móvil).
La fase móvil es una sustancia líquida que tiene la función de ser el acarreador y
diluyente de los analitos que se van a analizar, la muestra, so luto o analito, es el
compuesto o mezcla de compuestos que se desean separar y analizar y la fase
estacionaria es el material que conti ene la columna, en donde, gracias a su forma
geométrica, grupo funcional, tamaño e interacciones con el analito en la fas e móvil
se lleva a cabo la separación de los analitos.
Los mecanismos de separación de los componentes de una muestra problema se basan
en establecer un equilibrio entre la fase estacionaria y la fase móvil. Cuánto más
interactúe con la fase estacionaria, más lentamente se moverá a través de la columna.
En la HPLC isocráti ca el compuesto pasa por la columna cromatográfi ca a través de la
fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partí culas redondeadas con
ciertas característi cas químicas en su superfi cie) mediante el bombeo de líquido ( fase
móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en
pequeñas canti dades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de
las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por
la columna.
El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del
compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El ti empo que
tarda un compuesto para ser eluído de la columna se denomina ti empo de retención
estándar y se considera una propiedad identi fi cati va característi ca de un compuesto
en una determinada fase móvil y estacionaria. La uti lización de presión en este tipo de
cromatografí as incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la columna y
reduce así su difusión dentro de la columna mejor ando la resolución de la
cromatografí a. Los disolventes más uti lizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo.
El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el ácido trifl uoroacéti co,
que ayudan a la separación de los compuestos.
Un estándar interno (IS) es una sustancia que se añade a todas las muestras en una
canti dad constante. La calibración supone representar la razón entre la señal del
analito y la del estándar interno como una función de la concentración del analito.
El interno puede compensar disti ntos tipos de errores indeterminados y sistemáti cos. Si
el IS y el analito responden proporcionalmente a los errores instrumentales y
fl uctuaciones del método, la razón entre las señales es independiente de las
fl uctuaciones.

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La mayor dificultad es encontrar un IS adecuado, con señal reproducible y que genere una señal
similar a la del analito.

Figura 1. Componentes básicos de un HPLC. Extraída Fundamentos de Química Analitica

(Cortesía de PerkinElmer, Inc., Waltham, MA.).

Curva de calibración con patrón interno

Un patrón interno es un compuesto, diferente del analito, que se agrega en canti dad
conocida y constante a la muestra y a los patrones. La señal del analito se compara con
las del patrón interno para determinar la canti dad de analito presente en la muestra.
La aplicación sati sfactoria de una calibración con estándar externo o del método de
adición de patrón depende de la capacidad del analista para manipular de forma
reproducible las muestras y los patrones. Cuando no es posible controlar un
procedimiento para que todas las muestras y patrones reciban el mismo procedimiento
se ven afectadas la exacti tud y la precisión de las medidas.
Los patrones internos son especialmente útiles cuando la cantidad de muestra analizada o la
respuesta del instrumento varían algo de experiencia a experiencia, por razones que son difíciles
de controlar. Una curva de calibración sólo es válida si se mantiene el conjunto de condiciones
como se obtuvo.
Los patrones internos son muy utilizados en cromatografía debido a que la pequeña cantidad de
muestra que se introduce en el cromatógrafo no es muy reproducible en algunos experimentos.
También son útiles cuando se pueden dar pérdidas de muestra durante la preparación de la
muestra antes del análisis (etapa pre – analítica). Si se agrega una cantidad conocida de patrón
interno a la muestra antes de cualquier tratamiento, la relación patrón interno a analito se
mantiene constante, ya que se pierde la misma fracción de ambos en cualquier operación.
Si una disolución conti ene un analito a una concentración C A y un patrón interno a una
concentración C PI , la señal producida por el analito, S A , y la producida por el patrón
interno, SPI, se relacionará el cociente de la señal del analito con la señal del patrón interno en
función de la concentración del analito.

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 Figura 1. Curva de calibrado patrón interno.

Parte experimental

Materiales y reactivos:
 Cromatografo HPLC
 Fase móvil (30:70 = Metanol:Agua)
 Patrón de Teofi lina
 Patrón de Teobromina (Estándar interno)
 Metanol Calidad HPLC
 Agua Milli-Q o Nanopure
 Matraces aforados 50 mL
 Jeringuilla de 25 μL
 Muestra problema de Teofi lina

Procedimiento experimental

Determinación de la concentración de Teofilina o Ibuprofeno en una muestra problema

Trabajando con una fase móvil isocráti ca (30:70 = Metanol:Agua), a un flujo de 1
mL/min y uti lizando una longitud de onda de detección de 260 nm, se determinará la
concentración de teofi lina en una muestra problema, uti lizando el método de
estándar interno (10 ppm de teobromina), por interpolación en una curva de
calibración, previamente medida usando patrones de teofi lina de 5, 10, 15, 20 y 25
ppm.

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Influencia del flujo de fase móvil
Trabajando con el patrón de 10 ppm de teofi lina, una fase móvil isocrática (30:70 =
Metanol:Agua) y uti lizando una longitud de onda de detección de 260 nm, estudiar
los siguientes fl ujos de fase móvil:

Flujo mL/min
0.6
0.8
1.0

1. Analice como influyen los flujos de fase móvil sobre los ti empos de retención y
la resolución de las señales cromatográfi cas.
2. Calcular la resolución de las señales y la selectividad en cada flujo.
3. Determine el número de platos teóricos promedio y la altura de los platos de la
columna cromatográfi ca.
4. ¿Qué condiciones debe cumplir una fase móvil?

Recuerde el correcto uso de cifras significativas y tratamiento de datos

estadísticos (promedio, desviación estándar, entre otros).

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