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Fundamentos del Estudio y la Experimentación en Biologí

1º Grado en Biología

Facultad de Ciencias
Universidad de Córdoba

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
DETERMINACIÓN DE

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ANTIOXIDANTES
TOTALES
HIDROSOLUBLES EN
SEMILLAS DE PIMIENTA

Fundamentos del Estudio y la Experimentación en Biología

GRADO DE BIOLOGÍA Facultad de Ciencias Universidad de Córdoba

Autor: Inés Isabel Rojas de León Fecha: 11/11/2017

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 ÍNDICE

1. Antecedentes Página 3

2. Objetivos Página 3

3. Materiales Página 4
3.1 Material biológico
3.2 Reactivos y soluciones

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
3.3 Aparatos y equipos

4. Métodos Páginas 4 y 5
4.1 Obtención del extracto de semillas de pimienta
4.2 Preparación del reactivo fosfomolíbdico
4.3 Desarrollo de ensayo de determinación de antioxidantes
4.4 Cálculos de la capacidad antioxidante

5. Resultados Páginas 6 y 7

6. Discusión Página 8

7. Conclusiones Página 8

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8. Bibliografía Página 8

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 1. Antecedentes
Las plantas, al ser organismos vivos, generan espontáneamente especies químicas muy reactivas
procedentes fundamentalmente del metabolismo del oxígeno y, en menor medida, del nitrógeno.
Algunas de estas especies son imprescindibles para el mantenimiento normal del metabolismo;
pero sus niveles no pueden ser elevados o tendrán efectos nocivos.
Las plantas están expuestas a la acción de agentes oxidantes externos. Como respuesta a la
presencia de estas especies reactivas, de origen interno o externo, las plantas se defienden con
sistemas enzimáticos y no enzimáticos. Dentro de estos últimos se encuentran los antioxidantes: el

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ácido ascórbico (vitamina C), los tocoferoles (vitamina E), el glutatión, los carotenoides y los
compuestos fenólicos.
Aparte de sus funciones biológicas naturales, los compuestos antioxidantes de origen vegetal
presentan grandes aplicaciones en el mundo de la alimentación, la medicina y la cosmética. El
auge en los proyectos de búsqueda de nuevos antioxidantes naturales ha servido de acicate para
el desarrollado de numerosos métodos de determinación de la capacidad antioxidante tanto de
sustancias puras como de mezclas complejas como los extractos de plantas.
Existe una multitud de métodos de terminación de antioxidantes. En la práctica se ensayó un
método espectrofotométrico, basado en la formación de un complejo coloreado (verde azulado)
de fosfato y molibdeno (V).

El fundamento del método radica en la capacidad de los antioxidantes de reducir el molibdeno

(VI) a molibdeno (V), el cual, en presencia de fosfato a pH ácido, formó un complejo

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fosfomolíbdico de color azul cuyo espectro de absorción presentó un máximo a 695 nm.
Este método debe seguir la siguiente reacción:

Antioxidante (red) + fosfato + Mo(VI) + H+ → Antioxidante (ox) + complejo fosfato/Mo(V)

(color azul)

Se tiene una mezcla de reactivo fosfomolíbidico y la muestra con antioxidantes, las moléculas
de antioxidante, que son compuestos reductores, reaccionan con el Mo (VI) y lo reducen a
Mo(V), al tiempo que ellos se oxidan.
Una vez transcurrida la reacción, se mide la absorbancia en el azul (a 695 nm), que será
proporcional a la cantidad de antioxidantes presentes en la muestra, esto se denomina capacidad
antioxidante.

Para la calibración del método se empleó un antioxidante conocido: el ácido ascórbico, de modo
que la cantidad de antioxidantes hidrosolubles totales, o sea la capacidad antioxidante
hidrosoluble total (CAH) se expresa en equivalentes de ácido ascórbico.

2. Objetivos
Objetivo general:
• Determinación de antioxidantes totales hidrosolubles en semillas de pimienta.

Objetivos específicos:
• Obtención del extracto de semillas de pimienta
• Preparación del reactivo fosfomolíbdico
• Desarrollo de ensayos de determinación de antioxidantes
• Cálculo de la capacidad antioxidante

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 3. Materiales

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3.1 Material biológico

Se emplearon semillas de pimienta como material biológico.

3.2 Reactivos y soluciones

Se emplearon los siguientes reactivos químicos: ácido sulfúrico, fosfato sódico, molibdato
amónico, una solución de ácido ascórbico y agua destilada.

3.3 Aparatos y equipos

Los aparatos y equipos que se emplearon fueron: un mortero, pipetas, una balanza, la microfuga, un
bloque térmico, un espectrofotómetro, cubetas de espectrofotómetro de 1 ml, tubos Eppendorf y un

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recipiente con hielo picado.

4. Métodos
El método que se sigue en el método espectrofotométrico, siguiendo los siguientes procedimientos:

4.1 Obtención del extracto de semillas de pimienta

En primer lugar, se pesa un gramo de semillas de pimienta, a continuación, se prepara un

mortero en el cual se añaden las semillas y 4 ml de agua destilada. Se trituran pero sin
machacarlas, teniendo precaución para que no salten del mortero. Se sigue triturando hasta que
se obtenga una suspensión homogénea. Seguidamente, se transfieren las semillas trituradas a un
tubo de ensayo donde se remueven para homogeneizar la suspensión y lo dejamos en hielo
durante unos 5 minutos. Cuando transcurrieron esos 5 minutos, se homogeneiza la muestra una
última vez y se recoge 1ml en un tubo de Eppendorf. Seguidamente, se centrifuga la muestra a
la máxima velocidad de la microfuga durante 5 minutos. Por último, el sobrenadante se recoge
con cuidado con una pipeta y se pasa a un tubo Eppendorf limpio, que se mantiene en frío sobre
hielo hasta su uso.

4.2 Preparación del reactivo fosfomolíbdico

Las soluciones que se necesitan para preparar el reactivo fosfomolíbdico (que es una mezcla de
ácido sulfúrico, fosfato monosódico y molibdato amónico) son las siguientes: ácido sulfúrico
(H2SO4 3 M), agua, fosfato sódico (NaH2PO4. 2H2O 160 mM) y molibdato amónico (Mo7O24 (NH4)6
.4H2O 20 mM), para cuando se usen, se prepare una mezcla en la proporción 1:2:1:1 (v:v:v:v), se
emplea 1ml de reactivo fosfomolíbdico en cada ensayo y se debe tener en cuenta el número de
ensayos que se realizaron.

4.3 Desarrollo de ensayos de determinación de antioxidantes

Una vez obtenidos los extractos de semillas se procede a la determinación de antioxidantes totales
hidrosolubles (CAH), primeramente, se marca 4 tubos Eppendorf con las siguientes etiquetas: tres
CAHP, que es la muestra para la determinación de la capacidad antioxidante hidrosoluble total de
pimienta y uno Blanco, que sirvió para la determinación de la capacidad antioxidante hidrosoluble
total.

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 Se hicieron determinaciones de la muestra problema por triplicado: CAHP1, CAHP2 y CAHP3.
Por tanto, se etiquetaron lo tubos de la muestra de pimienta como CAHP1, CAHP2, CAHP3.
Después en dichos tubos Eppendorf se preparan las mezclas siguientes:
En los tubos CAHP1, CHP2 y CHP3 se mezclan 0,95 ml de reactivo fosfomolíbdico y 0,05 ml de
extracto acuoso de pimienta. A diferencia del tubo Blanco-CAHP que se mezclan 0,95 ml de
reactivo fosfomolíbdico y 0,05 ml de agua.
Cuando se tengan preparadas las mezclas, los tubos se cierran y se voltean para homogeneizar bien
el contenido. Luego se incuban las reacciones en un bloque térmico a 65 ºC durante 30 minutos,
una vez transcurrido el tiempo de reacción, se sacan los tubos y se dejan enfriar a temperatura

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ambiente.
En último lugar, se mide la absorbancia en 695 nm de las muestras CAHP1, CAHP2 y CAHP3
después de hacer cero en el espectrofotómetro con el blanco-CAHP.

4.4 Cálculo de la capacidad antioxidante

La determinación de la capacidad antioxidantes hidrosoluble requiere la elaboración de una recta de

calibrado.

Recta de calibrado para determinar la capacidad antioxidante hidrosoluble total

Primero se preparan y se tratan con el reactivo fosfomolíbdico una serie de soluciones de

concentración conocida de ácido ascórbico, tal como se muestran en la siguiente tabla.

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Tabla 1. Recta de calibrado para CAH.

Tubo nº. REACTIVOS (ml)

Ácido ascórbico (7 mM) Agua Reactivo fosfomolíbdico

Blanco 0,00 0,05 0,95
CAH1 0,01 0,04 0,95
CAH2 0,02 0,03 0,95
CAH3 0,03 0,02 0,95
CAH4 0,04 0,01 0,95
CAH5 0,05 0,00 0,95

Las muestras patrón CAH1, CAH2, CAH3, CAH4 y CAH5 contendrán 70, 140, 210, 280 y 350
nmoles de ácido ascórbico, respectivamente en 1 ml del volumen total de la reacción.
Se incuban las reacciones en un bloque térmico a 65 ºC durante unos 30 minutos. Una vez
transcurrido el tiempo de reacción, se sacan los tubos y se dejan enfriar a temperatura ambiente.
Después se mide la absorbancia a 695 nm de los tubos 1 a 5 frente al blanco, a continuación, se
calcula la recta de regresión correspondiente a los datos, representando nanomoles de ascorbato
frente a A695 nm, seguidamente se determina el valor de la pendiente de la recta, o factor de
calibración, Fh. Por último, se aplica una fórmula para obtener la concentración de antioxidantes
totales en las muestras de semilla. Dicha fórmula es:
CAH (nmoles ascorbato/g peso fresco) = (A695 x Fh x Ve/Vm)/Pf

Donde: A695 = Absorbancia a 695 nm

Fh = Factor de relación entre nmoles de ascórbico y A695 nm (pendiente de la recta de
calibrado)
Ve = Volumen total del extracto (el volumen total del extracto acuoso de semillas es 4 ml)
Vm = Volumen de la muestra (volumen de extracto usado en el ensayo, esto es 0,05 ml).
Pf = Peso fresco del tejido vegetal (peso de las semillas usadas en la extracción, esto es 1g).

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 5. Resultados
Partiendo de 1 gramo de semillas de pimienta, se siguió el procedimiento de extracción y
determinación descrito en el protocolo, obteniéndose así los siguientes resultados:

Tabla 2: Valores de absorbancia semillas de pimienta

Muestra Absorbancia a 695 nm
CAHP1 0,72
CAHP2 0,73

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
CAHP3 0,71

Los valores de absorbancia a 695 nm de las muestras patrón, cuya concentración de ácido ascórbico
es conocida se reflejan en la siguiente tabla:

Tabla 3: Valores de absorbancia y concentración de ascórbico muestra patrón

Nanomoles de ácido ascórbico
Muestra patrón Absorbancia a 695 nm
(nmol)
CAH1 70 0,37
CAH2 140 0,728

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CAH3 210 1,187
CAH4 280 1,56
CAH5 350 2,301

Para poder cuantificar y observar los resultados de una manera más sencilla y visual se
construye una recta de calibrado cuyos datos se muestran en la tabla 1.

400
Nanomoles ácido ascórbico

350

300

250

200

150

100

50 y = 146,08x + 30,444
R² = 0,9795
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Absorbancia a 695 nanómetros
Gráfica 1: Valores de absorbancia + nmoles ascórbico muestra

*Pendiente de la recta de calibrado Fh = 146,08nmol/u.a

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 No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Para poder cuantificar la concentración de ácido ascórbico se utilizó la siguiente fórmula:
CAH (nmoles ascórbico/g peso fresco) = (A695 x Fh x Ve/Vm)/Pf
dónde finalmente obtuvimos los resultados que se muestran a continuación:

Cálculo de la concentración de antioxidantes

Semillas de Pimienta:
CAHP1= (0,72u.a. X 146,08 nmol/u.a. x 4ml/0,05ml) / 1g= 8414,208 nmol/g
CAHP1 = 8,414208 micromoles ascórbico/g
CAHP2 = (0,73u.a. x 146, 08nmol/u.a. x 4ml/0,05ml) / 1g = 8531,072 nmol/g
CAHP2 = 8,531072 micromoles ascórbico/g
CAHP3 = (0,71u.a. x 146,08nmol/u.a. x 4ml/0,05ml) / 1g = 8297,344 nmol/g
CAHP3 = 8,297334 micromoles ascórbico/g

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El valor medio que hemos obtenido es de 8414,208 ± 1 nmol/g

Los valores obtenidos de absorbancia junto con las concentraciones de ácido ascórbico de
nuestra muestra se reflejan en la siguiente tabla:

Tabla 4: Valores de absorbancia y concentración de ascórbico pimienta

Nanomoles de ácido
Muestra Absorbancia a 695 nm
ascórbico (nmol)
CAH1 8414,208 0,72
CAH2 8531,072 0,73
CAH3 8297,344 0,71

Para poder cuantificar y observar los resultados de una manera más sencilla y visual se
construye una recta de calibrado cuyos datos se muestran en la tabla 3.

8550
Nanomoles ácido ascórbico

8500

8450

8400

8350

8300 y = 11686x - 1E-08

R² = 1
8250
0,705 0,71 0,715 0,72 0,725 0,73 0,735
Absorbancia a 695 nm
Gráfica 2: Valores de absorbancia + nmoles ascórbico pimienta

*Pendiente de la recta de calibrado = 11686 nmol/u.a

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 6. Discusión
A la vista de los resultados podemos ver que ha funcionado el método y estos han sido
coherentes, ya que a medida que aumenta la absorbancia a 695 nm, los nanomoles de ácido
ascórbico de las semillas también lo hacen, como indicaba el método utilizado en las muestras.
En la muestra patrón al principio los valores de absorbancia eran el doble del anterior y lo
mismo ocurría con la concentración de ácido ascórbico. En nuestras semillas de pimienta, los
valores de absorbancia aumentaban una centésima con respecto al valor anterior y los
nanomoles de ácido ascórbico lo hacían en unas cien unidades.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Estos resultaos son coherentes entre sí en comparación con la muestra patrón y el método
utilizado es por tanto bastante eficaz.

7. Conclusiones
Las semillas de pimienta contienen antioxidantes, al ir aumentando el ácido ascórbico (un
antioxidante conocido) a medida que va aumentando la absorbancia.

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8. Bibliografía
• Mohamed R, Pineda M, Aguilar M (2007) Antioxidant capacity of extracts from wild and
crop plants of the mediterranean region. Journal of Food Science 72:S59-S63.

• Prieto P, Pineda M, Aguilar M (1999) Spectrophotometric quantitation of antioxidant

capacity through the formation of a phosphomolubdenum complex: Specific application to
the determination of vitamin E. Analytical Biochemistry 269:337-341.

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