Asignatura: Laboratorio II (2146)

Tema 16: Métodos generales de cultivo in vitro vegetal

Departamento de Biología
Docente responsable: Dra. Elizabeth Agostini Molecular. FCEFQyN
 Tema 16: Principales contenidos

 Métodos generales de cultivo in vitro vegetal.

Concepto de cultivo in vitro. Ventajas respecto del cultivo a campo.

 Totipotencia celular.

Medios de cultivo, composición. Fitohormonas. Medios sólidos y líquidos.

Infraestructura para el cultivo in vitro: instalaciones, equipos, materiales,

cabina de flujo laminar

Esterilización/desinfección. Sistemas de esterilización.

Desinfección del material vegetal. Obtención de plantas en condiciones

asépticas.
Las plantas y sus múltiples aplicaciones comerciales

Producto Plantas utilizadas

Biocombustibles Caña de azúcar, remolacha azucarera, soja, ricino, maíz
Fibras textiles Algodón, lino, cáñamo, yute, coco, etc
Aceites y grasas Soja, algodón, colza, maní, girasol, dendé, ricino, sésamo, olivo, lino

Esencias y fragancias Azafrán, menta, geraniol, eugenol

Latex Caucho, zapote

Ceras Jojoba, carnaúba
Condimentos Pimienta, nuez moscada, canela, jengibre, clavo de olor
Taninos Acacia, quebracho, eucalipto
Tinturas Palo de Brasil, palo de campeche, Rubia tinctorum

Compuestos
biológicamente
activos
Floricultura- Mercado en
expansión-Exportación
Inconvenientes del cultivo a campo

- variaciones climáticas

- cambios en el suelo

- enfermedades (virus, bacterias, insectos, nematodos, etc)

- problemas ambientales provocados por el hombre

-sobre-explotación de recursos naturales
(especies en extinción, pérdida de biodiversidad)

Propuesta alternativa

Los cultivos in vitro de células,

tejidos y órganos vegetales
 El cultivo in vitro vegetal: ¿en qué consiste?

Es el cultivo en un medio nutritivo (de composición

definida), en asepsia y en condiciones ambientales
controladas, de: plantas, embriones, semillas o
explantos vegetales (órganos, tejidos, células,
protoplastos, etc.).

Explanto: parte de un vegetal que se

separa y se utiliza para iniciar un
cultivo in vitro.
¿En qué se fundamenta el cultivo in vitro vegetal?

En la teoría de la totipotencialidad celular, que postula que toda

célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta
completa (idéntica a la original) a partir de un cultivo in vitro, sin
importar el grado de diferenciación alcanzado.

Para ello se requieren condiciones específicas referidas al medio

de cultivo, concentraciones adecuadas de reguladores de
crecimiento, temperatura, fotoperíodo, etc
Los medios de cultivo artificiales

• Requerimientos de una planta para su

crecimiento y desarrollo:

- Soporte
- Agua
- Nutrientes
- Aire (O2 y CO2)
- Condiciones ambientales adecuadas

Composición:
El medio nutritivo - Componentes esenciales
- Componentes opcionales

Los reguladores de crecimiento

La consistencia
El medio de cultivo: composición

MEDIOS DE CULTIVO

COMPONENTES ESENCIALES COMPONENTES OPCIONALES

Agua Sales Fuente de Vitaminas Reguladores Acidos Sustancias

Aminoácidos
de Carbono de crecimiento orgánicos naturales complejas

Macro- Micro- Tiamina

elementos elementos Sacarosa Auxinas
Piridoxina Tirosina Acido ascórbico
Nitrógeno Cobalto Glucosa Citocininas Leche de coco
Riboflavina Arginina Acido cítrico
Calcio Yodo Fructosa Giberelinas Proteínas hidrolizadas
y otras Serina
Fósforo Manganeso Acido abscísico Extractos vegetales
Magnesio Zinc Etileno Extracto de levadura
Potasio Hierro
Azufre Molibdeno

• Se incorporan en moléculas y metabolitos vegetales o bien actúan como

cofactores o agentes catalíticos en varios procesos metabólicos.
Los elementos nutritivos minerales
Macroelementos:
 Nitrógeno: Como componente de proteínas, coenzimas, nucleótidos y clorofila
está implicado en todos los procesos de crecimiento y desarrollo vegetal. Síntoma de
carencia: clorosis (por inhibición de la síntesis de clorofila).
 Fósforo: Forma parte de los ácidos nucleicos, adenosín- fosfatos (AMP, ADP, ATP) y
de piridín nucleótidos (NAD y NADP). Participa en todas las reacciones energéticas
del metabolismo y en procesos relacionados con la transferencia de caracteres
hereditarios. También forma parte de piridoxal fosfato (coenzima), de los fosfolípidos
y del ácido fítico. Su deficiencia provoca severas alteraciones del metabolismo y
desarrollo.
 Potasio: Actúa como activador de numerosas enzimas. Tiene un rol importante en
el transporte de azúcares, mecanismos reguladores de la apertura y cierre
estomático, etc.
 Calcio: Como componente estructural de paredes y membranas celulares y como
cofactor de varias enzimas.
● Azufre: Forma parte de las moléculas de proteínas y otros compuestos como
tiamina, biotina y Coenzima A, que son esenciales para las plantas porque actúan
como cofactores o coenzimas.
● Magnesio: Como elemento estructural (forma parte de la clorofila) y como
cofactor enzimático.
Los elementos nutritivos minerales

Microelementos:
• Hierro: Como elemento estructural (citocromos, citocromo-oxidasa, catalasa,
peroxidasas, ferredoxina, nitrogenasa) y como cofactor enzimático. Es esencial
para la síntesis de clorofila.
• Manganeso: Tiene un importante rol en la fotosíntesis. Su deficiencia provoca
alteraciones en la membrana de los cloroplastos y también afecta la
respiración, porque es activador de numerosas enzimas.
• Zinc: Participa en la biosíntesis de auxinas y como activador de varias enzimas.
• Cobre: Forma parte de enzimas tales como tirosinasa, lacasa, fenolasas, ácido
ascórbico oxidasa. Interviene en la fotosíntesis, formando parte de la
plastocianina.
• Molibdeno: su función se relaciona con la fijación de nitrógeno y con la
asimilación de nitratos. Forma parte de las enzimas nitrato reductasa y
nitrogenasa.
El medio nutritivo: los reguladores de crecimiento
• Grupos básicos de reguladores del crecimiento
Auxina
Auxinas
Citocininas
Giberelinas
Acido abscísico
Citocinina
Etileno

• Generalidades:
- Actúan a bajas concentraciones (0,1- 10 mg/L)
- Interactúan unos con otros
- Los resultados están determinados por las concentraciones relativas
de cada uno.
- Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos de las
plantas.
- Los reguladores endógenos están presentes durante todo el ciclo de
vida de la planta, su concentración fluctúa y es diferente en cada
uno de sus órganos
 AUXINAS

• Naturales: AIA
• Sintéticas: 2,4-D, ANA 2,4-D

• Principales efectos:
- estimulan la elongación de las células
- promueven la formación de raíces adventicias
- Promueven la diferenciación del
xilema y la regeneración de tejido vascular
- Favorecen la maduración de frutos

Laboratorio: se preparan soluciones

madre concentradas.
Las auxinas se disuelven en NaOH.
 CITOCININAS

• Naturales: ZEA (zeatina); IPA (isopentenil adenina)

• Sintéticas: KIN (Cinetina); BA (benciladenina)
• Principales efectos:
- Promueven la división celular (citocinesis) y formación de
órganos (tallos)
- Retardan la senescencia
- Promueven desarrollo de yemas laterales
Laboratorio: se preparan soluciones
madre concentradas.
Las citocininas se disuelven en HCl
Importancia de los reguladores de crecimiento como componentes de los
medios nutritivos

Auxinas Citocininas Auxinas Citocininas

Desarrollo de parte aérea Enraizamiento

El medio nutritivo: la consistencia

La concentración y calidad del

agente gelificante pueden
Sólido tener importantes efectos en el
desarrollo del cultivo

Consistencia del medio

El metabolismo de los tejidos

vegetales puede modificarse
de acuerdo a las características
Líquido
del medio de cultivo
(sólido/líquido)
Preparación del medio de cultivo

1- Preparar las soluciones madres de macro y micronutrientes, vitaminas

y fitohormonas. Conservar en heladera.
2- Colocar, en un erlenmeyer o vaso de
precipitado, agua bidestilada, las soluciones
madre de macro y microelementos, reguladores
de crecimiento (cuando corresponda), sacarosa,
mio-inositol . Ajustar el pH y llevar a volumen
final.
3- Agregar agar (si el medio es sólido).
Distribuir en recipientes adecuados.
4 - Esterilizar (autoclave).
5 - Agregar las sustancias termolábiles
(antibióticos, vitaminas), previamente
esterilizadas por filtración y en condiciones
de esterilidad (flujo laminar).
https://www.youtube.com/watch?v=VFhJ5T1qLJc
Medios de cultivo utilizados en laboratorios de Biotecnología vegetal

- Medio de Murashige-Skoog (MS)

- Medio B5

- Medio de White

- Medio de Linsmayer- Skoog (LS)

- Medio de Schenk y Hildebrandt (SH)

Esterilización

Se deben esterilizar:
- Medios de cultivo,
- Recipientes de vidrio y de plástico especial
- Instrumental

Métodos de esterilización
• Calor húmedo: Autoclave (121°C, 0,75-1 atm, 15-20 min). Es rápido
y simple. Se usa para medios de cultivo (con sustancias termoestables), otros líquidos,
algunos instrumentos de laboratorio.

• Calor seco: Estufas (160-180 °C; 1,5 a 3 hs). Se usa para material de
vidrio, pinzas , bisturíes, vaselina, etc

• Filtración: Filtros descartables. Se usa para sustancias termolábiles

(antibióticos, algunas hormonas, etc)
Equipamiento básico para trabajar en condiciones asépticas

Cabinas de flujo laminar

Esquema de una cabina de flujo laminar horizontal

Cabinas de flujo laminar
horizontal Elimina la mayor parte de las
partículas con diámetro superior a
0,3 µm

Cabinas de flujo laminar

con seguridad biológica
para el operador

Cabinas de flujo laminar

vertical
 Diseño básico de un laboratorio para el cultivo de tejidos vegetales

F
Sala de L
incubación Sala de
siembra F
- Para guardar reactivos y material de Sala de L
vidrio
- Debe poseer baja humedad almacenamiento Debe contar con:
- Debe ser preferentemente oscura
-balanzas
- No debe estar sujeta a elevadas Sala de Sala de - pHmetros
temperaturas
lavado, preparación de -Agitadores magnéticos,
- Heladeras, freezer, etc
secado y medios de
esterilización cultivo

Oficina
Principales características y ventajas del cultivo in vitro

- Se realizan en pequeña escala o en áreas relativamente pequeñas.

- Usan las mismas instalaciones para diferentes cultivos.

- Las condiciones ambientales están controladas y optimizadas

(factores físicos, nutricionales y hormonales)

- Son independientes del suelo, clima y de las enfermedades

- Son sistemas asépticos, de producción constante

y definida que facilitan la extracción de productos
de interés comercial.
NO- Organizados Cultivos in vitro: diferentes tipos

• Cultivos de callos

• Cultivos de células aisladas (suspensiones celulares)

• Cultivos de protoplastos

• Cultivos de semillas y plantas intactas

Organizados

• Cultivos de embriones

• Cultivos de órganos aislados (meristemas, raíces,

raíces transformadas, anteras, etc)
Clasificación de los cultivos in vitro en base a su forma de crecimiento

 Organizados: Se mantienen las características de organización

estructural, es decir, las características típicas del órgano o la planta.
Ej: cultivo de embriones, semillas, órganos.

 No organizados: Las células o tejidos aislados del vegetal se

desdiferencian y se cultivan, mostrando un crecimiento no organizado.
Ej: callos y suspensiones.
Diferentes tipos de cultivos in vitro

1. Cultivo de semillas

 Permite el crecimiento de semillas en condiciones

asépticas en un medio artificial
 Aumenta la eficiencia de germinación de semillas
que son difíciles de germinar in vivo
 Facilita la germinación precoz mediante el agregado
de reguladores de crecimiento
 Permite la producción de plántulas asépticas para
utilizarlas como fuente de explantos o para el cultivo
de meristemas
Desinfección del material vegetal

Agente desinfectante Concentración Duración (min)

frecuentemente
usada (%)

Hipoclorito de calcio 9-10 5-30

Hipoclorito de sodio 2b 5-30
Peroxido de hidrógeno 10-12 5-15
Nitrato de Plata 1 5-30
Cloruro mercúrico 0,1-1 2-10
Antibióticos 4-50 mg l-1 30-60

Ampicilina, cefotaxima, Soluciones biocidas:

kanamicina, gentamicina, PPM (Plant Preservative Mixture) y G-1
Rifampicina, tetraciclinas. (cpto derivado de isofurfurales
de caña de azucar)

Ejemplos de algunos agentes empleados para la desinfección superficial de semillas y explantos.

 2. Cultivo de callos
• Definición:
Un callo es una proliferación tisular compuesta por células de escasa
diferenciación. Las células que lo constituyen presentan un desarrollo
continuo, acelerado y de apariencia desorganizada, que da origen a
una masa amorfa de tejido.

• Utilidades
- Regeneración de plantas
- Estudios fisiológicos, bioquímicos
y genéticos.
- Estudios de ultraestructura celular
y fitotoxicología.
- Producción de fitoquímicos
- Obtención de suspensiones celulares
Obtención de callos

• Explanto (estado de desarrollo, edad, tamaño)

Optimizar
• Condiciones de cultivo
(reguladores de crecimiento, tiempo, temperatura)

Medio MS sólido, con reguladores de Callos friables de aproximadamente

Plantas cultivadas in vitro crecimiento. (Incubar a 25± 2 °C 30 días de crecimiento en medio
durante 20-40 días, aproximadamente 4 semanas) MS con 2,4-D.
según la especie vegetal
(asépticas)
 Etapas del cultivo de callos

- Inducción: las células del inóculo inicial

comienzan su crecimiento

- Proliferación celular: el tejido calloso

aumenta su masa celular al máximo.
Hay proliferación celular activa.
(en esta etapa se los puede utilizar para la regeneración de plantas o
bien para mantenerlos como callos)

Curva de
crecimiento de callos

- Envejecimiento: pérdida de la capacidad de crecimiento acelerado (si no se los subcultiva)

Control hormonal y desarrollo de callos

Citocinina
Lámina de hoja

Tallo
adventicio

Auxina
Raíz

Callo

Establecer un adecuado
balance hormonal
 Control hormonal y desarrollo de callos
Ejemplo: Explanto de tallo de Scrophularia sp, sometido a diferentes
concentraciones de auxinas (IAA y NAA) y citocinina (BA= benciladenina)

(Acido indol
acético)

(Acido
naftalén
acético) https://www.youtube.com/watch?v=7SUvo5gvefM
Obtención de cultivos en suspensión a partir de callos
 3. Cultivos de células en suspensión
(suspensiones celulares)

• Una suspensión celular consiste en una población de células

“aisladas” e indiferenciadas, así como también algunos racimos
celulares, distribuídos en un medio líquido, en constante
movimiento.

• En general, las células no están totalmente dispersas y forman

pequeños agregados (5-200 células).

Ventajas (respecto de los

callos):
- rápido crecimiento, Desventaja:
- menor heterogeneidad,
- crecen en grandes volúmenes, variabilidad genética
-permiten agregar precursores
Obtención de suspensiones celulares

Callos

Plántulas estériles
o embriones
homogeneizados
Suspensión celular
Pectinasas
y celulasas • Condiciones de cultivo (medio de cultivo,
temperatura, iluminación, agitación, pH, tiempo)
Optimizar
• Mantenimiento (subcultivo)
Suspensiones celulares: algunas aplicaciones

REGENERACIÓN DE PLANTAS

Las semillas artificiales

Las semillas
(sintéticas) artificiales
reproducen
(sintéticas) reproducen
la estructura de una
la estructura
semilla de una
de origen
semilla
sexual. de origen
Poseen una
sexual. Poseen una
cubierta de protección,
cubiertasustancias
contiene de protección,
de
reserva y portan, en sude
contiene sustancias
reserva
interior, unyembrión.
portan, en su PRODUCCION DE SEMILLAS ARTIFICIALES
interior, un embrión. Las semillas artificiales (sintéticas) reproducen
la estructura de una semilla de origen sexual.
Poseen una cubierta de protección, contiene
sustancias de reserva y portan, en su interior,
un embrión.

PRODUCCIÓN DE FITOQUÍMICOS
A partir de un explanto, se pueden establecer callos para regenerar plantas
(organogénesis/embriogénesis); o cultivos de células para obtener embriones y semillas artificiales, o
bien para obtención de fitoquímicos (en biorreactores), entre otras múltiples aplicaciones
 4. Cultivos de raíces
transformadas

• Son cultivos organizados, que se obtienen por inoculación

de explantos con Agrobacterium rhizogenes.

• Son bioquímica y genéticamente estables, presentan velocidad

de crecimiento superior a la de raíces normales.

• Sintetizan enzimas, productos naturales y metabolitos

secundarios en cantidades similares o superiores a los de ¿Cómo podrán
la planta de origen. obtenerse en el
laboratorio?
Obtención de cultivos de raíces transformadas (RT): etapas

1.Plantas 3. Inoculación 4. Transferencia a placa

Medio MS+ Ab

2. Explantos con injurias

6. Desarrollo 5. Transferencia a
de las RT MS líquido
 Obtención de cultivos de raíces transformadas (RT)
Conceptos que debemos recordar

Agrobacterium rhizogenes Bacteria fitopatógena,

Agente causal de la enfermedad

denominada “raíz en cabellera”

(1) Medio agar- agua: 2-4 dias

Plantas cultivadas in vitro (2) Medio MS sólido, con antibiótico Medio MS Líquido, con antibiótico
durante 20-40 días, (1-4 semanas) hasta aparición (aprox. 1 mes).
según la especie vegetal de raíces Subcultivar cada 30 días
(asépticas)
 Ejemplos de cultivos de raíces transformadas (RT)

Raíces transformadas de soja

Raíces transformadas de Withania somnífera

(Bufera- ginseng indio)

Raíces transformadas de nabo

Raíces transformadas de Catharantus roseus

Principales características de las raíces transformadas

Estabilidad
genética y
bioquímica
Bajos costos de Crecimiento rápido y
implementación plagiotrópico
No requieren
fitohormonas

¿Por qué se
inoculan
Independientesde Producen metabolitos explantos con
otros órganos secundarios y una bacteria?
compuestos
Desarrollo en bioactivos
biorreactores
Propagación
ilimitada
 Transformación mediada por Agrobacterium
Agrobacterium es un género de bacterias Gram negativas fitopatógenas
presentes en el suelo, pertenecientes a la familia Rhizobiaceae.
Característica particular: capacidad para transferir información genética
(T-ADN) a células vegetales e integrarlo de manera estable en su genoma.

Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes

Agente causal de la enfermedad Agente causal de la enfermedad
denominada “agalla de corona” denominada “raíz en cabellera”
 Agrobacterium rhizogenes

región vir bordes del

T-ADN

Plásmido
Ri
TRANSFORMACION:
• Plásmido Ri
• T- ADN
Cromosoma T-ADN • Región vir
Representación esquemática
bacteriano de Agrobacterium rhizogenes

T-ADN
TL-ADN TR-ADN
Plásmido Ri rol A rol B rol C rol D aux1 aux2 ops
tipo agropina

Funciones Síntesis de
rizogénicas Síntesis de
auxinas
opinas (fuente
de C y N para la
bacteria)
Plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes LBA 9402
 Transformación mediada por Agrobacterium rhizogenes
Compuestos fenólicos
(acetosiringona) célula vegetal
Agrobacterium rhizogenes

vir
Ri

T-ADN

Producción de raíces
Mecanismo molecular involucrado en la Síntesis de opinas
agroinfección y transferencia de genes

 Percepción y transducción de las señales

inductoras (comp. Fenólicos)
Activación y expresión de los genes vir
Las proteínas vir son las responsables de
la transferencia e integración del T- ADN
 Factores que influyen en la transformación
Una transformación exitosa depende de varios factores:

-Plantas susceptibles: dicotiledóneas,

monocotiledóneas y gimnospermas.
Planta seleccionada/Explanto/ Edad - Explantos: hojas, hipocótilos, tallos,
pecíolos, tubérculos, raíces, etc

- Tipo de cepa (virulencia); densidad

Cepa de Agrobacterium rhizogenes
Optimización del medio de cultivo
del cultivo; tiempo y condiciones de
inoculación, pre-cultivo con
acetosiringona.
Influye en la transformación,
morfología de las raíces, velocidad de
crecimiento, niveles de producción.
VER LA SIGUIENTE DIAPOSITIVA

Antibióticos Ampicilina (0,5- 1 g/L) o cefotaxima

(para eliminación del microorganismo) (0,25-0,5 g/L)
 Optimización del medio de cultivo
Optimizar la composición de nutrientes es importante
tanto para el desarrollo de los cultivos como para la
producción de metabolitos de interés

Sacarosa (3%) Glucosa (2%) Maltosa (2%)

Variaciones en el crecimiento y la morfología de raíces

transformadas de Withania somnífera cultivadas en
medio MS con diferentes fuentes de Carbono

Doma y col., 2012

 Evaluación del crecimiento de los cultivos

Curva de crecimiento Indice de crecimiento

IC= PS f/PSi

Los requerimientos nutricionales suelen diferir entre los

cultivos así como el efecto de otros factores
(temperatura, luz, pH), que se deben optimizar.

Cultivos de RT de distintas especies

vegetales. De izquierda a derecha: RT
de pimiento, pepino y rabanito.
 Importancia de los cultivos de raíces transformadas

Los cultivos de raíces transformadas son una herramienta muy útil en el área de
biología vegetal, la biotecnología y otras ciencias aplicadas.
Estos cultivos han permitido estudiar muchos procesos en las células vegetales
relacionados con el crecimiento, el desarrollo, los mecanismos fisiológicos y
bioquímicos.
Se usan para estudiar el metabolismo secundario y la producción de compuestos
bioactivos.
También se pueden generar raíces transgénicas y utilizarlas como biofactorías
para producir proteínas recombinantes heterólogas para fines farmacéuticos.
Además, han mostrado aplicaciones prometedoras en fitorremediación y
restauración del medio ambiente debido a las ventajas en la reducción de la
concentración de contaminantes tóxicos orgánicos e inorgánicos del suelo, aguas
residuales, aguas subterráneas y otros residuos
 Resumen de los procedimientos para la obtención de
diferentes cultivos in vitro

Explantos
Explantos: medio Medio MS sólido + RC Medio MS
Hojas con reguladores de CALLOS líquido + RC
Tallos crecimiento (RC) SUSPENSIONES
Raíces CELULARES

Plantas cultivadas in vitro

Explantos: Medio agar-agua

inoculados con Medio MS + Atb (sin Medio MS líquido
Agrobacterium fitohormonas) RAICES
rhizogenes Aparición de raíces TRANSFORMADAS
en los explantos
 Principales aplicaciones de los cultivos in vitro

Micropropagación

Producción de fitoquímicos (compuestos con actividad farmacológica,

aditivos alimentarios, perfumes, aromas, colorantes).

Producción de enzimas

 Obtención de plantas transgénicas y producción de proteínas

heterólogas.

Conservación de la biodiversidad: Bancos de germoplasma

Estudios bioquímicos, fisiológicos y moleculares

Eliminación de metales pesados (Cd, Zn, Co, Cr) y otros compuestos tóxicos
del medio ambiente (fitorremediación)

Se explicarán con detalle en el teórico del Tema 17

 Bibliografía

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