TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

Campus Ciudad Hidalgo

PROYECTO
Producción de naringenina a partir de Saccharomyces cerevisiae

Unidad 1

Ingeniería Metabólica

PRESENTA:
Correa Piña Brenda Lizbeth B16030347 Miranda Blancas María
Patricia B16030403 Nieves Hernández María Guadalupe B16030350
Pérez Cambrón Octavio B16030341 Pérez Segura Cristofer B16030431
Pérez Vega Oscar B16030340

NOMBRE DEL DOCENTE:

D.C. Luis Alberto Madrigal Pérez

CARRERA:
Ing. Bioquímica

GRUPO:
069KB

Ciudad Hidalgo, Michoacán

03 de Octubre del 2021
CONTENIDO
1. Flavonoides....................................................................................................................... 3
 1.1 Generalidades..................................................................................................................
3 1.2 Clasificación de los
flavonoides...................................................................................... 4 1.3 Biosíntesis de
flavonoides............................................................................................... 5 1.4 Flavonoides
y sus aplicaciones biotecnológicas ............................................................. 5
2. Naringenina ....................................................................................................................... 6
2.1 Generalidades..................................................................................................................
6 2.2 Ruta de
síntesis................................................................................................................ 7 2.3
Métodos de obtención ..................................................................................................... 7
2.4 Uso industrial de la naringenina......................................................................................
9
3. Microorganismos como fabricas celulares..........................................................................
10 3.1 Escherichia
coli............................................................................................................. 11 3.2
Saccharomyces cerevisiae............................................................................................. 12
4. Evidencias experimentales en microorganismo .............................................................. 13
4.1 E.coli .............................................................................................................................
13 4.2
S.cerevisiae.................................................................................................................... 14
JUSTIFICACIÓN .......................................................................................................................
15
HIPÓTESIS.................................................................................................................................
15 OBJETIVOS
............................................................................................................................... 15
ESTRATEGÍA EXPERIMENTAL.............................................................................................
16 METODOLOGÍA
....................................................................................................................... 17
RESULTADOS...........................................................................................................................
19 TABLA DE REACCIONES DE PRODUCCIÓN DE
NARINGENINA................................... 30
REFERENCIAS..........................................................................................................................
32
 2
ANTECEDENTES

1. Flavonoides
Los flavonoides pertenecen a una subdivisión de polifenoles, son compuestos formados
por un total de quince átomos de carbono, los cuales se encuentran conformados por dos
anillos aromáticos (anillo A y B) que a su vez se encuentran unidos por un enlace de tres
carbonos (anillo C) (Lagarón, 2016). Estos compuestos son producidos de manera
natural, siendo catalogados como metabolitos secundarios provenientes de plantas
superiores y se encuentran ampliamente relacionados en la dieta del ser humano
(Seleem et al., 2017).

1.1 Generalidades
Estas estructuras fenólicas específicamente están presentes en una gran variedad de
frutas, verduras, algunos granos, flores, hojas o incluso en tallos, raíces y cortezas, de
los cuales se ha logrado identificar una variedad de alrededor de 6,000 especies siendo
en su mayoría de ellos responsables como pigmentos en hojas, flores y frutas (Lagarón,
2016), además, en plantas, son capaces de proporcionar características que confieren
atractividad a los polinizadores como sabor, olor, regulan el crecimiento e incluso la
generan resistencia contra enfermedades, patógenos o condiciones como radiación o
estrés.

Al involucrar su presencia en productos que son ingeridos en la dieta humana y animal,

estos alimentos han sido considerados como alimentos funcionales, ya que proporcionan
cierto valor nutricional y a su vez aportan beneficios a la salud, siendo esta la
característica más importante de los flavonoides (Elisa et al., 2007). Los beneficios son
proporcionados por la bioactividad de estos compuestos, ya que poseen actividades
hepatoprotectoras y antivirales, propiedades antiinflamatorias mediante inhibiciones
enzimáticas, propiedades antimutagénicas, anticancerígenas, antihipertensivas y
antioxidantes mediante la captación de radicales y la capacidad de quelación de iones
metálicos (Panche et al., 2016).

Debido a estas propiedades se ha logrado proporcionar soporte importante en la

literatura acerca del conocimiento sobre los posibles mecanismos que estas moléculas
desempeñan contra enfermedades infecciosas y degenerativas desde enfermedades
bacterianas, virales e incluso padecimientos cardiovasculares, diabetes, y sus derivados,
en donde se ha demostrado que dichas capacidades de los flavonoles dependen
directamente de la estructura particular del compuesto, ya que su naturaleza química
difiere por su grado de

3
hidroxilación, algunas otras sustituciones, conjugaciones además de su grado de
polimerización (Kumar & Pandey, 2013).

1.2 Clasificación de los flavonoides

La subdivisión de los flavonoides en los subgrupos correspondientemente, dependen de
las características mencionadas con anterioridad. Aquellos en los que el anillo B se
encuentra enlazado en el anillo C (posición tres) tenemos a las isoflavonas, mientras que
los que el anillo se enlaza de igual manera el anillo B con el C pero en la posición cuatro
se encuentran los neoflavonoides, después tenemos los que se posicionan en el numero
dos con el mismo enlace de anillos, los cuales corresponden a su vez a varios subgrupos
que difieren en las características de las estructuras del anillo C, entre los cuales
podemos encontrar las antocianinas y chaconas, catequinas, flavanoles, flavanones y
flavonas (Panche et al., 2016).

• Isoflavonas: Este subgrupo particularmente es encontrado en leguminosas

principalmente, predominando en la soja, dentro de estos podemos mencionar a
la genisteína y la daidzeína.
• Neoflavonoides: Característicos por ser compuestos polifenólicos los cuales
pueden ser encontrados en semillas por ejemplo de árboles, madera y corteza y
 plantas.
• Antocianinas: En especial, este subgrupo es responsable del pigmento a las
plantas, frutas y flores cuyo color es dependiente de factores como pH,
mecanismos de metilación o asolación de los anillos aromáticos, las antocianinas
se sitúan en las capas celulares externas. Dentro de esta clasificación podemos
encontrar en frutos rojos principalmente.
• Chalconas: Son llamados flavonoides de cadena abierta debido a que en su
estructura base no presenta el anillo C. Las chalconas se encuentran en
abundancia en tomates, fresas y algunos productos de trigo.
• Catequinas: Las catequinas también son llamadas dihidroflavonoles o falvan-3-
oles por la unión del grupo hidroxilo al anillo C en la posición tres, dichos
compuestos se encuentran presentes en frutas como manzanas, peras, arándanos,
y plátanos.
• Flavanones: Esta flavona se incluye entre los subgrupos más importantes ya que
ejercen una variedad de efectos farmacológicos. También son característicos
debido a la saturación del anillo C, los flavonones son encontrados
principalmente

4
en cítricos y uvas, dichas moléculas se identifican como las responsables del
sabor amargo en y la piel de estos productos.
• Flavonoles: En cuanto a su estructura, en la base del esqueleto cuentan con un
grupo cetona, además de que dan paso a la producción de proantocianinas, en
particular los flavonoles que se han empleado para su estudio encontramos a la
quercetina, el kaempferol, la fisetina y la miricetina. Este grupo de se encuentra
presente en una gran variedad de alimentos, como frutas, verduras e incluso
productos comerciales como uvas, manzanas, algunas bayas, tomates, lechugas,
cebolla y col rizada, además de vino y té.
• Flavonas: Por último, tenemos este subgrupo de gran importancia dentro de los
falvonoides, estas se encuentran altamente presentes en forma de glucósidos, en
hojas, flores y frutas, las principales fuentes de flavonas se encuentran en la
casácara y pomelos de cítricos, tomates, fresas, pimientos rojos, perejil, apio,
manzanilla, menta y ginkgo biloba, de los cuales podemos mencionar las
flavonas más comunes como flavonas polimetoxiladas, sinensetina, tageretina,
 nobiletina y naringenina (Albuquerque et al., 2021).

1.3 Biosíntesis de flavonoides

La vía de la cual parte la generación de flavonoides es a partir de la vía fenilpropanoide
donde lo primero que ocurre es la transformación de fenilalanina a 4-cumariol-CoA, en
donde este compuesto se fusiona con 3 moléculas de malonil-CoA y mediante la
actividad catalítica de la chalcona sintasa son producidos armazones de chalcona, de los
cuales se derivan los diferentes flavonoides, en donde posteriormente las transferasas
realizan una modificación en los flavonoides dando características fisiológicas
respectivas (Falcone Ferreyra et al., 2012).

1.4 Flavonoides y sus aplicaciones biotecnológicas

Dentro del campo industrial este tipo de moléculas han sido utilizadas ampliamente
debido las propiedades que los caracterizan, uno de los campos que sin duda han sabido
emplear estos compuestos es la industria alimenticia, particularmente se ha despertado
por una alternativa hacia los aditivos alimentarios artificiales, optando por el uso de
compuestos naturales específicamente dirigido hacia los conservadores de muchos
alimentos gracias a la producción de flavonoides específicos usando extractos

5
aprovechando sus capacidades antioxidantes, como por ejemplo la catequina provente de
Camellia sinensis para la conservación del queso bajo en grasa.

Gracias a esta serie de datos descritos los científicos han continuado con investigaciones
acerca de flavonoides específicos, con el fin de aprovechas dichos compuestos que la
naturaleza nos proporciona, empleado así nuevas estrategias para su manipulación.
(Albuquerque et al., 2021).

2. Naringenina
La naringenina es un metabolito secundario que proviene de origen vegetal, encontrada
en forma de glucósido, dicho compuesto es bien reconocido por las potentes actividades
biológicas que posee, las cuales se han descubierto mediante datos obtenidos de estudios
tanto in vitro como in vivo, cuyos datos actuales son de carácter comprometedor, no
obstante, se continua el estudio del comportamiento de esta flanonona en sus diferentes
aplicaciones (Salehi et al., 2019).
2.1 Generalidades
La naringenina es una flavonona primaria derivada de plantas insoluble en agua, que se
encuentra especialmente en los pomelos, naranjas, limones, limas, tomates, kiwis y
fresas que cuenta con propiedades antivirales, antinflamatorias y antioxidantes. Además,
se le atribuye propiedades de protección del ADN, mejora el metabolismo de grasas en
el hígado, reduce el colesterol y mejora el azúcar en la sangre (Zamora, 14 julio, 2020).

La naringenina que también se le conoce con su nombre sistemático como 5,7-dihidroxi

2-(4-hidroxifenil) ciroman-4-ona, con una masa molecular de 272 (g/mol), un punto de
fusión de 250-251° y su fórmula molecular es C15H12O5, a la naringenina se le
considera un flavonoide que se encuentra en el grupo de las flavononas además de la
hesperidina. Las flavononas son flavonoides no-polares caracterizados por la ausencia
del doble enlace entre el carbono 2 y 3 además de la presencia de un centro quiral en el
carbono 2 (M, 2011).

Recientemente, se ha encontrado que la naringenina tiene un potencial como un

inmunomodulador eficaz, que está asociado con la supresión de las actividades de los
mastocitos, macrófagos, células dendríticas y células T (Rivera, 18 de junio de 2020).

Entre los efectos más destacados de la naringenina se ha demostrado la inhibición de

enzimas prooxidantes como son la xantina oxidasa, lipoxigenasa y cicloxigenasa.

6
También se sabe que reduce la nitración y oxidación de proteínas, además de esto la
naringenina también ejerce algunos efectos neuronales ya que es capaz de atravesar la
barrera hematoencefálica, esto al interactuar con vías de señalización de una proteína
importante, la cual es la quinasa C (Rivera, 18 de junio de 2020).

2.2 Ruta de síntesis

En las plantas, todos los flavonoides son sintetizados a partir de flavononas que estas
derivan de las chalconas que provienen de la ruta fenilpropanoide (Serrano, 2007).

Los principales precursores de los flavonoides provienen de la ruta fenilpropanoides que

ocurre con la conversión de la fenilalanina a ácido cinámico por la enzima fenilalanina
amoniaco-liasa (PAL). Después el ácido cinámico se convierte en ácido-4-cumárico por
la enzima cinamato 4 hidroxilasa (C4H), en algunas plantas la enzima PAL tiene la
actividad de la enzima tirosina-amoniaco liasa (TAL) para generar el ácido-4-cumarico
directamente. Posteriormente el ácido-4-cumarico se transforma en el 4-cumaroil-CoA
por la enzima 4-cumarato CoA ligasa (4CL). En el siguiente paso la 4-cumaroil-CoA
que es un producto central de la ruta fenilpropanoides es sintetizada por 3 moléculas de
malonil-CoA para formar naringenina-chalcona por la enzima chalcona sintasa (CHS).
Seguidamente la enzima chalcona isomerasa cicla la naringenina chalcona mediante la
isomerización estereoespecífica para formar la naringenina (Serrano, 2007).

2.3 Métodos de obtención

Como se sabe la naringenina es un compuesto que está clasificado como una flavona y a
su vez es un tipo de flavonoide. Estos flavonoides son de gran interés tanto para la
industria farmacéutica como para la industria vinícola, incluso para el área médica,
también en la industria alimentaria y agrícola debido a las propiedades que estos poseen.
Para dichos fines existen diferentes métodos de obtención para su uso industrial.

2.3.1 Síntesis química

Hay diferentes maneras de obtener un compuesto polifenol ya que estos se pueden
encontrar directamente en las hojas o en los frutos de vegetales y frutas, por esto dentro
de los métodos químicos podemos encontrar la extracción sólido-líquido (SLE) usada
principalmente en la industria alimentaria. Es un proceso de transferencia de materia
mediante el cual el compuesto de interés pasa desde la matriz del sólido hasta el seno de
la fase líquida (Sturzoiu et al. 2011). Sin embargo, debido a la resistencia natural que
ofrece la fase sólida (a menudo tejidos de origen vegetal) a la transferencia de materia
y/o

7
penetración de líquidos el proceso es más lento, menos eficiente y requiere una mayor
demanda energética y un mayor consumo de disolvente, haciendo ello menos interesante
su uso a escala industrial (Sturzoiu et al. 2011). Los métodos tradicionales incluyen
extracción Soxhlet, maceración, percolación, etc. Estas técnicas requieren mucho tiempo
y emplear grandes cantidades de solventes (Rubio and Rodriguez 2018). Además, estos
métodos tradicionales se basan principalmente en procesos de calentamiento que, aunque
facilitan la transferencia de materia entre las diferentes fases del sistema y la solubilidad
de los compuestos, consumen mucha energía y pueden provocar la degradación de los
compuestos termolábiles (Barba et al. 2016).

Otro método conocido es la tecnología de fluidos super críticos (FSC), Consiste en la

separación de sustancias disueltas o incluidas dentro de una matriz, que se efectúa por
encima del punto crítico del solvente, basada en la capacidad que tienen determinados
fluidos en estado supercrítico de modificar su poder de disolución (Dominguez and
Parzanese 2012). Debido al incremento en el consumo de alimentos funcionales se han
desarrollado muchas investigaciones para obtener las sustancias que los componen de
una forma segura y rápida, se encontró en los FSC una muy buena alternativa ya que
adicionalmente a su seguridad, pueden obtenerse mejores resultados porque tienen la
capacidad de disolver o extraer un número mayor de estos componentes con una mejor
calidad y mediante un proceso más eficaz (Dominguez and Parzanese 2012). A pesar de
ello, la inversión inicial para llevar adelante dichos procesos es elevada, aún para
equipos en pequeña escala (debido a la tecnología involucrada), a los costos de
materiales y de montaje. El valor de un equipo cuya capacidad de operación es de 4 o 5
litros, en algunas de las firmas americanas o europeas que se dedican a fabricarlas,
ronda los US$ 150.000. Es importante tener en cuenta que este tipo de tecnología no es
producida en el país a escala industrial actualmente, por lo que debe ser importada de
Europa, EE UU o Japón (Dominguez and Parzanese 2012).

2.3.2 Métodos biológicos

Por otro lado, también tenemos la obtención de compuestos polifenoles mediante el uso
de catalizadores. Existe, por ejemplo, la adición de hidrógeno en presencia de
catalizadores como paladio en solución alcohólica y presencia de sulfato de bario, o
empleando níquel Raney en un rango de 160-200 ºC en éter de petróleo a una presión
que oscila entre 100-200 atm (Trost and Schreiber 1993). Una reacción similar puede
llevarse a cabo utilizando una fuente hidrogenante alternativa al hidrógeno, como el
hidruro de

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aluminio y litio (Trost and Schreiber 1993); también puede reducirse mediante formiato
de amonio en presencia de un catalizador que permita la transferencia de hidrógeno
como paladio soportado sobre carbón (Trost and Schreiber 1993). Otro método es la
acilación alquilación de Friedel-Crafts, utilizando trifluorometansulfonato de iterbio
como catalizador ácido de Lewis y las condiciones de reacción incluyen al nitrometano
como solvente, una temperatura de 100ºC y un tiempo de reacción de 1,5 h, lográndose
rendimientos con valores entre 70-91% (Martín Gordo 2018). No obstante, su uso a
escala industrial no es una forma viable debido a que la separación de los catalizadores
de los compuestos se vuelve complicada, además del elevado precio que tienen. Sin
embargo, estos métodos no son la única alternativa para obtener a estos compuestos
bioactivos existe también la opción de producción mediante organismos biológicos.

2.3.3 Síntesis microbiana

Gracias a las herramientas que brindan las técnicas de distintas ramas tal como lo es la
biología molecular y la ingeniería metabólica se puede llevar a cabo de la producción de
estos compuestos en organismos que tienen o no la capacidad de producir un
determinado compuesto. Estas técnicas tienen como objetivo agregar rutas de síntesis a
su metabolismo para que pueda producir el producto deseado o por otro lado silenciar
rutas que estén compitiendo por este mismo con la finalidad de tenerlo en una mayor
cantidad y a un menor costo de producción que en su metabolismo original. Dentro de
estos organismos podemos encontrar los microrganismos más empleados como lo son la
levadura Saccharomyces cerevisiae y Escherichia coli ya que son organismos plataforma
con un amplio estudio y usados comúnmente en la industria.

2.4 Uso industrial de la naringenina

La naringenina es utilizada mayormente como un producto de la industria alimentaria,
farmacéutica, y de investigación, gracias a ser un flavonoide con efectos en la salud
humana, posee beneficios como frenar la oxidación biológica, los radicales libres y los
procesos inflamatorios, uno de estos casos es la de tener propiedades hipolipemiantes,
previniendo la desplidemia, la sobre producción de apolipoproteínas e hiperinsulina
(Mulvihill EE 2009). De igual forma el metabolito es implementado en la industria
alimentaria procesándolo como suplemento dietético o aditivo alimentario, siendo tan
efectivo como los productos sintéticos, además de poseer derivados como chalconas y
dihidrochalconas que tienen 2000 veces más sabor dulce que la sacarosa, y crear una
alternativa para los edulcorantes sintéticos (BADUI 1999).

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En la industria de la investigación en conjunto con la salud, se le atribuye a la
naringenina la propiedad de ser anticancerígena, específicamente por su capacidad al
reparar el material genético (ADN), ya que en estudios reciente se comprobó una
reducción del 24%de daños en el ADN en la exposición de células cancerígenas con
naringenina,
además de atribuirle a naringenina y hespertina, un efecto neuroprotector en la
enfermedad de Alzheimer, Parkinson, y la prevención del daño oxidativo (Roghani
2006).Además la industria farmacéutica ha revolucionado la utilización del metabolito
sintetizado llamado naringenina, utilizándolo como un antitrombótico y antiinflamatorio
implementado en la dieta humana o como extractos comerciales en forma de
suplementos (González Gallego y Sánchez Campos 2007).

A pesar de los datos recaudados por sus efectos biológicos, los datos recaudados tras
ensayos clínicos (en este caso, que son aplicados a pacientes humanos), estos ensayos no
han sido suficientes ya que su principal limitante recae en los altos costos por su
aislamiento y purificación posterior, además de la inestabilidad química de la
naringenina (Salehi et al., 2019).

No obstante, se continúa con la ardua investigación por científicos, en los que se existe
una alternativa sustentable hacia la producción natural de estos metabolitos,
aprovechando los mecanismos que caracterizan a microorganismos que ya se encuentran
ampliamente estudiados.

3. Microorganismos como fabricas celulares

En la actualidad y desde su descubrimiento, los microorganismos han sido estudiados y
empleados como biofabricas por el ser humano, debido a las ventajas que estos
organismos poseen, esto remota desde su manipulación para la producción de bebidas y
la generación de diversos alimentos mediante fermentaciones, en la actualidad, gracias a
aportaciones como el desarrollo de herramientas genéticas los investigadores y
científicos han logrado realizar un sinfín de modificaciones en el metabolismo de estos
microorganismos tales como Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus
subtilis y Streptomyces coelicolor, incluso hongos como Aspergillus niger y Aspergillus
awamori (Velazquez et al., 2020) ya que esta serie de microrganismos producen cultivos
de alta densidad , esto no solo con el propósito de sintetizar productos o metabolitos de
interés, sino también para el aumento de su producción, acelerando procesos
acompañados también de un ahorro energético donde a su vez se pretende detener la

10
producción de subproductos innecesarios, además de la generación de nuevas cepas, las
cuales sean resistentes a condiciones ambientales como estrés, siendo esta serie de
objetivos una alternativa sustentable hacia la generación amplias gamas de productos de
interés humano (Gosset, 2017).
Los primeros estudios en los que se llevaron a cabo producciones mediante
microorganismos fueron empleando la maquinaria de una bacteria; Escherichia coli, la
cual hoy en día continúa siendo ampliamente utilizada para la producción de proteínas
recombinantes con fines diagnósticos, terapéuticos o vacunales, usando procedimientos
de bajo costo (García et al., 2013).

3.1 Escherichia coli

Es el organismo más empleado como fabrica celular para aplicaciones biotecnológicas,
debido a que existe un gran conocimiento sobre su genoma, metabolismo y fisionomía,
aunado a su mayor velocidad especifica de crecimiento, fácil manipulación génica y
existencia de vectores de expresión estables (García et al., 2013; Velázquez et al., 2020).
Del cual se ha logrado obtener productos de interés alimenticio, cosmetológico y
químico como lo son el ácido láctico, acido succínico, L-treonina, combustibles como
etanol, pentanol, isobutanol, ácido poliláctico, así como también biofarmacos
importantes ya aprobados por farmacéuticas internacionales como insulina, hormonas y
vacunas (Velazquez et al., 2020).

Sin embargo, a pesar de las ventajas que tiene este organismo también se sabe que las
proteasas que produce E. coli pueden destruir las proteínas recombinantes obtenidas y es
incapaz de realizar muchas de las modificaciones postraduccionales comunes en
proteínas de origen eucariota (García et al., 2013); otro inconveniente que presenta este
organismo es que no puede producir metabolitos en cultivos de alta densidad ya que si
se le suministra un excedente de sustrato el consumo del mismo se da a una alta
velocidad, generando un desbalance en las vías glucolítica y de los ácidos
tricarboxilicos lo cual provoca una producción de acetato (sobre flujo metabólico).
(Velázquez et al., 2020).

Debido a sus características fisiológicas, las bacterias han sido utilizadas ampliamente,
aunque a pesar de las ventajas que ha presentado este organismo para la generación de
productos, un organismo que hoy en día es más frecuentemente empleado como sistema
de expresión es Saccharomyces cerevisiae, ya que gracias a su estudio y aplicación desde
hace más de un siglo se ha logrado catalogar como uno de los mejores organismos que

11
sin duda han beneficiado a numerosas subdisciplinas que conforman al campo de la
biotecnología (Baghban et al., 2019)
3.2 Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae, actualmente es conocido como levadura de cerveza o
levadura de panadería, nombres destacados por sus primeras aplicaciones, aunque sus
aplicaciones se han ampliado al paso de los años como la generación de
biocombustibles y productos farmacéuticos gracias a la facilidad de su manipulación
genética en conjunto con herramientas moleculares proporcionadas por investigaciones
(Nandy & Srivastava, 2018).

3.2.1 Características de S.cerevisiae

Dicho organismo eucariota unicelular es clasificado como un hongo o moho. Esta
levadura también es llamada “levadura en cienes” nombre que procede de una de sus
principales características su división celular, la cual es capaz de dividirse una vez
aproximadamente cada 90 minutos, en condiciones óptimas de laboratorio
respectivamente. S.cerevisiae fue el primer gen de tipo eucariota secuenciado y a partir
de esta aportación se ha convertido en un microorganismo industrial encaminado a la
producción bioquímica y por supuesto a la expresión de proteínas heterológamenete.
Fisiológicamente S.cerevisiae también es caracterizado por su tolerancia a pH altos,
además de concentraciones de azúcar y etanol elevadas y a su resistencia ante la presión
osmótica alta. Además de ser estudiado como un sistema de expresión, este organismo
ha funcionado como sistema de estudio para la regulación de expresión génica,
transducción de señales, envejecimiento, apoptosis, control del ciclo celular,
metabolismo, entre muchos otros procesos que ocurren dentro de este organismo (Duina
et al., 2014). Es importante mencionar que al ser un organismo utilizado en la industria
debe cumplir con normativas referentes a la salud del ser humano, siendo este un
organismo GRAS, titulo otorgado por la FDA reportado como no patógeno para seres
humanos, cuya propiedad lo cataloga como segura para su uso en la diversidad industrial
(Nandy & Srivastava, 2018). Incluso este microorganismo ha logrado sustituir al
primero que generó insulina biosintéticamente que fue E.coli, generando además
algunos productos análogos a la insulina, aportación que ha beneficiado al crecimiento
del mercado global, ya que la enfermedad que involucra esta hormona ha trascendido a
todo el mundo en donde destacan cifras importantes, lo cual genero US $ 12 mil
millones en 2011 a más de US $ 32 mil millones en 2018. En la actualidad, alrededor de
todo el mundo existen más de

12
1000 farmacéuticas, las cuales continúan incrementando sus ganancias llegando a
duplicar tras el aumento de la demanda por la población y por ende, de enfermedades.
Entre las farmacéuticas que ya se encuentran aprobadas por su producción de
biofarmacéuticos para su uso podemos mencionar Abbott, Amgen, Bayer, Biogen,
Boehringer Manheim, Centocor, Chiron, Eli Lilly, Genentech, Genzyme, Hoechst AG,
Hoffman-la-Roche, inmunomedics, Isis Pharmaceuticals, Novo Nordisk, Ortho Biotech
entre muchas otras (Nandy & Srivastava, 2018).

Esta es una de las grandes producciones a nivel industria en las que las cifras
verdaderamente son impactantes, aunque no debemos de dejar a un lado las demás
producciones que se reportan mediante la manipulación metabólica de. S.cerevisiae ya
que también se han logrado reportar una gran variedad de compuestos aromáticos como
lo son alcoholes, ácidos, esteres, acetatos, aldehídos, entre otros, lo cual ha llevado al
interés de los investigadores a la realización de modificaciones con fines de producción
referentes a compuestos que han reportado bioactividades proporcionadas por sus
potentes actividades, como lo es el caso de estudio en investigación dirigida a la
bioproducción de un flavonol especifico como lo es la naringenina mediante la
maquinaria de un organismo altamente estudiado como lo es Saccharomyces cerevisiae.

4. Evidencias experimentales en microorganismo

Los experimentos por generar productos mediante los últimos dos microorganismos
descritos han continuado como modelos de estudio, ya que posterior a la producción de
un metabolito se ha logrado optimizar los rendimientos y al mismo tiempo las
biosíntesis, a continuación, se presentan trabajos de investigación en donde esto ha sido
exitosamente
logrado

4.1 E.coli
Wu et al. (2014) realizaron una optimización modular de vías heterólogas para la síntesis
de novo de naringenina en Escherichia coli, donde la vía biosintética completa se
construyó utilizando módulos prefabricados para sobreproducir naringenina a partir de
D-glucosa. Además, se ensambló una nueva ruta modular de D-glucosa a L-tirosina y se
volvió a optimizar con los módulos óptimos identificados para permitir la síntesis de
novo de naringenina .Como resultado de este estudio, se logró producir naringenina a
partir de ácido cumarico, sin embargo, su alto costo y alta solubilidad en agua
restringieron la aplicación directa del ácido fenilpropanoide en aplicaciones a escala
industrial, los

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precursores utilizados para E. coli fueron desfavorables comercialmente, además,
algunos de los precursores son desfavorables debido a su baja seguridad alimentaria ya
que la mayoría de los productos químicos se obtienen mediante rutas de síntesis química
utilizando cloruro de acetilsaliciloilo proveniente del petróleo (Wu et al., 2014).

4.2 S.cerevisiae
Se realizó otro estudio por parte de Koopman et al (2012) en Saccharomyces cerevisiae
para producir naringenina a partir de glucosa, donde se utilizaron genes específicos de
biosíntesis de naringenina de Arabidopsis thaliana fueron seleccionados mediante
perfiles de expresión comparativos e introducidos en S. cerevisiae. Para permitir la
producción de naringenina, se construyó un vector de expresión episomal y uno
integrador que, juntos, albergan los cinco genes biosintéticos de flavonoides, con esto se
logró un aumento en la concentración de 40 veces más naringenina extracelular. Los
resultados de este estudio indican que Saccharomyces cerevisiae es capaz de llevar a
cabo la producción novo de naringenina y se logró optimizar el flujo hacia la vía de
naringenina. La expresión combinada de la vía del producto, la optimización de codones,
la mejora del suministro de precursores y la reducción de la formación de subproductos
condujeron a concentraciones de naringenina de más de 400 μM en cultivos por lotes
aeróbicos cultivados con glucosa. (Koopman et al., 2012).
 14
JUSTIFICACIÓN
La naringenina es una flavona usada ampliamente en sectores como la industria
farmacéutica y alimenticia, de la cual procede la fabricación de medicamentos o
suplementos en los cuales se aprovechan sus componentes bioactivos sin embargo,
existen limitaciones tanto energéticas como económicas sobre la producción y obtención
de naringenina, por lo cual nos planteamos utilizar una de los microorganismos
ampliamente estudiados y aplicados en el área de la ingeniería metabólica, aprovechando
de esta manera las características fisiológicas que esta presenta.

HIPÓTESIS
Sacharomyces cerevisiae es capaz de sintetizar naringenina mediante la expresión
heteróloga de los genes que codifican a las enzimas PAL, C4H, TAL, 4CL Y CHS.

OBJETIVOS
General
Establecer una ruta metabólica para la síntesis de naringenina en S. cerevisiae.

Específicos

• Evaluar la eficiencia de los plásmidos pETM6-HpaBC, pESC-HIS-4CL, pESC

LEUCHS-CHI para la expresión de los genes.
• Evaluar el rendimiento de S.cerevisiae para la producción de naringenina.

15
Corroborar si el
ESTRATEGÍA

EXPERIMENTAL 3.
4. Identificar las enzimas

las mejores características sintetizar el precursor

cinéticas

1. Búsqueda de la ruta de 12.

síntesis de naringenina Selección de las 7. Identificar las rutas
transformantes (por
9. Unir los productos competentes
marcador nutrimental o gen
(amplificaciones) de PCR
de selección)
de cada gen al vector

5. Realizar un análisis de
los pará metros cinéticos de
las enzimas identificadas
2. Identificar la molécula
precursora de la vía 12. Selección de las
transformantes (por
marcador nutrimental)
10. Hacer una validación
posterior al PCR (para
comprovar la inserción de
los genes)

8. Amplificar por PRC la

secuencia codificante de
6. De acuerdo al análisis, 12. Caracterización y
cada gen de su respectivo
seleccionar los organismos organismo plataforma expresión de las proteínas
organismo de orgen
y los respectivos genes que (Saccharomyces por Wester Blot
codifican a las enzima con cerevisiae) es capaz de que
 no forman parte de la ruta las características cineticas Transferir el vector
del organismo de las enzimas recombinante pETM6-
plataforma necesarias para HpaBC al organismo
la sintesis de naringenina plataforma mediante una
electroporación
8.
Realizar las
11.
modificaciones en base a

16
METODOLOGÍA
Para la búsqueda de la ruta de síntesis de naringenina se ingresó a la base de datos de
referencia para el mapeo de rutas (KEGG). Posteriormente se corroboró si S. cerevisiae
sintetizaba el precursor que es fenilalanina. Una vez identificadas las enzimas que
participan en la ruta se procedió a analizar sus parámetros cinéticos en la base de datos
BRENDA la cual es un sistema de información de enzimas. Se seleccionaron aquellas
que presentaron las mejores características cinéticas para una mayor eficiencia. Los
genes que codifican para estas enzimas serán extraídos de los organismos que mejor los
producen respectivamente. Serán diseñados rio arriba y rio abajo para tener únicamente
la secuencia de interés de los genes para que puedan ser introducidos en el plásmido. Las
secuencias codificantes serán amplificadas mediante un PCR para su posterior inserción.
Después se identificaron los plásmidos, estos fueron pETM6-HpaBC, pESC-HIS-4CL,
pESC-LEUCHS-CHI ya que estos llevan colectivamente los cinco genes requeridos para
la síntesis de naringenina.

Existen factores que afectan la síntesis de flavonoides/estilbenoides y los flujos de las

vías, por ejemplo, la competencia por la fenilalanina ya que esta normalmente se
suplementa con una concentración estándar de 0.3 mM, por lo cual se suministrará
fenilalanina exógena al medio en diferentes concentraciones (de manera experimental).

Una vez identificadas las enzimas el paso siguiente consistió en elegir la cepa
recombínate W303 de S. cerevisiae la cual se aplica en estudios bioquímicos y
genéticos. Ésta será donada por Rodney Rothstein, Columbia University.

La transformación de la cepa se realizará mediante un choque térmico y con

transformación química convencional utilizando MgCl2 para obtener una mayor
3
eficiencia con un voltaje de 20 kV 3x10 UFC/20 µg, esto se realizará mediante una
electroporación donde lleva una suspensión de la célula mientras que el voltaje es
aplicado y se pone en contacto y con dos electrodos entran en contacto con la
suspensión, esto ser dependiendo del número de colonias obtenidas.

Para comprobar si el vector recombínate se encuentra en las transformantes y por ende,

en los genes de interés se procede a la selección de transformantes o mutantes para lo
cual se aislaran las células obtenidas o transformadas esto mediante el marcador
nutrimental que forma parte del vector, implementando un medio de cultivo más la
adición del nutriente, donde las colonias sobrevivientes serán las células que
efectivamente se

17
introdujeron ala vector recombínate y aquellas que no sobrevivan se le atribuirá a la
ausencia del vector, es decir, no se insertó y por lo tanto no se transformaron las células.

Posterior a la selección de las transformantes se realiza la caracterización de las

proteínas usando método de electroforesis SDS-Page por su amplio uso en la biología
molecular y la técnica de Western Blot.

18
RESULTADOS
Se realizó la búsqueda de la ruta de síntesis de naringenina mediante la Base de datos de
KEGG PATHWAY.

Se seleccionó el del mapa “Biosíntesis de flavonoides” ya que la naringenina es un

metabolito clasificado como flavonoide.
 19

La molécula precursora principal para la biosíntesis de los flavonoides parte de la ruta de

biosíntesis de fenilpropanoides.

La síntesis de naringenina en primera instancia parte de la fenilalanina, posteriormente

es
producido el trans-ácido cinámico, enseguida se origina el ácido-p-cumarico, el cual da
como siguiente producto p-cumaroil-CoA (productos señalados en color rojo).
 20

Obtenido el p-cumaroil-CoA la siguiente reacción conduce a dar naringenina chalcona,

siendo a su vez la molécula que posteriormente da narinegenina.

Ya que el microorganismo de interés para la producción de naringenina es S.cerevisiae

se realizó la búsqueda del mismo con el fin de observar si la fenilalanina es sintetizada
por la levadura.
 21

A continuación, se observó que S.cerevisiae es capaz de producir el metabolito de

interés,
en donde se determina que se tiene a los genes para esta producción en el organismo de
interés.

Ahora, de acuerdo a la vía de síntesis de nuestro metabolito de interés se identificaron

las
enzimas requeridas (señaladas en color azul) para su producción a partir de fenilalanina
en S. cerevisiae.

22

Selección de enzimas respectivamente.

Selección de enzimas respectivamente.

 23

Selección de enzimas respectivamente.

Selección de enzimas respectivamente.

 24

Una vez identificadas las enzimas que participan en la ruta, procedemos a analizar sus
características cinéticas eligiendo aquellos organismos que presentan los mejores
parámetros respectivamente, seleccionando así los genes procedentes de ellos, los cuales
codificaran para las enzimas de nuestro interés. El primer enzima a analizar es la
fenilalanina amoniaco liasa (PAL) la cual participa en la reacción en donde la
fenilalanina se convierte en transácido cinámico.

En este caso la característica cinética de la cual depende la selección del organismo es la

relación de Kcat/KM definida como la eficiencia catalítica de la enzima, donde el valor
alto de este parámetro indica una mejor eficiencia para la conversión de sustrato a
producto, en este el gen de origen pertenece al organismo Nicotiana tabacum, (señalado
en color verde).

25

El siguiente análisis corresponde a la enzima trans-cinamato 4-monooxigenasa es la

encargada de catalizar la reacción que convierte el ácido trans-cinámico en ácido p
cumarico.

En este caso la base de datos no cuenta con un registro previo de la eficiencia catalítica,
por lo cual se procede a analizar el parámetro del número de cambio o también llamado
kcat, el cual nos indica la capacidad o rapidez de la enzima para la conversión de sustrato
a producto, entre mayor sea este valor, mayor será la capacidad de realizar la reacción,
en este caso el valor más alto es perteneciente al organismo Ruta graveolens, planta
conocida como ruda (señalada en color verde).
 26

La siguiente enzima a analizar es la 4-cumarato- CoA- ligasa (4CL), encargada de

convertir el ácido p-cumarico en trans-4-cumaroil-CoA. Tiene como sustrato a 4-
cumarato.

Al analizar la eficiencia catalítica, el número más alto correspondía al organismo

Populus tomentosa, sin embargo, de acuerdo a la información arrojada por la base de
datos, el pH y la temperatura no se encuentran especificados, por lo cual se optó a la
selección del valor anterior perteneciente al organismo Nicotiana tabacum (señalados en
color verde).

27
Posteriormente se analiza la enzima chalcona sintasa (CHS) la cual participa en la
reacción que involucra el paso de 4-cumaroil-CoA (tambien llamado p-cuamroil-CoA) a
naringenina chalcona.

Al tomar el valor más alto correspondiente a la eficiencia catalítica, se observó que la

base de datos no tiene registros específicos de pH y temperatura para los dos genes
procedentes del organismo Rheum australe (planta medicinal originaria del Himalaya),
por lo cual se seleccionó el antepenúltimo valor de la tabla correspondiente al organismo
Antirrhinum majus la cual es denominada como una planta nativa del mediterráneo
(organismo señalado en color verde).

28
La última enzima que participa en la síntesis de nuestro metabolito de interés es aquella
que cataliza la reacción en la que la naringenina chalcona pasa finalmente a ser
narigenina, esta enzima es la isomerasa chalcona (CHI).

Al determinar el organismo nos encontramos con que el valor más alto de la eficiencia
catalítica especifica un valor de pH para la enzima, pero no una temperatura, por lo cual
se descartó al organismo Eubacterium ramulus, optando por la enzima proveniente del
organismo Deschampsia antarctica conocida como pasto antártico (señalada en color
verde).

29
 TABLA DE REACCIONES DE PRODUCCIÓN DE NARINGENINA
Numero de facturación. [1/S]
[mM] Kcat/Km
N° Reacción Nombre de la
D-glucosa 1-fosfato a [1/mMs-1] Organismo
enzima Clave Km

1
alfa-D-glucosa 6fosfato Fosfoglucomutasa 5.4.2.2 0.016 .74 714.3 Fusarium oxysporum
D-eritrosa 4-fosfato a
Glucosa-6-fosfato
2 3
isomerasa 5.3.1.9 0.11 2765 1700 Nicotiana
tabacum
Transcetolasa 2.2.1.1 0.92 28.642 910 Estipitis
alfa-D-glucosa por Scheffersomyces
6fosfato a beta
Dfructosa 6-fosfato beta-D-fructosa 6- fosfato
3-desoxi
a D-eritrosa 4- fosfato
4 5 7-fosfato de 2deshidro-3- 2deshidro-3-desoxi 2.5.1.54 0.009 122 2400
desoxi-Darabino Escherichia coli
7fosfoheptulonato sintasa
heptonato

7-fosfato de
3- deshidroquinato

sintasa 4.2.3.4 0.00055 25000 2807 Escherichia coli

3- deshidroquinato
Darabino-heptonato a 3-deshidroquinato 4.2.1.10
deshidratasa 0.03 310 5800 Salmonella enterica

6 3-deshidroquinato a 3-deshidroeshikimato Shikimato

deshidrogenasa 1.1.1.25 0.0046 428 3620 Staphylococcus aureus

7 3-deshidroeshikimato a Ácido shikímico

8 Ácido shikímico a
2.7.1.71
Shikimato 3-fosfato Quinasa shikimato 0.039 60 90 Mycobacterium tuberculosis
Shikimato 3-fosfato a 5-O- 3-fosfoshikimato 1- Escherichia coli
(1-carboxivinil) - 3-fosfosquimato carboxiviniltransfe rasa
9 2.5.1.19 0.0024 100 930000000
5-O- (1-carboxivinil)
3-fosfosquimato a Ácido corísmico
Corismato sintasa 4.2.3.5 0.0013 0.87 ----
------
10

11 Ácido corísmico a

Ácido prefénico Corismato mutasa 5.4.99.5 0.03 366000 686.6 Bacillus subtilis

12 Ácido prefénico a Fenilpiruvato 16 ácido p-cumarico a pCumaroil-CoA

13 Fenilpiruvato a Lfenilalanina 17 p-Cumaroil-CoA a Naringenina chalcone

Prefenato deshidratasa
4.2.1.51 0.01 2962 4772.1 Pinus pinaster
14 L-fenilalanina a ácido trans-cinámico
Triptófanofenilpiruvato
15 ácido trans-cinámico a ácido p-cumarico transaminasa 2.6.1.28 1.43 9.1 ----- Aspergillus nidulans
 p-cumaroil CoA ligasa
6.2.1.12 0.0091 88.68 2652 Nicotiana tabacum
Fenilalaninaamoniaco

liasa 4.3.1.25 0.101 16.32 29.5 Nicotiana tabacum Naringeninacalcona

sintasa 2.3.1.74 0.0078 1.27 25.7 Antirrhinum majus

Trans-cinamato

4monooxigenasa 1.14.14.9 1 0.0005 0.000699 161.8 Ruta graveolen

30
18 Naringenina chalcone a Naringenina calcona-flavanona 5.5.1.6 0.0099 228.2 23060 Deschampsia antarctica
Isomerasa de
 31
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