CURVA DE CALIBRACIN DE GLUCOSA, ETANOL Y

PROTENAS


I. INTRODUCCIN
En un proceso biotecnolgico es deseable el aumento de la poblacin de los microorganismos a
los cuales se les refiere normalmente con el nombre de biomasa, as como tambin es deseable
la obtencin de un producto secundario o resultante.
Para que la biomasa muestre un crecimiento en su poblacin, es necesario que los
microorganismos cuenten con condiciones ambientales ptimas para su desarrollo. Estos
microorganismos tienen un metabolismo cambiante y poco predecible, lo cual indica; que si hay
cambios, aunque sean de poca magnitud en las condiciones (temperatura, pH, velocidad de
agitacin, etc.), y los elementos que componen el medio ambiente en el cual se encuentran,
afectan de manera directa el desarrollo de los microorganismos impidindoles crecer. (Flores-
Morfin, J., 1999)
La gran mayora de mtodos instrumentales requieren una calibracin, proceso que relaciona la
seal analtica medida con la concentracin del analito. Uno de los mtodos ms frecuentemente
utilizados es el uso de una curva de calibracin.
Para realizar el mtodo de la curva de calibracin se procede a realizar una serie de soluciones
de concentracin conocida de analito, los cuales se introducen en el instrumento y se registra la
seal instrumental. Normalmente esta seal se corrige por medio de la seal de una blanco
analtico en el que se establece el cero de absorbancia, este blanco contiene todos los
componentes de la matriz de anlisis (ejemplo: solucin de glucosa, etanol) a excepcin de
analito que se desea medir. (Skoog, D. A., 2001)
II. MARCO TERICO
La medida de la concentracin mediante un mtodo instrumental se basa en la existencia de una
relacin proporcional entre dicha concentracin y la seal analtica o respuesta que genera un
instrumento.
Generalmente esta relacin es lineal, de modo que puede expresarse como: y =a+b C
A,
donde C
A
es la concentracin del analito, y la seal medida, a la ordenada en el origen y b la
pendiente de la recta.
La ecuacin de la recta se obtiene mediante calibracin con disoluciones de concentracin
perfectamente conocida (disoluciones patrn) a partir de la medida de la seal analtica
proporcionada por stas. Los pares de valores concentracin-seal se ajustan a una recta, a
partir de la cual pueden obtenerse la concentracin del analito en muestras desconocidas.
La sensibilidad de calibracin es la pendiente de la curva de calibrado. Por tanto en una curva de
calibrado lineal la sensibilidad es siempre la misma y no va a depender de la concentracin, ya
que para que se cumpla y =a+b C
A
las concentraciones deben tener una incertidumbre
insignificante.
La curva de calibracin debe de presentar aspectos importantes como: Exactitud, precisin,
repetitividad, reproducibilidad. En general, la etapa de calibracin y la obtencin de la
concentracin de analito en una muestra constan de los siguientes pasos:
Preparacin de los patrones
Obtencin de la relacin seal-concentracin
Uso de la recta de calibrado
III. OBJETIVOS
La prctica tuvo como objetivos principales determinar la curva de calibracin de azcares
reductores usando DNS, as como tambin plantear la metodologa de uso de este mtodo
analtico para conocer los distintos parmetros que son importantes en el rendimiento de un
bioproceso.
IV. MATERIALES Y MTODOS

Agua destilada
Tubo con tapa rosca
Balanza analtica
Refractmetro de Abbe
Reactivo DNS
Glucosa

V. PROCEDIMIENTO

Determinacin de azcares reductores
A.1. Mtodo de DNS:
1. Se agreg 1ml de 1 sobrenadante obtenido (que contenga 20-200mg de glucosa en 1000
mL), en tubos con tapa rosca y 1ml del reactivo de DNS por las paredes del tubo. Se
tap con tapa rosca y agitarlos.
2. Se coloc la muestra en ebullicin durante 5
3. Posteriormente se aadi 10 ml de agua destilada, agitar y dejar en reposo por 20.
4. Se ley la absorbancia a 540nm contra un blanco que contiene agua destilada.
5. La concentracin se obtendr por interpolacin de la absorbancia con la curva de
calibracin del carbohidrato o de acuerdo de la ecuacin de la recta.
6. Se expres el resultado en g/L de Glucosa.
A.2. Solucin de DNS (25 ml)
1. Disolver 0,4 g de NaOH en 12.5 ml y agregar 7.5 g de tartrato sdico potsico, calentar
hasta disolverlo.
2. Lentamente adicionar 0,25 g de cido 3,5-dinitrosalicilico agitando bajo calentamiento.
3. Aforar a 25 ml con agua destilada. Almacenar a temperatura ambiente en botellas
oscuras.
4. Realizar la determinacin de azucares reductores mediante a 1ml con agua destilada.
5. Elaborar una grfica relacionando las absorbancias con las concentraciones y
determinar el rango lineal.

Determinacin de protenas
*El siguiente procedimiento fue planteado en prctica mas no se pudo realizar por deficiencia de
reactivos, Los resultados en la parte del final del informe, fueron extrados de prcticas
realizadas anteriormente.
B.1. Mtodo Bradford
1. Agregar 0.1ml de muestra conteniendo 10 a 100 ug de protena, en tubos 13x100.
2. Al tubo anterior agregar 2 ml del reactivo de coloracin de protena. Mezclar por
inversin o por agitacin suave.
3. Leer la absorbancia a 595nm despus de 5 min contra un blanco reactivo.
4. Elaborar una grfica relacionando las absorbancias con las concentraciones y
determinar el rango lineal.

VI. RESULTADOS
Curva de calibracin de azucares
Tabla 1. Resultados final de absorbancia en la Prueba DNS














Tubo
N
Solucin estndar de
Glucosa (0.1 g. en 50
ml.) en ml.
Agua
Destilada
(ml.)
Concentracin
(g/L)
Absorbancia
(540 nm)
1 0 1 Blanco 0.008
2 0.1 0.9 0.2 0.086
3 0.2 0.8 0.4 0.171
4 0.3 0.7 0.6 0.288
5 0.4 0.6 0.8 0.385
6 0.5 0.5 1.0 0.493
7 0.6 0.4 1.2 0.595
8 0.7 0.3 1.4 0.723
9 0.8 0.2 1.6 0.815
10 0.9 0.1 1.8 0.919
11 1 0 2 1.043
Figura 1. Muestras para la determinacin de azucares en DNS




Curva de calibracin de protenas
TUBO
N
Stock / uL H20
destilada uL
Concentracin Abs. 595nm
1 0 300 0 0.002
2 10 290 10 0.008
3 20 280 20 0.015
4 30 270 30 0.025
5 40 260 40 0.028
6 50 250 50 0.045
7 60 240 60 0.049

Tabla 2. Resultados final de absorbancia en prueba Bradford



y = 0.5236x - 0.0212
R = 0.9983
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Curva de Calibracin de la Glucosa
y = 0.0008x + 0.0001
R = 0.9763
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0 10 20 30 40 50 60 70
Curva de calibracin para Protenas


VII. DISCUSIN


VIII. CONCLUSIONES

Se desarroll con eficacia un procedimiento para determinar la concentracin de
(azcares reductores) por el mtodo del cido 3,5 dinitro saliclico (DNS); la
determinacin de estos azcares se realiz para obtener una curva de calibracin,
con este reactivo (DNS) que tiene capacidad de oxidar a los azcares reductores
dando resultados colorimtricos que se pueden medir con una longitud de onda
de 540nm en el espectrofotmetro.
Las grficas muestran resultados satisfactorios ya que el valor de R, obtenidos
tanto en la prueba de azcares como de Protenas fueron de 0.9983 y 0.9763
respectivamente.
Existe una relacin entre intensidad de color y la concentracin de la sustancia,
con base en la Ley de Lambert-Beer podemos afirmar que la absorbancia de una
solucin es directamente proporcional a su concentracin a mayor nmero de
molculas mayor interaccin de la luz con ellas; tambin depende de la distancia
que recorre la luz por la solucin a igual concentracin, cuanto mayor distancia
recorre la luz por la muestra ms molculas se encontrar; y por ltimo, depende
de , una constante de proporcionalidad denominada coeficiente de extincin
que es especfica de cada cromforo.


IX. BIBLIOGRAFA
1. Skoog, D. A., Holler, F.J. & T. A. Nieman (2001) Principios de Anlisis Instrumental. 5
ta Edicin, Editorial McGrawHill.
2. Gamero-Inda, E.; Flores-Morfin, J.; Fuzzy control of a biotechnology process Fuzzy
Information Processing Society, 1999. NAFIPS.