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III. CROMATOGRAFÍA DE COLUMNA

El proceso que consiste en hacer pasar un líquido o un gas a lo largo de una columna cromatográfica se denomina
elución. Como se observa en la figura 21, la fase móvil que entra a la columna se llama eluente. Al salir de la columna se llama
eluato o efluente.

Figura 21. Diferencia entre eluente y eluato.

La velocidad de la fase móvil en una columna puede expresarse como flujo volumétrico (gasto en volumen, mL/min) o
como gasto lineal, cm/min. Generalmente se trabaja de modo que el flujo de solvente que pasa por la columna sea constante
durante todo el experimento.

Supongamos que inyectamos a la columna cromatográfica una mezcla que contiene tres componentes, a los que
llamaremos A, B y C. En la figura 22 se muestra un cromatograma idealizado que se obtendría en estas condiciones.

Figura 22. Parámetros que pueden identificarse en un cromatograma.

 Cromatograma. Es la represtación gráfica del tiempo que transcurre desde la inyección contra la respuesta registrada por el
detector.

 Tiempo de retención (tR) Es el tiempo necesario después de la inyección de la mezcla para que la muestra alcance el
detector. Manteniendo las mismas condiciones experimentales, cada substancia tendrá su propio tiempo de retención, único y
característico de ella. El tiempo de retención se mide desde el inicio de la inyección hasta la parte más alta del pico
cromatográfico. Este tiempo puede medirse también en forma indirecta como el volumen de fase móvil que eluye entre la
introducción del soluto y la aparición del máximo del pico del mismo, lo que se conoce como volumen de retención (VR).

 Tiempo muerto (tM) Es el tiempo de retención para un soluto inerte, que no sea retenido en la columna. Notar que t M es en
realidad el tiempo necesario para que la fase móvil recorra la longitud de la columna. En los cromatogramas reales, t M no
siempre aparece. En cromatografía de gases, cuando se usa un detector de ionización de flama, puede inyectarse aire junto
con la muestra para que aparezca el pico de aire correspondiente al tiempo muerto. El volumen de la fase móvil necesario
para desplazar un soluto no retenido desde el inyector al detector se conoce como volumen muerto (V M) o volumen de la fase
móvil en la columna.

 Tiempo de retención corregido (tR’) Se define como la diferencia entre el tiempo de retención y el tiempo muerto.
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tR’ = tR – tM
Si todos los componentes de la mezcla interaccionan con la fase estacionaria, ninguno de ellos eluirá al volumen de
retención. Puede darse el caso de que el pico correspondiente al tiempo muerto no aparezca tampoco en el caso de que el
detector no sea sensible a ese compuesto.

 Retención relativa (α) Para caracterizar las distancias entre los máximos de dos picos cromatográficos consecutivos, se
utiliza el factor de selectividad o de retención relativa, definido como la razón entre el tiempo de retención neto de los dos
componentes, que puede calcularse directamente del cromatograma.
tR2
  tR2  t R1 paraque   1
t R1
Cuando α = 1, es evidente, según la ecuación, que la resolución es nula, independientemente del número de platos
teóricos que tenga la columna, ya que entonces t R1 = tR2. La selectividad de una columna se puede mejorar modificando el
coeficiente de distribución, K, y el volumen de la fase estacionaria, V S. El coeficiente de distribución, K, se modifica alterando
cualquiera de los siguientes parámetros:

a) cambiando la fase móvil, por ejemplo, variando la composición, el pH, la polaridad y la fuerza iónica.
b) sustituyendo la fase estacionaria. En este caso, se puede modificar el tamaño del poro del gel y la superficie del
adsorbente.
c) variando la temperatura
d) modificando el soluto

En cualquier caso, es necesario mantener los valores del factor de capacidad, k, en el intervalo óptimo (2  k  10)
cuando hagamos cambios en el valor del factor de selectividad, . Una de las formas más eficaces de mejorar la separación es
modificar la composición de la fase móvil.

 Factor de retención (k) También llamado factor de capacidad, se define como la relación entre el tiempo de retención
corregido y el tiempo muerto.

tR  tM tiempo que pasa el soluto en la fase estacionaria

k  
tM tiempo que pasa el soluto en la fase móvil

Donde k es un parámetro independiente del caudal y de la longitud de la columna, varía con las condiciones operatorias.
k, que no es una constante, es el parámetro más importante en cromatografía para definir el comportamiento de las columnas.
Considera la capacidad de la columna para retener cada compuesto (y no la capacidad en el sentido de cantidad necesaria que no
hay que rebasar porque si no, se satura). Para no prolongar el tiempo de análisis se intenta no alcanzar valores elevados de k.

Es importante recordar que todos los parámetros anteriores pueden reportarse también en términos de volumen en vez
de tiempo. Es decir, existe un volumen de retención, un volumen muerto, un volumen de retención corregido, etc. La relación
entre volumen y tiempo es muy simple:

VR  t R  F
VM  t M  F

donde F es el flujo volumétrico de solvente (en mL/s).

 Resolución (Rs)
El objetivo principal de la cromatografía es separar una mezcla en sus componentes en un periodo de tiempo razonable.
La Resolución es la separación entre los picos de un cromatograma, lo que implica que se pueda observar mejor la concentración
de cada componente.
La resolución aumenta cuando aumenta la longitud de la columna y/o la retención relativa. Una resolución apropiada es
de por lo menos de 1.5.
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t R 2  t R1
Resolución 
W prom
ó

N    1  k 2 

Resolución   
4    1  k prom 


K2 es el factor de retención del componente que más se retiene. N es el número de platos teóricos.
Para obtener altas resoluciones, los tres factores deben maximizarse. Un incremento en N, por alargamiento de la
columna genera un incremento en tiempo de retención y en ensanchamiento de banda, lo cual no siempre es deseable; en lugar de
ello, podemos incrementar el número de platos y reducir la HETP reduciendo el tamaño de las partículas de la fase estacionaria.
Se encuentra a menudo que controlando el factor de retención, k, las separaciones mejoran enormemente. Esto puede
ser logrado cambiando la temperatura (CG) o la composición de la fase móvil (CL).
El factor de selectividad, α, también puede manipularse para mejorar las separaciones. Cuando α es muy cercano a la
unidad, optimizar k, e incrementar N no es suficiente para obtener una buena separación en un tiempo razonable. En estos casos,
primero se optimiza k, y entonces α se incrementa apor uno de los siguientes procedimientos:
1) Cambio en la composición de la fase móvil
2) Cambio de la temperatura de la columna
3) Cambio en la composición de la fase estacionaria.
4) Usando efectos químicos especiales (como incorporar especies que formen complejos con uno de los solutos en la fase
estacionaria).

Se puede calcular numéricamente el factor de resolución (o simplemente resolución) a partir del cromatograma (figura
23):

Figura 23. Simulación de dos picos cromatográficos por yuxtaposición más o menos aproximada de dos
curvas gaussianas idénticas. El aspecto visual correspondiente junto con los valores de R se muestra en las
gráficas. A partir de R = 1.5 se considera que los picos están resueltos, en este caso los valles entre los
picos son aproximadamente del 2%.

Para dos picos de igual tamaño, una resolución de 1.5 corresponde a una superposición de solo 2% entre sus áreas.
Como la resolución es una medida cuantitativa de una separación satisfactoria, constituye una forma útil de determinar si un
cambio en las condiciones experimentales permitirá una mejor separación. Un pico cromatográfico ideal corresponde a una curva
de distribución gaussiana o normal que se caracteriza por su desviación estándar, .
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Figura 24. Efecto de la longitud de la columna en la resolución. Se ilustran distintos experimentos en

cromatografía de gases al modificar solamente la longitud de la columna capilar. Al duplicar la longitud de la
columna la resolución se multiplica por 1.41.
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CROMATOGRAMA Y SU INTERPRETACIÓN

Los siguientes términos son los utilizados en un cromatograma típico y recomendados por la IUPAC:
 Line Base  Altura del Pico
 Pico Cromatográfico  Ancho del Pico
 Base del Pico  Ancho del Pico a la mitad de la Altura
 Área del Pico
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ALTURA DEL PICO: Medida que se efectúa, para cada pico de interés, desde la línea base hasta el máximo del pico.
Los errores de malas mediciones se pueden atribuir a:

 Insuficiente Resolución
 Variaciones en la línea base
 Picos extremadamente pequeños

Las desviaciones en la línea base se pueden compensar por interpolación de ésta entre el prinpio y el final del pico.

ÁREA DEL PICO: Existen varias técnicas para la determinación del Área de un Pico Cromatográfico:

INTEGRACIÓN MANUAL
A) Métodos Geométricos

 Triangulación: En esta técnica se trazan líneas tangentes a cada lado del pico. La altura se mide desde la línea base
hasta la intersección de las dos tangentes. El ancho se mide tomando la intersección de las dos líneas tangentes con
la línea base. Luego se utiliza la fórmula A=1/2*Altura del Pico* Base del Pico. Las limitaciones de esta técnica estan
en el trazado de las líneas tangentes, un pequeño error al trazar las tangentes puede afectar la medida de la altura.

 Altura por ancho a la mitad de la Altura:

B) Métodos Mecánicos
 Planimétricos

o Corte y Pesada: Esta técnica requiere recortar el pico del cromatograma, luego pesarlo en una balanza
analítica. El recorte y pesada depende mucho de la habilidad del operdor. Pueden introducirse errores por
cambios en la humedad del papel, la grasa de las manos del operador, homogeneidad del papel.
Generalmente se recomienda utilizar una fotocopia del cromatograma para no destruir el original.

INTEGRACIÓN AUTOMÁTICA

A) Electromecánica
B) Electrónica

FORMA DE PICOS CROMATOGRÁFICOS.

Los picos cromatográficos tienen forma gaussiana cuando el coeficiente de reparto,

K = Cs (concentración del soluto en la fase estacionaria)

Cm (Concentración del soluto en la fase móvil)
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es independiente de la concentración del soluto en la columna. En las columnas reales, al aumentar la concentración del soluto,
K varía, y las bandas se distorsionan. La representación de Cs en función de Cm (a una temperatura dada) se llama una
isoterma. En la figura 25 se muestran tres isotermas comunes, y la forma de las bandas que resultan. La isoterma del centro es
la isoterma ideal, que origina un pico simétrico.

Figura 25. Isotermas comunes y sus formas de banda cromatográfica resultantes.

La isoterma central es ideal, y da por resultado un pico simétrico. La simetría de un pico cromatográfico sirve para
evaluar la distribución del área del pico alrededor de un eje definido por su punto máximo. Es decir compara los dos lados del
pico separados por una línea vertical que cruza el máximo. La isoterma superior de la figura 25 se produce por sobrecarga de la
columna, es decir, por aplicarle demasiado soluto. A medida que aumenta la concentración del soluto, éste se solubiliza cada
vez más en la fase estacionaria. Llega a haber tanto soluto en la fase estacionaria que ésta empieza a parecerse al soluto.
(Existe una regla empírica en química que dice: "lo semejante se disuelve en lo semejante".) El frente de un pico sobrecargado
presenta una concentración cada vez mayor. Al aumentar la concentración, la banda se sobrecarga. El soluto es tan soluble en
la zona sobrecargada, que apenas queda ya nada de él después del pico.
La banda emerge de la columna gradualmente, pero acaba bruscamente. La isoterma inferior de la figura 25 se origina cuando
cantidades pequeñas de soluto se retienen con más fuerza que cantidades grandes. Eso conduce a una subida brusca de
concentración al principio de la banda, y a una larga "cola" de concentración con descenso gradual de la concentración después
del pico. Se produce una larga cola cuando algunos sitios retienen el soluto más fuertemente que otros.

Las principales causas de los picos asimétricos pueden ser: sobrecarga de muestra, columna en malas condiciones,
acumulación de material en la entrada de la columna, disolvente inadecuado para la muestra, efectos extracolumna,
amortiguación inadecuada, contaminación por metales pesados, etc.

Figura 26. Definición del factor de asimetría FA y el factor de coleo FC (según USP).
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TEORÍA DE LOS PLATOS EN CROMATOGRAFÍA

La eficacia de una columna cromatográfica es la que determina la anchura del pico y depende, entre otros factores, de
la velocidad de flujo, el tamaño de las partículas de la fase estacionaria, el diámetro de la columna, etc. Para caracterizar la
eficacia de una columna cromatográfica, se emplea el número de platos teóricos, N.

El proceso de separación continuo que ocurre en una columna puede considerarse como una cantidad muy grande de
equilibrios a contracorriente entre la fase móvil y la estacionaria. Podemos imaginar que la columna está formada por muchos
segmentos, en cada uno de los cuales ocurre un equilibrio (como una etapa sencilla de equilibrio). Cada uno de estos
segmentos imaginarios es un plato teórico, y la altura equivalente a un plato teórico (HETP ó AEPT) se obtiene:

Longitud de la columna L
HETP  
Número de etapas de equilibrio N

HETP es un parámetro que se calcula para compuestos de referencia, ya que permite comparar columnas de longitud
diferente, aunque no se trate de un valor constante. El valor va a depender de los compuestos elegidos y de las condiciones en
que se desarrolla el proceso.

Una columna cromatográfica que tiene muchos platos teóricos realizará una mejor separación que otra columna con
un número de platos menor. Las columnas cromatográficas modernas pueden tener desde unos miles hasta cientos de miles de
platos teóricos, lo que da una idea de su poder de separación. Para entender cómo se calcula el número de platos de una
columna, obsérvese la figura 27.

Figura 27. Cálculos para el número de platos teóricos.

 W Es la amplitud del pico en su base, y recibe el nombre de ancho de banda. Es importante notar que W se mide en la
línea base del cromatograma suponiendo que el pico es triangular.

 h Es la altura del pico medida desde la línea base.

 W1/2 Es la anchura del pico medida a la mitad de la altura.

Las fórmulas para calcular el número de platos son distintas dependiendo de si se usa el ancho del pico en su base o a
la mitad de la altura. El número de platos se calcula como sigue:
16 tr 2
N
W2

O bien, si usamos la anchura a la mitad de la altura,

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5 . 55 tr 2
N
2
W1 / 2

Es importante emplear unidades consistentes en estas fórmulas. Así, si el tiempo de retención está en minutos, el
ancho de pico tendrá que expresarse en minutos. Puede usarse volumen de retención en vez de tiempo siempre y cuando el
ancho de pico se exprese también en unidades de volumen.

N es un parámetro relativo, puesto que depende del soluto elegido de las condiciones operatorias. Se trata de un valor
de referencia que no basta para saber se la columna permite alcanzar una separación dada.

ECUACIÓN DE VAN DEEMTER

Una descripción realista del proceso que se realiza en la columna depende del tiempo que le tome al soluto establecer
un equilibrio entre la fase movil y la estacionaria (a diferencia del modelo de plato teorico que supone que este equilibrio es
infinitamente rápido). La forma de banda resultante de un pico cromatográfico es afectada por la velocidad d elusión. También es
afectado por las diferentes trayectorias disponibles para las moléculas del soluto que viajan entre partículas de fase estacionaria.
Para considerar los diversos mecanismos que contribuyen al ensanchamiento de banda, podemos considerar la ecuación de
Van Deemter para la altura de platos teoricos:

HETP = A + B/u + Cu

Donde u es la velocidad promedio de la fase móvil. A, B, y C, son factores que contribuyen al ensanchamiento de banda.

Factor A.- Factor del empaque, (Eddy diffusion )

La fase móvil migra a través de la columna, la cual esta empacada con la fase estacionaria. Las moléculas del soluto
tomarán diferentes trayectorias a través de la fase estacionaria, de manera aleatoria. Esto puede causar ensanchamiento de la
banda del soluto, porque los diferentes caminos, tendrán diferentes longitudes.

Factor B. Factor de difusión longitudinal.

La concentración de analito es menor en los bordes de la banda que en el centro. El analito difunde del centro a las
orillas. Esto ocasiona ensanchamiento de banda. Si la velocidad de la fase móvil es alta, entonces el analito pierde menos
tiempo en la columna, con decremento de los efectos de difusión longitudinal.

Factor C. Factor de resistencia a la transferencia de masa.

Al analito le toma un cierto tiempo llegar al equilibrio entre las fases móvil y estacionaria. Si la velocidad de la fase
móvil es alta, entonces, el analito en la fase móvil se moverá adelante del analito en la fase estacionaria. La banda del analito se
ensanchará. Aumentar la velocidad de la fase móvil, empeorará el ensanchamiento.

Gráfico de Van Deemter.

En estos gráficos se muestra la representación de la altura del plato teorico contra la velocidad lineal promedio de la fase móvil.
Estos gráficos pueden emplearse para determinar el valor óptimo para la velocidad del flujo de la fase móvil
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Altura de plato
- mínima altura de plato
- Velocidad óptima

Velocidad de la fase móvil

Figura 28. Gráfico de Van Deemter.

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