BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS-ICUAP

POSGRADO EN CIENCIAS QUÍMICAS
ÁREA DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

ESTUDIO DE LAS SUBPOBLACIONES DE LA GLÍA EN

EL HIPOCAMPO DE RATA CON SÍNDROME
METABÓLICO

PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN PARA OBTENER EL

GRADO DE MAESTRA EN CIENCIAS QUÍMICAS
PRESENTA:
QFB GETSEMANÍ GONZÁLEZ LÓPEZ

DIRECTOR DE TESIS:
D.C. SAMUEL TREVIÑO MORA

CO-DIRECTOR:
D.C. ALFONSO DANIEL DÍAZ FONSECA

MAYO 2022
Introducción

La sociedad ha experimentado cambios drásticos en los hábitos alimenticios

durante las últimas décadas (Berthoud H., 2012). El perfil nutricional moderno, rico
en grasas y azucares refinados, asociado con mayores porciones, es un factor
importante que, en conjunto con menor actividad física, genera un estilo de vida
altamente obesogénico que contribuye a la epidemia actual de trastornos
metabólicos (Hill J., 1998).

Los principales cambios en la dieta mexicana han sido la incorporación de

alimentos altamente procesados, bebidas endulzadas artificialmente, la comida
rápida, el marketing masivo alusivo a la alta disponibilidad y accesibilidad de
dichos alimentos; los factores reportados como barreras a la hora de alimentarse
saludablemente son: la falta de conocimiento, tiempo y/o dinero para comprar,
preparar y/o consumir alimentos saludables, la falta de una alimentación saludable
en la familia, la preferencia por consumir bebidas azucaradas y comida densa en
energía, la falta de motivación y el desagrado por el sabor de las verduras
(ENSANUT 2016). Estos hábitos afectan negativamente a la salud de las
personas, puesto que si son consumidos frecuentemente existe el riesgo de
padecer enfermedades crónicas.

El consumo de alimentos procesados de manera ocasional no genera un impacto

desfavorable, siempre y cuando el 80% de la dieta sea de origen natural y cumpla
con las características de una dieta equilibrada y saludable. Sin embargo, cuando
el consumo de estos alimentos es de manera frecuente el organismo comienza
con procesos de adaptación y compensatorios, puesto que los ingredientes con
los que están elaborados generan un gran impacto a nivel energético, neuronal,
metabólico y hormonal. Diversas publicaciones mencionan que el consumo de
alimentos procesados está asociado con una alta prevalencia de obesidad y
diabetes, debido a que la gente consume más calorías cuando se encuentra
expuesto a una dieta basada en este tipo de alimentos (Hall, 2019), los cuales son
altos en calorías, azúcar y grasa, además de sales y conservadores (Small, D.,
2019).
El síndrome metabólico (SMet) es un estado fisiopatológico complejo estudiado
hace tiempo, sin embargo, no hay una definición universal. Las tres definiciones
más aceptadas son las establecidas por la OMS, el Programa Nacional de
Educación sobre el Colesterol y la Federación Internacional de Diabetes (Alberti,
K., 2009) en las que se define como una co-ocurrencia de obesidad,
hiperglucemia, dislipidemia, hipertensión y se considera que la resistencia a la
insulina (RI) es fundamental para la fisiopatología (Balkau, B., 1999).

El SMet se origina principalmente por un desequilibrio de la ingesta calórica y el

gasto energético, pero también se ve afectado por la genética del individuo cuya
expresión es mediada por factores externos (Saklayen M., 2018). Esta condición
vincula a la obesidad abdominal, RI, hipertensión y dislipidemia (Alberti, K., 2009),
que se sabe son elementos que están interrelacionados y comparten mediadores,
vías y mecanismos fisiopatológicos comunes (Huang P., 2009).

El aumento en la incidencia del SMet ha generado interés en el estudio de las

consecuencias patológicas y su progresión, que se desarrolla a partir de una
inflamación crónica que aumenta el riesgo de deterioro cognitivo, accidente
cerebrovascular y afecciones neurodegenerativas (Yaffe, K., 2004).
Recientemente se ha establecido un vínculo entre la alimentación y la salud
mental, pues la desregulación de carbohidratos y hormonas producidas por
órganos periféricos tienen acción en el sistema nervioso central (SNC) al atravesar
la barrera hematoencefálica (BHE) (Banks, W., 2012). La insulina y la leptina
atraviesan la BHE a través de un mecanismo de transporte saturable e
independiente de insulina, que regula el apetito y el equilibrio energético (Banks,
W., 1996).

En el SNC la insulina juega un papel en el aprendizaje y memoria y está asociada

con la potenciación a largo plazo en el hipocampo (Lee, C., 2005). Recientemente
se ha informado que la alteración en la señalización de la insulina durante el SMet
incrementa la probabilidad de padecer enfermedad de Parkinson (Bosco, D.,
2012). Esta es la segunda enfermedad neurodegenerativa, después del
Alzheimer, la cual presenta una deficiencia de neurotransmisores dopaminérgicos,
colinérgicos y otros no dopaminérgicos, y una deficiencia estructural, incluida la
atrofia hipocampal y cortical, especialmente de las cortezas occipitales posteriores
(Lee, C., 2005).

Cada vez existe mayor evidencia que establece un vínculo entre las enfermedades
neurodegenerativas y el síndrome metabólico. Experimentalmente se ha
demostrado una superposición en los mecanismos de progresión y el desarrollo de
RI. La RI se ha caracterizado como la afección clave para producir patologías en
el cerebro relacionados con enfermedades metabólicas, puede ocasionarlas
mediante sus consecuencias como enfermedad microvascular, inflamación crónica
y disfunción de la BHE, que pueden verse agravadas por comorbilidades
asociadas hipertensión, dislipidemia e insuficiencia renal (Li, X., 2012) (Arnold S.,
2008).

Así mismo, el Alzheimer, la demencia más común, es caracterizada por lesiones

en el cerebro: placas seniles, formadas principalmente por amiloide β, y ovillos
neurofibrilares, compuestos por proteína Tau hiperfosforilada. En conjunto, estas
alteraciones se han asociado con el desarrollo de RI cerebral (Pedditzi, E., 2016).
El primer síntoma de la enfermedad es la pérdida de memoria episódica, asociado
con la afección del hipocampo (Mattson M., 2004) (Parsons, C. 2007). Algunas
modificaciones relacionadas con la obesidad, como la neuroinflamación, RI o
disfunción mitocondrial, también ocurren en la progresión patológica del Alzheimer
(O'Brien, P., 2017). Las afecciones descritas afectan primordialmente la región
hipocampal, por lo que se ha establecido como un blanco de estudio y estrategias
terapéuticas.
 El hipocampo es una estructura
relativamente grande dentro del
cerebro, que se encuentra dentro
del lóbulo temporal medial, en su
sección transversal revela una
conexión trisináptica que se
compone de: la corteza
entorrinal, que es parte de la
circunvolución parahipocampal
Figura 1 Circuitos en el hipocampo. El hipocampo tiene una vía vecina, proporciona la principal
trisináptica excitatoria, flecha azul, vía perforante; flecha naranja,
vía de fibras musgosas, flecha verde, colaterales de Schaffer; entrada cortical al hipocampo,
flecha roja proyecciones de CA1 hacia la corteza entorrinal (CE).
con proyecciones a través de la
vía perforante hacía el giro dentado; el giro dentado que proyecta a la región CA3
por la vía de fibras musgosas; mediante la vía colateral de Schaffer CA3 se
proyecta a CA1; por ultimo CA1 se proyecta de regreso a la corteza entorrinal,
completando el ciclo. 

Estás proyecciones neuronales están involucradas en el proceso de adquisición y

almacenamiento de información (Treviño, S., 2017). Del 85 al 90% de las
neuronas en el hipocampo son glutamatérgicas y del 10 al 15% son interneuronas
de neuroquímica gabaérgica. El giro dentado en el hipocampo de mamíferos es,
además de la zona subventricular, una región que tiene la capacidad de producir
neuronas durante la edad adulta, que son capaces de integrarse a circuitos
preexistentes (Fuentes E., 2020).

El hipocampo está involucrado en la memoria episódica al combinar una señal

espacial y temporal con una señal relacionada con elementos individuales para
formar una representación conjunta de elementos individuales dentro de un
contexto espacio temporal (Knierim J. J., 2015). Se ha descrito que los cambios en
la estructura del hipocampo generan cambios en la plasticidad neuronal, la
mielinización y la conectividad interneuronal, siendo un paso importante para el
desarrollo de enfermedades neurodegenerativas (Balestrieri J., 2020).
Hay dos modelos causales de neurodegeneración (Metzler-Baddeley C. 2019), la
primera propone que la perdida neuronal de la materia gris precede al daño de la
glía y axonal de la materia blanca, que desencadenan perdida de sinapsis
neuronas y axones, además se producen cambios en la microglía relacionados
con la inmunidad. El segundo modelo de neurodegeneración sugiere que diversos
factores (riesgo genético y estilo de vida) causarán daño en la microglía, lo que
resultará en la mielinización alterada, reducción en la eliminación mediada por la
microglía y neuroinflamación, lo que a su vez instiga enfermedades patológicas,
procesos que conducen a un metabolismo anormal en proteínas clave y muerte
neuronal (Bartzokis G., 2011) (Braak H., & 2015).

La glía constituye aproximadamente la mitad de las células del SNC (Allen N.

2018), se conforma por astrocitos, microglía y oligodendrocitos, estas células
están presentes en áreas de neurodegeneración y con frecuencia muestran
cambios fenotípicos en estados patológicos.

La microglía representa del 10 al 15% del total de células en el cerebro. Estas

células se consideran macrófagos residentes y la primera línea de defensa en el
SNC contra patógenos. En condiciones fisiológicas, la microglía tiene una gran
capacidad para responder a cambios en el microambiente del SNC debido a sus
procesos. Estos cambios pueden ser desencadenados por microorganismos como
bacterias o virus, pero también por enfermedades neurodegenerativas como la
enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson o la isquemia cerebral
(Picard, K., 2021). La microglía activada normalmente se divide en fenotipos M1 y
M2. La microglía M1 presenta un perfil proinflamatorio liberando citoquinas como
IL-1 o TNF-α que pueden polarizar a los astrocitos hacia un fenotipo neurotóxico,
agravando la respuesta inflamatoria. Por otro lado, la microglía M2 libera citocinas
antiinflamatorias, mantiene la integridad de la barrera hematoencefálica y estimula
la oligodendrogénesis a través de la diferenciación de las células progenitoras de
oligodendrocitos, favoreciendo así la recuperación funcional (Hernández I., 2021).

Por otro lado, los astrocitos son células gliales especializadas que superan en
número a las neuronas en más de cinco veces. Estas recubren todo el SNC y
ejercen múltiples funciones complejas esenciales en el SNC sano y enfermo. Los
astrocitos responden a todas las formas de lesiones a través de un proceso
denominado astrogliosis reactiva, que se ha convertido en un sello patológico de
las lesiones estructurales. Recientemente se ha logrado un progreso sustancial en
la determinación de las funciones y mecanismos de la astrogliosis reactiva y en la
identificación de las funciones de los astrocitos en los trastornos y patologías del
SNC (Sofroniew MV., 2010). En línea con la microglía, los astrocitos
activados generalmente se clasifican en fenotipos A1 y A2. Los astrocitos A1
presentan un perfil neurotóxico que libera citocinas proinflamatorias con efectos
inhibitorios sobre la oligodendrogénesis y la diferenciación de las células
progenitoras de oligodendrocitos. Por el contrario, los astrocitos A2 tienen
funciones neuroprotectoras que liberan citocinas antiinflamatorias y factores
tróficos, como el factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF)o el factor de
crecimiento del endotelio vascular (VEGF) con efectos similares sobre los
oligodendrocitos que los de la microglía M2.

 Finalmente, los oligodendrocitos son especialmente sensibles al estrés oxidativo y

a la excitotoxicidad generada durante la isquemia cerebral. La desmielinización
afecta a las neuronas por desestabilización axonal, generando disfunciones
neurológicas. Además, estos eventos se agravan en presencia de microglía M1 y
astrocitos A1. Al mismo tiempo, los factores tróficos liberados por la microglía M2 y
los astrocitos A2 aumentan la oligodendrogénesis y la diferenciación de los
precursores oligodendrociticos para reparar la sustancia blanca dañada en el área
lesionada (Hernández I. 2021).

A pesar de que el avance científico ha establecido cambios poblacionales de la

glía en las enfermedades crónico-degenerativas, hay escasa información asociada
al estudio del SMet y cómo afecta la glía del hipocampo.

Planteamiento del problema

El cambio en los hábitos alimenticios, con exceso en la ingesta calórica debido al

aumento en el consumo de azucares refinados, alimentos procesados y
disminución en la activada física; condicionan el desarrollo de SMet y
enfermedades crónico-degenerativas. A nivel mundial, en 2015, 107.7 millones de
niños y 603.7 millones de adultos en todo el mundo fueron clasificados con
obesidad. Desde 1980 la prevalencia de la obesidad se ha duplicado en al menos
70 países, en un panorama general de obesidad en niños y adultos fue de 5.0% y
12.0%. En México, el 75.2% de los adultos mayores de 20 años presentan
sobrepeso u obesidad y/o algún otro padecimiento crónico degenerativo, cifra que
incrementó en comparación con mostrado en 2012, del 71.3% (ENSANUT 2018).
Existe evidencia en la que se demuestra que el sobrepeso y la obesidad son
signos invariables del desarrollo de SMet.

Por lo que, México enfrenta una pandemia de enfermedades crónicas no

transmisibles. El SMet es un padecimiento complejo caracterizado por la presencia
de alteraciones metabólicas, fisiológicas y funcionales; con modificaciones
metabólicas a nivel celular y molecular que afectan la señalización de
carbohidratos y lípidos.

Estudios previos han identificado que el consumo crónico de dietas hipercalóricas

se asocia con RI, que a su vez favorece la síntesis de lípidos y la lipolisis, lo que
genera hiperplasia en el tejido adiposo

Recientemente, las evidencias establecen que la relación entre las enfermedades

metabólicas y el deterioro cognitivo asociado a la aparición de la demencia.
Debido a que en su fisiopatología se comparten rutas de señalización. Las
patologías comúnmente vinculadas con estos procesos son la enfermedad de
Alzheimer y Parkinson. En México más de 350,000 personas están afectadas por
la enfermedad de Alzheimer, y mueren por ella anualmente 2,030 pacientes.
Asimismo, para el Parkinson se estima una prevalencia de 50 casos nuevos por
cada 100 mil habitantes al año. Sin embargo, aún no está completamente
establecida la relación con el desarrollo de SMet y sus consecuencias en totalidad.

Si bien gran parte de la investigación sobre enfermedades neurodegenerativas se

ha centrado en las neuronas, las células no neuronales también se ven afectadas
(Gleichman A., 2020). La glía contribuye a mantener un medio homeostático para
que las neuronas funcionen correctamente en respuesta a una variedad de
alteraciones ambientales, en modelos de neurodegenaración como el Alzheimer
se ha identificado que el proceso de neuroinflamación induce la regulación a la
alza de los fenotipos reactivos de la microglía y los astrocitos, que contribuyen a la
muerte neuronal (Hashioka S., 2021), sin embargo no hay reportes de la conducta
que adquiere la glía durante el desarrollo de SMet en etapas tempranas y tardías,
razón por la cual se pretende explorar el comportamiento de la glía en este modelo
respecto a su comportamiento fisiológico lo que da paso a la siguiente pregunta
científica:

¿El desarrollo y evolución del síndrome metabólico en rata Wistar modifica la

población glial del hipocampo?

Justificación

La mal nutrición, con exceso de ingesta calórica, disminución en la actividad física

y alteraciones en la expresión génica han incremento los problemas asociados a la
RI, obesidad y dislipidemias, que desencadenan en diabetes tipo 2. Los problemas
metabólicos se han convertido en un problema de salud mundial en los últimos
años, además cada día incrementa la incidencia en personas de menor edad.
Estos desordenes nutricionales están asociados no solo a riesgo metabólico,
también se asocian a riego coronario, con aumento en la tensión arterial,
diferentes tipos de cáncer y con la neurodegeneración, por lo que en los últimos
años se han considerado la relación entre las enfermedades metabólicas y las
afecciones en la plasticidad, el aprendizaje y la memoria (Pugazhenthi, S., 2017).

La glía contribuye a mantener la homeostasis cerebral metabólicamente,

estructuralmente y en la neuroquímica (Zhou Y., 2018), pero en estados
patológicos, se ha observado que induce mayor formación de moléculas
proinflamatorias, como citocinas, activa procesos de apoptosis, exacerba el estrés
oxidativo, lo que conduce a la neurodegeneración. En modelos con consumo
crónico, durante 3 meses, de dieta hipercalorica se ha identificado que existe
astrogliosis reactiva, acompañada de alta producción de citocinas proinflamatorias,
que conducen a daño neuronal, sin embargo se desconocen las causas y como
ocurre el paso de las células de la glía del estatus antiinflamatorio al estatus
proinflamatorio, por lo que en el presente estudio se pretende identificar si el
desarrollo y evolución del SMet genera cambios en las poblaciones de la glía en el
hipocampo, pues se ha evidenciado es una de las regiones cerebrales que se
deterioran por el consumo de dietas hipercalóricas (Diaz A., 2020) (Treviño S.,
2015)

Hipótesis nula

• El síndrome metabólico inducido por el consumo crónico de dieta

hipercalórica hiperglúcida no genera cambios en las poblaciones de la glía
en el hipocampo de rata macho Wistar.

Hipótesis alternativa

• El síndrome metabólico inducido por el consumo crónico de dieta

hipercalórica hiperglúcida genera cambios en las poblaciones de la glía en
el hipocampo de rata macho Wistar.

Objetivo

• Evaluar las subpoblaciones de la glía en el hipocampo de rata macho

Wistar con síndrome metabólico en etapas tempranas y tardías.

Objetivos específicos

En las subregiones hipocampales de ratas macho Wistar sin y con síndrome

metabólico en etapas tempranas y tardías:

• Valorar el estado proinflamatorio / antinflamatorio del hipocampo.

• Cuantificar las poblaciones de astrocitos y microglía tipo 1 y 2.

• Evidenciar las poblaciones de oligodendrocitos maduros e inmaduros.

Esquema de trabajo
Métodos

Animales

Se utilizarán 40 ratas macho de la cepa Wistar, con 20 días de edad y peso

aproximado de 70-80 gramos, proporcionadas por el Bioterio Claude Bernard de la
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Serán pesados hasta alcanzar los
100 gramos de peso y se seleccionarán aleatoriamente para conformar cuatro
grupos:

 Dieta normocalóric 1 mes (NC 1M)

 Dieta normocalórica 3 meses (NM 3M)
 Dieta hipercalórica 1 mes (HC 1M)
 Dieta hipercalórica 3 meses (HC 3M)

Los grupos control consumirán dieta a base pellet balanceada (LabDiet 5001)
durante 1 y 3 meses, correspondiente a cada grupo, por otra parte, los grupos
dieta hipercalórica consumirán dieta hipercalórica hiperglúcida
(MX/E/2013/047377) durante 1 y 3 meses, En los cuatro grupos los animales
tendrán acceso al agua Ad libitum.

Obtención de muestra sanguínea

Tres días antes del punto de corte, mediante punción cardiaca se obtendrán
muestras sanguíneas para la determinación de la curva de tolerancia oral a la
glucosa y su respuesta de insulina.

Sacrificio

Los animales se administrarán con pentobarbital sódico a una dosis de 150 mg/kg,
por vía intraperitoneal. Después se obtendrán 5 mL de muestra sanguínea,
después se perfundirán con solución salina isotónica y se extraerá el cerebro de
cada animal. El 50% de los cerebros de cada grupo serán diseccionados para
obtener el hipocampo y se almacenará a -70°C, el 50% restante se seccionarán
con ayuda de un bisturí en tres partes con dos cortes coronales y se almacenarán
en formalina bufferada al 4%, para fijar el tejido.
Ensayos bioquímicos

Las concentraciones de glucosa, lípidos y lipoproteínas se determinarán mediante

kits comerciales, de la marca Spinreact. La determinación de ácidos grasos libres
se realizará de acuerdo con el método basado en la formación de sales metálicas.
Las concentraciones de insulina plasmática se determinarán mediante un
inmunoensayo ELISA tipo sándwich (Diagnostica Internacional Company), con el
complejo anticuerpo-antígeno resultante evaluado a 415 nm en un lector de placas
Stat fax 2600 (Grupo WinerLab). Las concentraciones de insulina se obtendrán a
partir de una curva estándar con un rango de 0 a 20 μU/mL. Las curvas de
tolerancia a glucosa y curva de insulina se realizarán tras la administración oral de
una carga de glucosa de 1,75 g/kg de peso corporal.

Cálculo de índices

Se calcularán los índices HOMA-IR, RCV y Matzuda DeFronzo, mediante las

siguientes ecuaciones:

mg μU
Glucosa basal( )× Insulina basal( )
dL mL
HOMA−IR=
2430

10000
Matzuda DeFronzo=
√¿ ¿ ¿

[ ]
mg
) TG (
dL
IRCV =HOMA−IR ×
mg
HDL( )
dL

Determinación de citocinas

A partir de hipocampos diseccionados se realizará un homogeneizado en 1 ml de

PBS en frío a pH 7.4, por centrifugación a 12,500 rpm a 4°C se obtendrá el
sobrenadante y se cuantificará IL-1β, TNF-α, antagonista del receptor de IL-1β, IL-
10, IL-17, IL-6 y TGF-β mediante kits comerciales para ELISA de Abcam.

Análisis histológico
Los cerebros conservados en formalina al 4% se deshidrataron, posteriormente se
incluyeron en parafina. De los bloques generados se realizaron cortes histológicos
con 5μm de grosor en un micrótomo Leica RM2125, estos cortes se colocaron en
portaobjetos previamente embebidos con poli-L-lisina al 0.1%.

Inmunofluorescencia

La técnica inmunofluorescencia se basa en la especificidad de anticuerpo primario

para el antígeno diana. El anticuerpo se detecta indirectamente, usando un
anticuerpo secundario marcado con un fluorocromo que se ha generado contra el
anticuerpo primario. Esta técnica se empleará para evidenciar la expresión de:

 CD16 (Cell signaling 2H7)

 CD206 (Santa Cruz Sc-376108)
 IBA1/AIF-1 (Cell signaling E404W)
 NG2 (Santa Cruz Sc-53389)
 MBP (Cell signaling E9P7U)
 Olig2 (Cell signaling E6G6Q)
 GFAP (Cell signaling D1FA4Q)
 IL-1β (Abcam ab239517)
 IL-10 (Santa Cruz Sc-57245)
 TNF-α (Santa Cruz Sc-133192)
 IL-17 (Santa Cruz Sc-374218)
 Antagonista IL-1β (Santa Cruz Sc-374218)
 BDNF (Santa Cruz Sc-546)

Empleando anticuerpos secundarios anti-mouse y anti-rabbit acoplados a FITC y

rodamina se realizará la detección. Empleando anticuerpos secundarios anti-
mouse y anti-rabbit acoplados a FITC y rodamina se realizará marcaje doble y
montaje con VECTASHIELD. Se tomará una fotografía para cada zona del
hipocampo (CA1, CA3 y giro dentado) en el microscopio de fluorescencia marca
Leica Microsystem y se cuantificará el número de células inmunoreactivas para
ambas marcas en cada combinación.
 Cronograma de trabajo

Actividades Junio Julio Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Enero Febrero Marzo Abril

Revisión
bibliográfica
Acondicionamiento
de los animales

Inducción del SMet

Determinaciones
zoométrícas

Sacrificio

Determinaciones
séricas

Cuantificaciones por
ELISA

Determinaciones
histológicas

Escritura de tesis

Conclusión del
proyecto
Bibliografía

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