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OCDE/OCDE 425
Adoptado:
3 de octubre de 2008

DIRECTRICES DE LA OCDE PARA LA PRUEBA DE PRODUCTOS QUÍMICOS

Toxicidad Oral Aguda – Procedimiento Up-and-Down (UDP)

INTRODUCCION

1. Las directrices de la OCDE para el ensayo de sustancias químicas se revisan periódicamente a la luz de los resultados científicos.
el progreso o el cambio de las prácticas de El concepto del enfoque de prueba ascendente y descendente fue el primero En
evaluación. descrita por Dixon y Mood (1)(2)(3)(4). 1985, Bruce propuso utilizar un procedimiento ascendente y descendente
Existen varias variaciones de la up-
(UDP) para la determinacion de la toxicidad aguda de productos quimicos (5).
diseño experimental descendente para estimar una LD50. Esta guía se basa en el procedimiento de
Bruce adoptado por ASTM en 1987 (6) y revisado en 1990. Un estudio que compara los resultados
obtenidos con la UDP, la prueba convencional LD50 y el procedimiento de dosis fija (FDP, OECD Test
Guideline 420) fue publicado en 1995 (7). Desde los primeros artículos de Dixon y Mood, han seguido
apareciendo artículos en la literatura biométrica y aplicada que examinan las mejores condiciones
para el uso del enfoque (8)(9)(10)(11). Sobre la base de las recomendaciones de varias reuniones de
expertos en 1999, se consideró oportuna una revisión adicional porque: i) se había llegado a un
acuerdo internacional sobre los valores de corte armonizados de LD50 para la clasificación de
sustancias químicas, ii) pruebas en un sexo (generalmente mujeres) generalmente se considera
suficiente,

2. El procedimiento de prueba descrito en esta Guía es valioso para minimizar el número de animales
necesaria para estimar la toxicidad oral aguda de una sustancia química. Además de la estimación de LD50 e intervalos de
confianza, la prueba permite la observación de signos de toxicidad. La revisión de la Directriz de Examen 425 se llevó a cabo al
mismo tiempo que las revisiones de las Directrices de Examen 420 y 423.

3. Se puede encontrar orientación sobre la selección del método de prueba más apropiado para un propósito determinado.
en el Documento de orientación sobre pruebas de toxicidad oral (12). Este Documento de orientación también contiene
información adicional sobre la conducta y la interpretación de la Directriz 425.

4. Las definiciones utilizadas en el contexto de esta Guía se establecen en el Anexo 1.

CONSIDERACIONES INICIALES

5. El laboratorio de pruebas debe considerar toda la información disponible sobre la sustancia de prueba antes de
realizando el estudio. Dicha información incluirá la identidad y la estructura química de la sustancia de ensayo;
sus propiedades físico químicas; los resultados de cualquier otrain vitrooen vivopruebas de toxicidad de la
sustancia; datos toxicológicos sobre sustancias estructuralmente relacionadas o mezclas similares; y los usos
previstos de la sustancia. Esta información es útil para determinar la relevancia de la prueba para la protección
de la salud humana y el medio ambiente, y ayudará en la selección de una dosis inicial adecuada.

6. El método permite estimar una LD50 con un intervalo de confianza y los resultados permiten una
sustancia que debe clasificarse y clasificarse de acuerdo con el Sistema Globalmente Armonizado para la clasificación de
productos químicos que causan toxicidad aguda (16).

7. Cuando no se dispone de información para hacer una estimación preliminar de la LD50 y la pendiente de
la curva dosis-respuesta, los resultados de las simulaciones por computadora han sugerido que comenzar cerca de 175 mg/kg y

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Usted es libre de utilizar este material para fines personales, no comerciales, sin obtener el consentimiento previo de la OCDE,
siempre que se mencione debidamente la fuente. Cualquier uso comercial de este material está sujeto a la autorización por
escrito de la OCDE.
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el uso de unidades de medio logaritmo (correspondientes a una progresión de dosis del factor 3,2) entre dosis
producirá los mejores resultados. Esta dosis inicial debe modificarse si es probable que la sustancia sea
altamente tóxica. El espacio medio logarítmico proporciona un uso más eficiente de los animales y aumenta la
precisión en la predicción del valor LD50. Debido a que el método tiene un sesgo hacia la dosis inicial, es
esencial que la dosificación inicial ocurra por debajo de la LD50 estimada. (Véanse los párrafos 32 y el Anexo 2
para la discusión de las secuencias de dosis y los valores iniciales). Sin embargo, para los productos químicos
con gran variabilidad (es decir, pendientes de dosis-respuesta poco profundas), aún se puede introducir un
sesgo en las estimaciones de letalidad y la LD50 tendrá un gran error estadístico, similar a otros métodos de
toxicidad aguda. Para corregir esto,

8. El método es más fácil de aplicar a los materiales que producen la muerte en uno o dos días. los
El método no sería práctico cuando se puede esperar una muerte considerablemente retrasada (cinco días o
más).

9. Las computadoras se utilizan para facilitar los cálculos animal por animal que establecen secuencias de prueba.
y proporcionar estimaciones finales.

10 Sustancias de ensayo, en dosis que se sabe que causan dolor y malestar marcados debido a sustancias corrosivas o
acciones severamente irritantes, no necesita ser administrado. Los animales moribundos o los animales con dolor evidente o
que muestren signos de angustia grave y duradera se sacrificarán sin crueldad y se considerarán en la interpretación de los
resultados de la prueba de la misma manera que los animales que murieron en la prueba. Los criterios para tomar la decisión
de sacrificar animales moribundos o que sufren gravemente, y la orientación sobre el reconocimiento de una muerte
predecible o inminente son el tema de un documento de orientación de la OCDE (13).

11 Una prueba de límite se puede usar de manera eficiente para identificar productos químicos que probablemente tengan baja toxicidad.

PRINCIPIO DE LA PRUEBA DE LÍMITE

12 La Prueba de Límite es una prueba secuencial que utiliza un máximo de 5 animales. Una dosis de prueba de 2000, o
excepcionalmente se pueden utilizar 5000 mg/kg. Los procedimientos para las pruebas a 2000 y 5000 mg/kg son ligeramente
diferentes (véanse los párrafos 23 a 25 para la prueba límite a 2000 mg/kg y los párrafos 26 a 30 para la prueba límite a 5000
mg/kg). La selección de un plan de prueba secuencial aumenta el poder estadístico y también se ha hecho para sesgar
intencionalmente el procedimiento hacia el rechazo de la prueba límite para compuestos con DL50 cerca de la dosis límite; es
decir, errar por el lado de la seguridad. Al igual que con cualquier protocolo de prueba de límite, la probabilidad de clasificar
correctamente un compuesto disminuirá a medida que la DL50 real se asemeje más a la dosis límite.

PRINCIPIO DE LA PRUEBA PRINCIPAL

13 La prueba principal consiste en una única progresión de dosis ordenada en la que se dosifica a los animales, uno a la vez.
tiempo, en intervalos mínimos de 48 horas. El primer animal recibe una dosis un paso por debajo del nivel de la mejor estimación de la
LD50. Si el animal sobrevive, la dosis para el próximo animal se incrementa en [un factor de] 3,2 veces la dosis original; si muere, la
dosis para el siguiente animal se reduce en una progresión de dosis similar. (Nota: 3.2 es el factor predeterminado que corresponde a
una progresión de dosis de media unidad logarítmica. El párrafo 32 proporciona orientación adicional para la elección del factor de
espaciamiento de dosis). Cada animal debe observarse atentamente durante un máximo de 48 horas antes de tomar una decisión
sobre si cuánto dosificar al siguiente animal. Esa decisión se basa en el patrón de supervivencia de 48 horas de todos los animales
hasta ese momento. (Ver párrafos 31 y 35 sobre la elección del intervalo de dosificación). Se utiliza una combinación de criterios de
interrupción para mantener bajo el número de animales mientras se ajusta el patrón de dosificación para reducir el efecto de un valor
inicial deficiente o una pendiente baja (ver párrafo 34). La dosificación se detiene cuando se cumple uno de estos criterios (véanse los
párrafos 33 y 41), momento en el que se calcula una estimación de la DL50 y un intervalo de confianza para la prueba en función del
estado de todos los animales al finalizar. Para la mayoría de las aplicaciones, las pruebas se completarán con solo 4 animales después
de la prueba inicial.

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reversión en el resultado animal. La LD50 se calcula utilizando el método de máxima verosimilitud (14)(15).
(Véanse los párrafos 41 y 43.)

14 Los resultados del procedimiento de prueba principal sirven como punto de partida para un procedimiento computacional para
proporcione una estimación del intervalo de confianza cuando sea factible. Una descripción de la base para este CI se describe en el
párrafo 45.

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

Selección de especies animales

15. La especie de roedor preferida es la rata, aunque se pueden usar otras especies de roedores. Normalmente
se utilizan ratas hembra (12). Esto se debe a que las encuestas bibliográficas de las pruebas convencionales de LD50 muestran
que, por lo general, hay poca diferencia en la sensibilidad entre sexos, pero en los casos en que se observan diferencias, las
mujeres son generalmente un poco más sensibles (7). Sin embargo, si el conocimiento de las propiedades toxicológicas o
toxicocinéticas de sustancias químicas estructuralmente relacionadas indica que es probable que los machos sean más
sensibles, entonces se debe usar este sexo. Cuando la prueba se realice en varones, se deberá aportar una justificación
adecuada.

dieciséis. Deben emplearse animales adultos jóvenes sanos de las cepas de laboratorio comúnmente utilizadas. Hembras
debe ser nulípara y no embarazada. Al comienzo de su dosificación, cada animal debe tener entre 8 y 12
semanas de edad y su peso debe caer en un intervalo de ± 20 % del peso medio inicial de cualquier animal
previamente dosificado.

Condiciones de alojamiento y alimentación

17 La temperatura en la sala de animales de experimentación debe ser de 22°C (± 3°C). Aunque el relativo
la humedad debe ser de al menos el 30 % y preferiblemente no exceder el 70 % excepto durante la limpieza de la habitación, el
objetivo debe ser del 50-60 %. La iluminación debe ser artificial, siendo la secuencia de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Los
animales se alojan individualmente. Para la alimentación, se pueden utilizar dietas convencionales de laboratorio para roedores con un
suministro ilimitado de agua potable.

Preparación de animales

18 Los animales se seleccionan al azar, se marcan para permitir su identificación individual y se mantienen en sus
jaulas durante al menos 5 días antes de la dosificación para permitir la aclimatación a las condiciones del laboratorio. Al igual que con otros
diseños de pruebas secuenciales, se debe tener cuidado para garantizar que los animales estén disponibles en el rango de edad y tamaño
adecuado para todo el estudio.

Preparación de dosis

19 En general, las sustancias de ensayo deben administrarse en un volumen constante en el rango de dosis a
probarse variando la concentración de la preparación dosificadora. Sin embargo, cuando se va a probar
un producto final líquido o una mezcla, el uso de la sustancia de prueba sin diluir, es decir, a una
concentración constante, puede ser más relevante para la evaluación de riesgos posterior de esa
sustancia, y es un requisito de algunas autoridades reguladoras. . En cualquier caso, no se debe exceder el
volumen máximo de dosis para la administración. El volumen máximo de líquido que se puede
administrar de una vez depende del tamaño del animal de prueba. En roedores, el volumen normalmente
no debe exceder 1 ml/100 g de peso corporal; sin embargo, en el caso de soluciones acuosas, se puede
considerar 2 ml/100 g de peso corporal. Con respecto a la formulación de los preparados dosificadores, se
recomienda el uso de una solución/suspensión/emulsión acuosa siempre que sea posible,

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solución en otros vehículos. Para vehículos que no sean agua, se deben conocer las características toxicológicas del
vehículo. Las dosis deben prepararse poco antes de la administración, a menos que se conozca y se demuestre que la
estabilidad de la preparación durante el período durante el cual se utilizará es aceptable.

PROCEDIMIENTO

Administración de Dosis

20 La sustancia de ensayo se administra en una sola dosis por sonda utilizando una sonda estomacal o un tubo adecuado.
cánula de intubación. En la circunstancia inusual de que una dosis única no sea posible, la dosis puede administrarse en fracciones
más pequeñas durante un período que no exceda las 24 horas.

21 Los animales deben estar en ayunas antes de la dosificación (p. ej., con la rata, se debe retener la comida pero no el agua).
durante la noche; con el ratón, la comida pero no el agua se debe retener durante 3-4 horas). Después del período de
ayuno, los animales deben pesarse y administrarse la sustancia de ensayo. Se determina el peso corporal en ayunas de
cada animal y se calcula la dosis en función del peso corporal. Después de administrar la sustancia, se puede
suspender la comida durante 3-4 horas más en ratas o 1-2 horas en ratones. Cuando una dosis se administre en
fracciones durante un período de tiempo, puede ser necesario proporcionar comida y agua a los animales
dependiendo de la duración del período.

Prueba de límite y prueba principal

22 La prueba de límite se utiliza principalmente en situaciones en las que el experimentador tiene información que indica
que es probable que el material de prueba no sea tóxico, es decir, que tenga una toxicidad por debajo de las dosis límite
reglamentarias. La información sobre la toxicidad del material de prueba se puede obtener a partir del conocimiento sobre
compuestos probados similares o mezclas o productos probados similares, teniendo en cuenta la identidad y el porcentaje de
componentes que se sabe que tienen importancia toxicológica. En aquellas situaciones en las que haya poca o ninguna información
sobre su toxicidad, o en las que se espere que el material de prueba sea tóxico, se debe realizar la prueba principal.

Prueba de límite

Prueba de límite a 2000 mg/kg

23 Administrar a un animal la dosis de prueba. Si el animal muere, realice la prueba principal para determinar la Si el animal
DL50. sobrevive, dosifique secuencialmente a cuatro animales adicionales para que un total de cinco animales sean
probado Sin embargo, si mueren tres animales, la prueba límite finaliza y se realiza la prueba principal. La LD50 es superior a
2000 mg/kg si sobreviven tres o más animales. Si un animal muere inesperadamente al final del estudio y hay otros
sobrevivientes, es apropiado detener la dosificación y observar a todos los animales para ver si otros animales también
morirán durante un período de observación similar (consulte el párrafo 31 para el período de observación inicial). Las muertes
tardías deben contarse igual que otras muertes. Los resultados se evalúan como sigue (O=supervivencia, X=muerte).

24 La LD50 es menor que la dosis de prueba (2000 mg/kg) cuando mueren tres o más animales.

O X O XX
O BUEY XX
O XX BUEY
O XX X

Si muere un tercer animal, realice la prueba principal.

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25 Prueba con cinco animales. La LD50 es mayor que la dosis de prueba (2000 mg/kg) cuando tres o más
los animales sobreviven.

OOOOO
O OO XO
O OO BUEY
OOOXX
O XO XO
O XO OO/X
O OX XO
O OX OO/X
O XXOO

Prueba de límite a 5000 mg/kg

26 Excepcionalmente, y sólo cuando lo justifiquen las necesidades normativas específicas, el uso de una dosis de 5000
Se pueden considerar mg/kg (ver Anexo 4). Por motivos de preocupación por el bienestar animal, se desaconseja la realización de pruebas en
animales en los rangos de la categoría 5 del SGA (2000-5000 mg/kg) y solo se debe considerar cuando exista una gran probabilidad de que los
resultados de dicha prueba tengan una relevancia directa para la protección de seres humanos o animales. la salud o el medio ambiente.

27 Administrar a un animal la dosis de prueba. Si el animal muere, realice la prueba principal para determinar la Si el
DL50. animal sobrevive, dosifique dos animales adicionales. Si ambos animales sobreviven, la DL50 es mayor
que la dosis límite y la prueba finaliza (es decir, se lleva a una observación completa de 14 días sin dosificar a
más animales).

28 Si uno o ambos animales mueren, dosifique dos animales adicionales, uno a la vez. si un animal
muere inesperadamente al final del estudio y hay otros sobrevivientes, es apropiado detener la dosificación y observar a todos
los animales para ver si otros animales también morirán durante un período de observación similar (consulte el párrafo 10
para el período de observación inicial). Las muertes tardías deben contarse igual que otras muertes. Los resultados se evalúan
de la siguiente manera (O=supervivencia, X=muerte y U=innecesario).

29 La LD50 es menor que la dosis de prueba (5000 mg/kg) cuando mueren tres o más animales.

O X O XX
O BUEY XX
O XX BUEY
O XX X

30 La LD50 es mayor que la dosis de prueba (5000 mg/kg) cuando sobreviven tres o más animales.

OOO
O XO XO
O XO O
O OX XO
O BUEY O
O XXOO

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Prueba principal

31 Los animales individuales se dosifican en secuencia, normalmente a intervalos de 48 h. Sin embargo, los intervalos de tiempo
entre dosificación está determinada por el inicio, la duración y la gravedad de los signos tóxicos. El tratamiento de un animal con la
siguiente dosis debe retrasarse hasta que se tenga confianza en la supervivencia del animal que recibió la dosis anterior. El intervalo
de tiempo se puede ajustar según corresponda, por ejemplo, en caso de una respuesta no concluyente. La prueba es más sencilla de
implementar cuando se usa un solo intervalo de tiempo para tomar decisiones de dosificación secuencial. Sin embargo, no es
necesario volver a calcular la dosificación o las razones de probabilidad si el intervalo de tiempo cambia a la mitad. Para seleccionar la
dosis inicial, debe usarse toda la información disponible, incluida la información sobre sustancias estructuralmente relacionadas y los
resultados de cualquier otra prueba de toxicidad en el material de prueba, para aproximar la DL50, así como la pendiente de la curva
de dosis-respuesta.

32. Al primer animal se le dosifica un paso por debajo de la mejor estimación preliminar de la LD50. si el animal
sobrevive, el segundo animal recibe una dosis mayor. Si el primer animal muere o parece moribundo, el segundo animal recibe una dosis más baja. El factor de progresión de la dosis debe elegirse para

que sea el antilogaritmo de 1/ (la pendiente estimada de la curva dosis-respuesta) y debe permanecer constante durante la prueba (una progresión de 3,2 corresponde a una pendiente de 2). Cuando no

se dispone de información sobre la pendiente de la sustancia a ensayar, se utiliza un factor de progresión de dosis de 3,2. Utilizando el factor de progresión predeterminado, las dosis se seleccionarían

de la secuencia 1,75, 5,5, 17,5, 55, 175, 550, 2000 (o 1,75, 5,5, 17,5, 55, 175, 550, 1750, 5000 para necesidades reglamentarias específicas). Si no se dispone de una estimación de la letalidad de la

sustancia, la dosificación debe iniciarse con 175 mg/kg. En la mayoría de los casos, esta dosis es subletal y por lo tanto sirve para reducir el nivel de dolor y sufrimiento. Si se espera que la tolerancia de

los animales al producto químico sea muy variable (es decir, se espera que las pendientes sean inferiores a 2,0), se debe considerar aumentar el factor de progresión de la dosis más allá del valor

predeterminado de 0,5 en una escala de dosis logarítmica (es decir, factor de progresión de 3,2). ) antes de comenzar la prueba. De manera similar, para las sustancias de prueba que se sabe que tienen

pendientes muy pronunciadas, se deben elegir factores de progresión de dosis más pequeños que el valor predeterminado. (El Anexo 2 incluye una tabla de progresiones de dosis para pendientes de

números enteros que van de 1 a 8 con una dosis inicial de 175 mg/kg). 5 en una escala de dosis logarítmica (es decir, factor de progresión de 3,2) antes de comenzar la prueba. De manera similar, para

las sustancias de prueba que se sabe que tienen pendientes muy pronunciadas, se deben elegir factores de progresión de dosis más pequeños que el valor predeterminado. (El Anexo 2 incluye una tabla

de progresiones de dosis para pendientes de números enteros que van de 1 a 8 con una dosis inicial de 175 mg/kg). 5 en una escala de dosis logarítmica (es decir, factor de progresión de 3,2) antes de

comenzar la prueba. De manera similar, para las sustancias de prueba que se sabe que tienen pendientes muy pronunciadas, se deben elegir factores de progresión de dosis más pequeños que el valor

predeterminado. (El Anexo 2 incluye una tabla de progresiones de dosis para pendientes de números enteros que van de 1 a 8 con una dosis inicial de 175 mg/kg).

33. La dosificación continúa dependiendo de los resultados del intervalo de tiempo fijo (p. ej., 48 horas) de todos los animales
hasta ese momento. La prueba se detiene cuando se cumple uno de los siguientes criterios de detención:

(a) 3 animales consecutivos sobreviven en el límite superior;

(b) 5 reversiones ocurren en cualquiera de los 6 animales consecutivos probados;
(c) al menos 4 animales han seguido la primera inversión y las relaciones de probabilidad especificadas
superan el valor crítico. (Ver párrafo 44 y Anexo 3. Los cálculos se realizan en cada dosificación,
siguiendo al cuarto animal después de la primera inversión).

Para una amplia variedad de combinaciones de LD50 y pendientes, la regla de parada (c) se cumplirá con 4 a 6 animales después de la
inversión de la prueba. En algunos casos, para productos químicos con curvas de dosis-respuesta de poca pendiente, se pueden
necesitar animales adicionales (hasta un total de quince probados).

34. Cuando se hayan alcanzado los criterios de parada, la LD50 estimada debe calcularse a partir de la
resultados de los animales al final de la prueba utilizando el método descrito en los párrafos 40 y 41.

35. Los animales moribundos sacrificados por razones humanitarias se consideran de la misma manera que los animales que murieron
en prueba. Si un animal muere inesperadamente al final del estudio y hay otros sobrevivientes con esa dosis o más, es apropiado
detener la dosificación y observar a todos los animales para ver si otros animales también morirán durante un período de observación
similar. Si los supervivientes posteriores también mueren,yparece que todos los niveles de dosis exceden la LD50, sería más apropiado
comenzar el estudio nuevamente comenzando al menos dos pasos por debajo de la dosis más baja con muertes (y aumentando el
período de observación) ya que la técnica es más precisa cuando la dosis inicial está por debajo de la DL50. Si los animales
subsiguientes sobreviven a la dosis del animal que muere o por encima de ella, no es

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necesario cambiar la progresión de la dosis, ya que la información del animal que ahora ha muerto se incluirá en los
cálculos como una muerte con una dosis más baja que la de los sobrevivientes posteriores, reduciendo la LD50.

OBSERVACIONES

36. Los animales se observan individualmente al menos una vez durante los primeros 30 minutos después de la dosificación,
periódicamente durante las primeras 24 horas (con especial atención durante las primeras 4 horas), y diariamente a partir de
entonces, durante un total de 14 días, excepto cuando sea necesario retirarlos del estudio y sacrificarlos sin crueldad por
razones de bienestar animal o si se encuentran muertos. . Sin embargo, la duración de la observación no debe fijarse de
manera rígida. Debe estar determinado por las reacciones tóxicas y el tiempo de inicio y la duración del período de
recuperación, y por lo tanto puede extenderse cuando se considere necesario. Los momentos en que aparecen y desaparecen
los signos de toxicidad son importantes, especialmente si existe una tendencia a que los signos tóxicos se retrasen (17). Todas
las observaciones se registran sistemáticamente y se mantienen registros individuales para cada animal.

37. Serán necesarias observaciones adicionales si los animales continúan mostrando signos de toxicidad.
Las observaciones deben incluir cambios en la piel y el pelaje, los ojos y las membranas mucosas, y también los sistemas
respiratorio, circulatorio, autónomo y nervioso central, y la actividad somatomotora y el patrón de comportamiento. Se debe
prestar atención a las observaciones de temblores, convulsiones, salivación, diarrea, letargo, sueño y coma. Deben tenerse en
cuenta los principios y criterios resumidos en el documento de orientación Humane Endpoints (13). Los animales que se
encuentren en un estado moribundo y los animales que muestren un dolor intenso o signos duraderos de angustia grave
deben sacrificarse sin crueldad. Cuando se sacrifican animales por razones humanitarias o se encuentran muertos, la hora de
la muerte debe registrarse con la mayor precisión posible.

Peso corporal

38. Los pesos individuales de los animales deben determinarse poco antes de que la sustancia de prueba sea
administrado y al menos semanalmente a partir de entonces. Los cambios de peso deben calcularse y registrarse. Al final de la
prueba, los animales supervivientes se pesan y luego se sacrifican sin crueldad.

Patología

39. Todos los animales (incluidos los que mueren durante la prueba o se retiran del estudio para
razones de bienestar) deben someterse a una necropsia macroscópica. Todos los cambios patológicos graves deben
registrarse para cada animal. También se puede considerar el examen microscópico de órganos que muestren evidencia de
patología macroscópica en animales que sobreviven 24 horas o más después de la dosificación inicial porque puede brindar
información útil.

DATOS E INFORMES

Datos

40 Deben proporcionarse datos de animales individuales. Además, todos los datos deben resumirse en tablas.
formulario, que muestra para cada dosis de prueba el número de animales utilizados, el número de animales que muestran signos de
toxicidad (17), el número de animales encontrados muertos durante la prueba o sacrificados por razones humanitarias, el momento
de la muerte de los animales individuales, una descripción y el curso temporal de los efectos tóxicos y la reversibilidad, y los hallazgos
de la necropsia. Se debe proporcionar una justificación de la dosis inicial y la progresión de la dosis y cualquier dato utilizado para
respaldar esta elección.

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Cálculo de LD50 para la prueba principal

41. La LD50 se calcula utilizando el método de máxima verosimilitud (14)(15),salvo en casos excepcionales
casos descritos en el párrafo 42. Los siguientes detalles estadísticos pueden ser útiles para implementar los
cálculos de máxima verosimilitud sugeridos (con un supuesto σ). Todas las muertes, ya sean inmediatas, tardías
o humanitarias, se incorporan a efectos del análisis de máxima verosimilitud. Siguiendo a Dixon (4), la función
de verosimilitud se escribe de la siguiente manera:

L=L1L2....Lnorte,

dónde
Les la probabilidad del resultado experimental, dadaµy σ, y n el número total de animales ensayados.

Li= 1 -F(Zi) si el yoelel animal sobrevivió, o Li=F(

Zi) si el yoelanimales muertos,

dónde
F=distribución normal estándar acumulada, Zi=
[registro(di) -µ ] / σ
di= dosis dada a la ielanimales, y
σ =desviación estándar en unidades logarítmicas de dosis (que no es la desviación estándar logarítmica).

Una estimación de la verdadera LD50 viene dada por el valor deµque maximiza la probabilidad L (véase el párrafo 43).

Se utiliza una estimación de σ de 0,5 a menos que se disponga de un mejor valor genérico o específico del caso.

42. En algunas circunstancias, el cálculo estadístico no será posible o probablemente dará

resultados erróneos. Los medios especiales para determinar/informar una LD50 estimada están disponibles para estas circunstancias
de la siguiente manera:

(a) Si la prueba se detuvo en base al criterio (a) en el párrafo 33 (es decir, una dosis límite se probó repetidamente), o
si la dosis límite superior finalizó la prueba, entonces se informa que la LD50 está por encima del límite
superior. La clasificación se completa sobre esta base.

(b) Si todos los animales muertos tienen dosis más altas que todos los animales vivos (o si todos los animales vivos
tienen dosis más altas que todos los animales muertos, aunque esto es prácticamente improbable), entonces la
LD50 está entre las dosis para los vivos y las animales muertos. Estas observaciones no dan más información
sobre el valor exacto de la LD50. Aún así, se puede hacer una estimación de LD50 de máxima verosimilitud
siempre que haya un valor para σ. El criterio de parada (b) en el párrafo 33 describe una de esas circunstancias.

(c) Si los animales vivos y muertos tienen solo una dosis en común y todos los demás animales muertos tienen dosis más
altas y todos los demás animales vivos tienen dosis más bajas, o viceversa, entonces la LD50 es igual a su dosis común.
Si se analiza una sustancia estrechamente relacionada, la prueba debe realizarse con una progresión de dosis más
pequeña.

Si no ocurre ninguna de las situaciones anteriores, entonces el LD50 se calcula utilizando el método de máxima verosimilitud.

43. El cálculo de máxima verosimilitud se puede realizar utilizando SAS (14) (p. ej., PROC NLIN) o
BMDP (15) (por ejemplo, programa AR) paquetes de programas de computadora como se describe en el Apéndice 1D en la Referencia 3.

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También se pueden utilizar otros programas informáticos. Las instrucciones típicas para estos paquetes se dan en los
apéndices de la Norma ASTM E 1163-87 (6). [El σ utilizado en el programa BASIC en (6) deberá editarse para reflejar los
parámetros de esta directriz de prueba 425 de la OCDE.] El resultado del programa es una estimación de log(LD50) y su
error estándar.

44. La regla de interrupción de la relación de probabilidad (c) del párrafo 33 se basa en tres medidas del progreso de la prueba,
que son de la forma de la probabilidad en el párrafo 41 con diferentes valores paraµ.Las comparaciones se realizan después
de cada animal analizado después del sexto que aún no satisface el criterio (a) o (b) del párrafo 33. Las ecuaciones para los
criterios de la razón de verosimilitud se proporcionan en el Anexo 3. Estas comparaciones se realizan más fácilmente en un
sistema automatizado. y puede ejecutarse repetidamente, por ejemplo, mediante una rutina de hoja de cálculo como la que
también se proporciona en el Anexo 3. Si se cumple el criterio, la prueba se detiene y la LD50 se puede calcular mediante el
método de máxima verosimilitud.

Cálculo del intervalo de confianza

45. Después de la prueba principal y el cálculo de la LD50 estimada, es posible calcular el intervalo
estimaciones para la LD50. Cualquiera de estos intervalos de confianza brinda información valiosa sobre la
Un amplio intervalo de confianza indica que hay más
confiabilidad y utilidad de la prueba principal que se realizó.
incertidumbre asociada con la LD50 estimada. la La fiabilidad de la LD50 estimada es baja y la
utilidad de la LD50 estimada puede ser marginal. Un intervalo estrecho indica que hay relativamente
poca incertidumbre asociada con la LD50 estimada. La fiabilidad de la LD50 estimada es alta y la utilidad
de la LD50 estimada es buena. Esto significa que si se repitiera la prueba principal, la nueva LD50
estimada debería estar cerca de la LD50 estimada original y ambas estimaciones deberían estar cerca de
la LD50 real.

46. Dependiendo del resultado de la prueba principal, uno de los dos tipos diferentes de estimaciones de intervalo de la
se calcula la DL50 verdadera.

• Cuando se han probado al menos tres dosis diferentes y la dosis intermedia tiene al menos un animal
que sobrevivió y un animal que murió, se utiliza un procedimiento computacional basado en la
probabilidad de perfil para obtener un intervalo de confianza que se espera que contenga la verdadera
LD50 95 % del tiempo. Sin embargo, debido a que se espera utilizar un pequeño número de animales, el
nivel real de confianza generalmente no es exacto (18). La regla de parada aleatoria mejora la
capacidad de la prueba en general para responder a condiciones subyacentes variables, pero también
hace que el nivel de confianza informado y el nivel de confianza real difieran un poco (19).

• Si todos los animales sobreviven a un nivel de dosis dado o por debajo de él y todos los animales mueren cuando se
les administra la siguiente dosis más alta, se calcula un intervalo que tiene como límite inferior la dosis más alta
probada donde todos los animales sobreviven y tiene como límite superior el nivel de dosis donde todos los animales
murieron. Este intervalo está etiquetado como "aproximado". El nivel de confianza exacto
asociado con este intervalo no se puede determinar específicamente. Sin embargo, debido a que este tipo
de respuesta solo ocurriría cuando la respuesta a la dosis es pronunciada, en la mayoría de los casos, se espera que
la verdadera LD50 esté contenida dentro del intervalo calculado o muy cerca de él. Este intervalo será relativamente
estrecho y suficientemente preciso para la mayoría de los usos prácticos.

47. En algunos casos, los intervalos de confianza se informan como infinitos, al incluir cero como
su extremo inferior o el infinito como su extremo superior, o ambos. Tales intervalos, por ejemplo, pueden ocurrir cuando todos los
animales mueren o todos los animales viven. La implementación de este conjunto de procedimientos requiere un cálculo especializado
que se realiza mediante el uso de un programa dedicado que estará disponible en la USEPA o la OCDE o se desarrolla siguiendo los
detalles técnicos disponibles en la USEPA o la OCDE (20). La cobertura lograda de estos intervalos y las propiedades del programa
dedicado se describen en informes (21) también disponibles a través de la USEPA.

9 © OCDE, (2008)
425 OCDE/OCDE

Informe de prueba

48. El informe de la prueba debe incluir la siguiente información:

Sustancia de prueba:

− naturaleza física, pureza y, en su caso, propiedades físico-químicas (incluida la

isomerización);
− datos de identificación, incluido el número CAS.

Vehículo (si procede):

− justificación de la elección del vehículo, si no es agua.

Animales de prueba:

− especie/cepa utilizada;
− estado microbiológico de los animales, cuando se conozca;
− número, edad y sexo de los animales (incluyendo, cuando corresponda, una justificación para el uso de
machos en lugar de hembras);
− procedencia, condiciones de alojamiento, alimentación, etc.

Condiciónes de la prueba:

− justificación de la selección del nivel de dosis inicial, el factor de progresión de la dosis y los niveles de dosis de
seguimiento;
− detalles de la formulación de la sustancia de prueba, incluidos detalles de la forma física del
material administrado;
− detalles de la administración de la sustancia de ensayo, incluidos los volúmenes de dosificación y el momento de la
dosificación;

− detalles de la calidad de los alimentos y el agua (incluyendo tipo/fuente de dieta, fuente de agua).

Resultados:

− peso corporal/cambios en el peso corporal;

− tabulación de los datos de respuesta y nivel de dosis para cada animal (es decir, animales que muestran signos de
toxicidad, incluida la naturaleza, la gravedad, la duración de los efectos y la mortalidad);
− pesos individuales de los animales el día de la dosificación, en intervalos semanales a partir de entonces y en el
momento de la muerte o el sacrificio;
− evolución temporal de la aparición de signos de toxicidad y si estos fueron reversibles para cada
animal;
− hallazgos de la necropsia y cualquier hallazgo histopatológico para cada animal, si está disponible;
− datos LD50;
− tratamiento estadístico de los resultados (descripción de la rutina informática utilizada y tabulación de los
cálculos en hoja de cálculo).

Discusión e interpretación de resultados.

Conclusiones.

© OCDE, (2008) 10
 OCDE/OCDE 425
LITERATURA

(1) Dixon WJ y AM Mood. (1948). Un método para obtener y analizar datos de sensibilidad. J. Amer.
Estadístico. Asociado,43 , 109-126.

(2) Dixon WJ El método Up-and-Down para muestras pequeñas (1965). J. Amer. Estadístico. Asoc.60 ,
967-978.

(3) Dixon WJ (1991). Bioensayo de Escalera: El Método de Arriba y Abajo. Neurosci. biocomportamiento Rvdo., 15 ,
47-50.

(4) Dixon WJ (1991) Diseño y análisis de experimentos cuánticos de dosis-respuesta (con énfasis en diseños
de escaleras). Dixon Statistical Associates, Los Ángeles CA, EE. UU.

(5) Bruce RD (1985). Un procedimiento ascendente y descendente para las pruebas de toxicidad aguda. Fundam. aplicación
toxicidad,5 , 151-157.

(6) ASTM (1987). E 1163-87, Método de prueba estándar para estimar la toxicidad oral aguda en ratas. Sociedad
Estadounidense de Pruebas y Materiales, Filadelfia Pensilvania, EE. UU.

(7) Lipnick RL, Cotruvo JA, Hill RN, Bruce RD, Stitzel KA, Walker AP, Chu I., Goddard M., Segal L.,
Springer JA y Myers RC (1995). Comparación de los procedimientos de toxicidad aguda Up-
and-Down, LD50 convencional y dosis fija. Fd. química Toxicol.,33 , 223-231.

(8) Choi SC (1990). Estimación de intervalos de la LD50 basada en un experimento de subida y bajada.
Biometría46 , 485-492.

(9) Vågerö M. y R. Sundberg. (1999). La distribución del estimador de máxima verosimilitud en experimentos
ascendentes y descendentes para datos cuánticos de dosis-respuesta. J. Biofarmacia. Estadístico.9 (3), 499-519.

(10) Hsi BP (1969). El método de arriba y abajo de múltiples muestras en bioensayo. J. Amer. Estadístico. Asoc. 64
, 147-162.

(11) Noordwijk van AJ y van Noordwijk J. (1988). Un método preciso para estimar una dosis letal
aproximada con pocos animales, probado con un procedimiento Monte Carlo. Arco. Toxicol.
61 , 333-343.

(12) OCDE (2000). Documento de orientación sobre toxicidad oral aguda. Serie de monografías de salud y
seguridad ambiental sobre pruebas y evaluación n.º 24.

(13) OCDE (2000). Documento de orientación sobre el reconocimiento, la evaluación y el uso de signos clínicos como criterios de
valoración humanitarios para animales de experimentación utilizados en la evaluación de la seguridad. Serie de monografías
de salud y seguridad ambiental sobre pruebas y evaluación n.º 19.

(14) Instituto SAS Inc. (1990). Guía del usuario de SAS/STAT®. Versión 6, Cuarta Ed. o después. Cary, Carolina del Norte, Estados Unidos.

(15) Software estadístico BMDP, Inc. (1990). Manual del Software Estadístico BMDP. WJ Dixon, Jefe de Ed. 1990
rev. o después. Prensa de la Universidad de California, Berkeley, CA, EE. UU.

11 © OCDE, (2008)
425 OCDE/OCDE

(16) OCDE (1998) Sistema Integrado Armonizado de Clasificación de Peligros para la Salud Humana y el Medio
Ambientela Efectos de las Sustancias Químicas aprobado por el 28elReunión conjunta del Comité de productos
químicos y el Grupo de trabajo sobre productos químicos en noviembre de 1998, Parte 2, pág. 11. [http://
webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521- 14-no-24-no-0,FF.html].

(17) Chan PK y Hayes AW (1994). Cap. 16. Toxicidad aguda e irritación ocular.Principios y Métodos de
Toxicología. Tercera edicion. AW Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., Nueva York, Estados Unidos.

(18) Rosenberger WF, Flournoy N. y Durham SD (1997). Normalidad asintótica de estimadores de máxima verosimilitud
a partir de diseños basados en respuestas multiparamétricas. Revista de planificación e inferencia
estadísticas60 , 69-76.

(19) Jennison C. y Turnbull BW 2000. Group Sequential Methods with Application to Clinical Trials.
Chapman & Hall/CRC: Boca Ratón, Florida. EE.UU.

(20) Programa estadístico de toxicidad oral aguda (Directrices de prueba 425 de la OCDE) (AOT 425 StatPgm).
Versión: 1.0, 2001. [http://www.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-document-524-
nodirectorate-no-24-6775-8,FF.html]

(21) Westat. 2001. Resultados de simulación del programa AOT425StatPgm. Informe preparado para EE.UU.
EPA bajo el Contrato 68-W7-0025, Orden de Trabajo 5-03.

© OCDE, (2008) 12
 OCDE/OCDE 425
ANEXO 1

DEFINICIONES

Toxicidad oral aguda se refiere a aquellos efectos adversos que ocurren después de la administración oral de una dosis única de una
sustancia, o dosis múltiples administradas dentro de las 24 horas.

muerte retrasada significa que un animal no muere o parece moribundo dentro de las 48 horas, pero muere más tarde durante el
período de observación de 14 días.

Dosis es la cantidad de sustancia de ensayo administrada. La dosis se expresa como peso (g, mg) o como peso de la sustancia de
ensayo por unidad de peso del animal de ensayo (p. ej., mg/kg).

Factor de progresión de la dosis , a veces llamadofactor de espaciamiento de dosis , se refiere al múltiplo por el cual se incrementa una
dosis (es decir, elprogresión de la dosis ) cuando un animal sobrevive o el divisor por el cual se disminuye cuando un animal muere. Se
recomienda que el factor de progresión de la dosis sea el antilogaritmo de 1/ (la pendiente estimada de la curva de respuesta a la
dosis). Se recomienda que el factor de progresión de la dosis predeterminado sea 3,2 = antilog 0,5 = antilog ½.

SGA: Sistema de Clasificación Globalmente Armonizado de Sustancias y Mezclas Químicas. Una actividad
conjunta de la OCDE (salud humana y medio ambiente), el Comité de Expertos en Transporte de Mercancías
Peligrosas de la ONU (propiedades físico-químicas) y la OIT (comunicación de peligros) y coordinada por el
Programa Interinstitucional para la Gestión Racional de los Productos Químicos (IOMC ).

Muerte inminente: cuando se espera el estado moribundo o la muerte antes del próximo tiempo planificado de observación.
Los signos indicativos de este estado en roedores podrían incluir convulsiones, posición lateral, recumbencia y temblor.
(Consulte el documento de orientación Humane Endpoint (13) para obtener más detalles).

LD50 (dosis letal media por vía oral), es una dosis única derivada estadísticamente de una sustancia que puede causar la
muerte en el 50 por ciento de los animales cuando se administra por vía oral. El valor LD50 se expresa en términos de peso de
la sustancia de ensayo por unidad de peso del animal de ensayo (mg/kg).

Dosis límite se refiere a una dosis en un límite superior en la prueba (2000 o 5000 mg/kg).

estado moribundo : estar en un estado de muerte o incapacidad para sobrevivir, incluso si recibe tratamiento. (Consulte el documento de
orientación Humane Endpoint (13) para obtener más detalles).

Tamaño nominal de la muestra se refiere al número total de animales probados,reducido en uno menos que el
número de respuestas similares al comienzo de la serie, o por el número de animales probados hasta, pero sin incluir,
el par que crea la primera inversión. Por ejemplo, para una serie donde X y O indican resultados de animales opuestos
(por ejemplo, X podría ser: "muere dentro de las 48 horas" y O: "sobrevive") en un patrón como el siguiente:
OOOXXOXO, tenemos el número total de animales analizados. animales (o tamaño de muestra en el sentido
convencional) como 8 y el tamaño de muestra nominal como 6. Este ejemplo particular muestra 4 animales siguiendo
una inversión. Es importante tener en cuenta si un recuento en una parte particular de la guía se refiere al tamaño
nominal de la muestra o al número total analizado. Por ejemplo, el número real máximo analizado es 15. Cuando la
prueba se detiene en función de ese número máximo, el tamaño nominal de la muestra será inferior o igual a 15.
muestra nominal comience con el (r-1) st animal (el animal antes del segundo en el par inverso) (verinversión abajo).

13 © OCDE, (2008)
425 OCDE/OCDE

Muerte predecible : presencia de signos clínicos indicativos de muerte en un momento conocido en el futuro antes del final previsto
del experimento, por ejemplo: incapacidad para alcanzar el agua o la comida. (Consulte el documento de orientación Humane
Endpoint (13) para obtener más detalles).

probit es una abreviatura del término “problema capacidadi integralt “transformación” y un modelo dosis-respuesta probit
permite una distribución normal estándar de respuestas esperadas (es decir, una centrada en su media y escalada a su
desviación estándar, σ) a dosis (típicamente en una escala logarítmica) para ser analizada como si fuera una línea recta con
pendiente el recíproco de σ. Una distribución de letalidad normal estándar es simétrica; por lo tanto, su media es también su
verdadera DL50 o respuesta mediana.

Inversión es una situación en la que se observa falta de respuesta a alguna dosis y se observa una respuesta en la siguiente
dosis probada, o viceversa (es decir, respuesta seguida de falta de respuesta). Por lo tanto, un par de respuestas crea una
inversión. El primero de estos pares ocurre en los animales numerados r-1 y r.

σ es la desviación estándar de una curva logarítmica normal que describe el rango de tolerancias de los sujetos de prueba al
químico (donde se espera que un sujeto sea capaz de responder si la dosis del químico excede la tolerancia del sujeto). El σ
estimado proporciona una estimación de la variación entre los animales de prueba en respuesta a una gama completa de
dosis.
Ver pendiente y probit.

Pendiente (de la curva dosis-respuesta) es un valor relacionado con el ángulo en el que la curva de respuesta a la dosis se
eleva desde el eje de la dosis. En el caso del análisis probit, cuando las respuestas se analizan en una escala probit frente a la
dosis en una escala logarítmica, esta curva será una línea recta y la pendiente será el recíproco de σ,la desviación estándar de
las tolerancias subyacentes del sujeto de prueba, que se supone que se distribuyen normalmente. Ver probit y σ.

Regla de parada se utiliza en esta guía como sinónimo de 1) un criterio de parada específico y 2) la recopilación de todos los
criterios que determinan cuándo termina una secuencia de prueba. En particular, para la prueba principal, la regla de parada
se usa en el párrafo 7 como abreviatura del criterio que se basa en la comparación de relaciones con un valor crítico.

© OCDE, (2008) 14
 OCDE/OCDE 425
ANEXO 2

PROCEDIMIENTO DE DOSIFICACIÓN

Secuencia de dosis para la prueba principal

1. Procedimiento de dosificación ascendente y descendente. Para cada corrida, los animales son dosificados, uno a la vez, usualmente a 48-
intervalos de horas. El primer animal recibe una dosis un paso por debajo del nivel de la mejor estimación de la LD50.
Esta selección refleja un ajuste por una tendencia al sesgolejos de la LD50 en la dirección dela dosis inicial inicial en la
estimación final (ver párrafo 7 de la Guía). Se espera que el patrón general de resultados se estabilice a medida que se
ajusta la dosis para cada animal subsiguiente. El párrafo 3 a continuación proporciona orientación adicional para la
elección del factor de espaciamiento de dosis.

2. Progresión de dosis predeterminada. Una vez que se deciden la dosis inicial y el espaciamiento de las dosis, el toxicólogo
debe enumerar todas las dosis posibles, incluido el límite superior (generalmente 2000 o 5000 mg/kg). Las dosis
cercanas al límite superior deben eliminarse de la progresión. La naturaleza escalonada del diseño del TG 425 permite
que las primeras dosis funcionen como una secuencia autoajustable. Debido a la tendencia al sesgo positivo, en caso
de que no se conozca nada sobre la sustancia, se recomienda una dosis inicial de 175 mg/kg. Si se va a utilizar el
procedimiento predeterminado para la prueba principal, la dosificación se iniciará a 175 mg/kg y las dosis se
espaciarán por un factor de 0,5 en una escala logarítmica de dosis. Las dosis a utilizar son 1,75, 5,5, 17,5, 55, 175, 550,
2000 o, por necesidades normativas específicas, 1,75, 5,5, 17,5, 55, 175, 550, 1750, 5000. Para determinadas sustancias
altamente tóxicas, la dosificación Es posible que la secuencia deba extenderse a valores más bajos.

3. En el caso de que se considere adecuado un factor de progresión de la dosis distinto del predeterminado, la Tabla 1 proporciona
progresiones de dosis para múltiplos enteros de pendiente, de 1 a 8.

15 © OCDE, (2008)
425 OCDE/OCDE

Tabla 1 Progresiones de dosis para la directriz de ensayo 425 de la OCDE

Elija una pendiente y lea hacia abajo la columna
Todas las dosis en mg/kg bw

Pendiente = 1 2 3 4 5 6 7 8
0,175* 0,175* 0,175* 0,175* 0,175* 0,175* 0,175* 0,175*
0.24 0.23
0.275 0.26
0.31 0.34 0.31
0.375 0.375
0.41
0.44 0.47
0,55 0,55 0,55 0,55
0,69 0,65
0.73
0.81 0.82
0.99 0.91 0.97
1.09 1.2
1.26 1.29
1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75
2.4 2.3
2,75 2,6
3.1 3.4 3.1
3.75 3.75
4.4 4.1
4.7
5.5 5.5 5.5 5.5
6.9 6.5
7.3
8.1 8.2
9.9 9.1 9.7
10.9 12
12,6 12,9
17,5 17,5 17,5 17,5 17,5 17,5 17,5 17,5
24 23
27.5 26
31 34 31

© OCDE, (2008) dieciséis

 OCDE/OCDE 425
Tabla 1 continuación

Pendiente = 1 2 3 4 5 6 7 8
37.5 37.5
44 41
47
55 55 55 55
sesenta y cinco

69 73
81 82
99 91 97
109 120
126 129
175 175 175 175 175 175 175 175
240 230
275 260
310 340 310
375 375
440 410
470
550 550 550 550
650
690 730
810 820
990 910 970
1090 1200
1260 1290
1750 1750 1750 1750 1750 1750 1750 1750
2400 2300
2750 2600
3100 3100
3750 3400
4100
5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000

* Si se necesitan dosis más bajas, continuar las progresiones a una dosis más baja

17 © OCDE, (2008)
425 OCDE/OCDE

ANEXO 3

CÁLCULOS PARA LA REGLA DE DETENCIÓN DE LA RELACIÓN DE VEROSIMILITUD

1. Como se describe en el párrafo 33 de la Directriz, la prueba principal puede completarse sobre la base de la primera
de tres criterios de parada para que ocurra. En cualquier caso, incluso si no se cumple ninguno de los criterios de suspensión, la
dosificación se detendría cuando se hayan dosificado 15 animales. Las tablas 2 a 5 ilustran ejemplos en los que las pruebas han
comenzado sin información, por lo que se han utilizado el valor inicial predeterminado recomendado, 175 mg/kg, y el factor de
progresión de la dosis predeterminado recomendado, 3,2 o medio log. Tenga en cuenta que el formato de estas tablas es solo
ilustrativo.

2. La Tabla 2 muestra cómo se detendría la prueba principal si 3 animales hubieran sobrevivido a la dosis límite de 2000
mg/kg; La Tabla 3 muestra una situación similar cuando se utiliza la dosis límite de 5000 mg/kg. (Estos ilustran situaciones en
las que no se consideró apropiado realizar una prueba de límite).a priori.) La Tabla 4 muestra cómo podría ocurrir una
secuencia particular de 5 reversiones en 6 animales probados y permitir la finalización de la prueba. Finalmente, la Tabla 5
ilustra una situación en la que no se ha cumplido ni el criterio (a) ni el criterio (b), se ha producido una reversión de la
respuesta seguida por 4 animales probados y, en consecuencia, el criterio (c) debe evaluarse también.

3. El criterio (c) exige que se evalúe una regla de interrupción de la relación de probabilidad después de probar cada animal,
comenzando con el cuarto probado después de la reversión. Se calculan tres "medidas del progreso de la prueba". Técnicamente,
estas medidas de progreso son probabilidades, como se recomienda para la estimación de máxima verosimilitud de la LD50. El
procedimiento está estrechamente relacionado con el cálculo de un intervalo de confianza mediante un procedimiento basado en la
probabilidad.

4. La base del procedimiento es que cuando se han recopilado suficientes datos, una estimación puntual de la
LD50 debe tener un respaldo más fuerte que los valores por encima y por debajo de la estimación puntual, donde el respaldo
estadístico se cuantifica mediante la probabilidad. Por lo tanto, se calculan tres valores de probabilidad: una probabilidad en una
estimación puntual de LD50 (llamada estimación aproximada o estimación de promedio de dosis en el ejemplo), una probabilidad en
un valor por debajo de la estimación puntual y una probabilidad en un valor por encima de la estimación puntual. En concreto, el valor
bajo se toma como la estimación puntual dividida por 2,5 y el valor alto se toma como la estimación puntual multiplicada por 2,5.

5. Los valores de verosimilitud se comparan calculando razones de verosimilitud y luego determinando

si estos cocientes de verosimilitud (LR) superan un valor crítico. La prueba se detiene cuando la proporción de la probabilidad de la
estimación puntual supera a cada una de las otras probabilidades por un factor de 2,5, lo que se considera que indica un apoyo
estadístico relativamente fuerte para la estimación puntual. Por lo tanto, se calculan dos razones de verosimilitud (LR), una razón de
probabilidades para la estimación puntual y la estimación puntual dividida por 2,5, y una razón para la estimación puntual y la
estimación multiplicada por 2,5.

6. Los cálculos de LD50 solos se realizan fácilmente en cualquier hoja de cálculo con probabilidad normal
funciones Los cálculos se ilustran en la Tabla 5 de este Anexo 3, que está estructurado para imitar la implementación de una
hoja de cálculo. Los pasos de cálculo se ilustran mediante un ejemplo en el que la dosis límite superior es de 5000 mg/kg, pero
los pasos de cálculo se llevan a cabo de la misma manera cuando la dosis límite superior es de 2000 mg/kg. Alternativamente,
el software autónomo, que proporciona cuadrículas de entrada de datos de animales e incorpora las fórmulas necesarias para
la estimación de LD50 y el cálculo del intervalo de confianza, está disponible para su descarga directa desde los sitios web de
la OCDE y la EPA de EE. UU. La Tabla 6 muestra una imagen de pantalla de este software.

© OCDE, (2008) 18
 OCDE/OCDE 425
Ejemplo hipotético usando una dosis límite superior de 5000 mg/kg (Tabla 5)

7. En el ejemplo hipotético que utiliza una dosis límite superior de 5000 mg/kg, la parada de LR
se cumplió el criterio después de haber probado nueve animales. La primera "reversión" ocurrió con el tercer animal probado.
El criterio de parada de LR se verifica cuando se han probado cuatro animales después de la inversión. En este ejemplo, el
cuarto animal probado después de la inversión es el séptimo animal realmente probado. Por lo tanto, para este ejemplo, los
cálculos de la hoja de cálculo solo son necesarios después de que se haya probado el séptimo animal y los datos se hayan
podido ingresar en ese momento. Posteriormente, el criterio de parada de LR se habría verificado después de probar el
séptimo animal, el octavo animal y el noveno. El criterio de parada de LR se satisface por primera vez después de probar el
noveno animal en este ejemplo.

UNA.Introduzca la información dosis-respuesta animal por animal.

columna 1 Los pasos están numerados del 1 al 15. No se pueden probar más de 15 animales.
columna 2 Coloque una I en esta columna a medida que se prueba cada animal.
columna 3. Introduzca la dosis recibida por el ielanimal.
columna 4. Indique si el animal respondió (se muestra con una X) o no respondió (se muestra con una O).

B.Los tamaños de muestra nominal y real.

8. La muestra nominal consta de los dos animales que representan la primera inversión (aquí la segunda
y terceros animales), además de todos los animales analizados posteriormente. Aquí, la Columna 5 indica si un animal determinado
está incluido o no en la muestra nominal.

El tamaño nominal de la muestra (nominalnorte) aparece en la Fila 16. Este es el número de animales en la muestra
nominal. En el ejemplo, nominalnortees 8. El número real probado aparece en la Fila 17.

C.Estimación aproximada de la DL50.

9. La media geométrica de las dosis para los animales en la muestra nominal actual se utiliza como un valor aproximado
estimación de la DL50 a partir de la cual medir el progreso. En la tabla, esto se denomina “estimador de promedio de dosis”.
Se actualiza con cada animal probado. Este promedio está restringido a la muestra nominal para permitir una mala elección
de la dosis de prueba inicial, lo que podría generar una serie inicial de respuestas o una serie inicial de falta de respuesta. (Sin
embargo, los resultados para todos los animales se usan en los cálculos de probabilidad para el cálculo final de LD50 a
continuación). Recuerde que la media geométrica denortenúmeros es el producto denortenúmeros elevados a una potencia
de 1/norte.

La estimación del promedio de dosis aparece en la Fila 18 (p. ej., (175 * 550 * ... * 1750)1/8= 1292,78). La
fila 19 muestra el logaritmo (base 10) del valor de la fila 18 (p. ej., log101292,8 = 3,112).

D.Probabilidad de la estimación aproximada de LD50.

10 La probabilidad es una medida estadística de la fuerza con la que los datos respaldan una estimación de la LD50 o
otro parámetro. Las proporciones de los valores de probabilidad se pueden usar para comparar qué tan bien los datos respaldan diferentes
estimaciones de la DL50.

11 En la columna 8, calcule la probabilidad de la estimación aproximada de LD50 del paso C. La probabilidad (Fila 21)
es el producto de las contribuciones de probabilidad para animales individuales (ver Directriz párrafo 41). La
contribución de probabilidad para ielse denota animalLi.

19 © OCDE, (2008)
425 OCDE/OCDE

12 En la columna 7 ingrese la estimación de la probabilidad de respuesta a la dosisdi, denotadoPAGSi.PAGSies

calculado a partir de una curva dosis-respuesta. Nótese que los parámetros de una curva dosis-respuesta probit son los
pendiente y la LD50, por lo que se necesitan valores para cada uno de esos parámetros. Para la LD50 se usa la estimación de promedio
de dosis de la Fila 18. Para la pendiente en este ejemplo se usa el valor predeterminado de 2. Los siguientes pasos se pueden utilizar
para calcular la probabilidad de respuestaPAGSi.

1. Calcular el logaritmo de la dosis en base 10di(Columna 6).

2. Para cada animal, calcule el puntaje z, denotadoZi(no se muestra en la tabla), utilizando las fórmulas σ =1 /
Pendiente,
Zi= ( registro10(di) - Iniciar sesión10( DL50 ) ) / σ

Por ejemplo, para el primer animal (Fila 1), σ

=1 / 2
Z1= ( 2.243 - 3.112 ) / 0.500 = -1.738

3. para el yoeldosis la probabilidad de respuesta estimada es

PAGSi=F(Zi)

dóndeFdenota la función de distribución acumulativa para la distribución normal estándar (es decir, la
distribución normal con media 0 y varianza 1).

Por ejemplo (Fila 1),

PAGS1=F(-1,738) = 0,0412

La funciónF(o algo muy similar) es normalmente lo que se da para la distribución normal en las tablas
estadísticas, pero la función también está ampliamente disponible como una función de hoja de cálculo. Está
disponible con diferentes nombres, por ejemplo, la función @NORMAL de Lotus 1-2-3 (1) y la función
@NORMDIST en Excel (2). Para confirmar que ha utilizado correctamente la función disponible en su software,
es posible que desee verificar valores familiares comoF(1.96)≈0,975 oF(1.64)≈0,95.

13 Columna 8. Calcular el logaritmo natural de la contribución de probabilidad (ln(Li)).Lies simplemente el

probabilidad de la respuesta que realmente se observó para el ielanimal:

animales respondiendo: ln(Li) = ln (PAGSi) animales

que no responden: ln(Li) = ln( 1 -PAGSi)

Tenga en cuenta que aquí se usa el logaritmo natural (ln), mientras que en otros lugares se usa la base 10 (común)
se utilizó el logaritmo. Estas elecciones son lo que normalmente se espera en un contexto dado.

Los pasos anteriores se realizan para cada animal. Finalmente:

Fila 20: Sume las contribuciones de probabilidad logarítmica en la Columna 8.

Fila 21: Calcule la probabilidad aplicando la función exp aplicada al valor de probabilidad logarítmica en
Fila 20 (p. ej., exp(-3.389) =mi-3.389= 0,0337).

MI.Calcule las probabilidades de dos valores de dosis por encima y por debajo de la estimación aproximada.

14 Si los datos permiten una estimación precisa, entonces se espera que la probabilidad sea alta si el
estimación es una estimación razonable de la LD50, en relación con las probabilidades de valores distantes de esta estimación.

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 OCDE/OCDE 425
Compare la probabilidad de la estimación del promedio de dosis (1292,8, Fila 18) con valores que difieren en un factor
de 2,5 de ese valor (es decir, a 1292,8*2,5 y 1292,8/2,5). Los cálculos (que se muestran en las Columnas 9-12) se
realizan de forma similar a los descritos anteriormente, excepto que los valores 517,1 (=1292,8/2,5) y 3232,0
(=1292,8*2,5) se han utilizado para el LD50, en lugar de 1292.8. Las probabilidades y log-verosimilitudes se muestran
en las Filas 20-21.

F.Calcular razones de verosimilitud.

15. Los tres valores de verosimilitud (Fila 21) se utilizan para calcular dos cocientes de verosimilitud (Fila 22). A
La razón de verosimilitud se utiliza para comparar el soporte estadístico para la estimación de 1292,8 con el soporte para cada uno de
los otros valores, 517,1 y 3232,0. Por lo tanto, las dos razones de verosimilitud son:

LR1 = [probabilidad de 1292,8] / [probabilidad de 517,1]

= 0,0337 / 0,0080 =
4,21
y
LR2 = [probabilidad de 1292,8] / [probabilidad de 3232,0]
= 0,0337 / 0,0098 =
3,44

GRAMO.Determinar si los cocientes de verosimilitud superan el valor crítico.

dieciséis. Las razones de verosimilitud altas se toman para indicar un respaldo relativamente alto para la estimación puntual
DL50. de la. Ambas razones de verosimilitud calculadas en el Paso F (4.21 y 3.44) exceden la probabilidad crítica.
proporción, que es 2.5. Por lo tanto, se cumple el criterio de parada de LR y se detiene la prueba. Esto se indica mediante un VERDADERO en la
Fila 24 y una nota en la parte superior de la hoja de cálculo de ejemplo que indica que se cumple el criterio LR.

LITERATURA

(1) Corporación de Desarrollo Lotus (1999). Loto- 1-2-3. Versión 9.5, Edición Millenium. Cambridge,
MA, Estados Unidos.

(2) Corporación Microsoft (1985-1997). Microsoft-Excel Versión 5.0 o posterior. Seattle, WA, Estados Unidos.

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425 OCDE/OCDE

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Tabla 6. Ejemplo de criterio de detención (c) del software autónomo para la directriz 425 de la OCDE

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ANEXO 4

CRITERIOS PARA LA CLASIFICACIÓN DE SUSTANCIAS DE PRUEBA CON DL50 ESPERADA

VALORES SUPERIORES A 2000 MG/KG SIN NECESIDAD DE ENSAYOS

1. Los criterios para la categoría de peligro 5 están destinados a permitir la identificación de sustancias de prueba que
tienen un riesgo de toxicidad aguda relativamente bajo pero que, en determinadas circunstancias, pueden presentar
un peligro para las poblaciones vulnerables. Se prevé que estas sustancias tengan una LD50 oral o dérmica en el rango
de 2000-5000 mg/kg o dosis equivalentes para otras vías. Las sustancias de ensayo podrían clasificarse en la categoría
de peligro definida por: 2000 mg/kg<LD50<5000 mg/kg (Categoría 5 en el GHS) en los siguientes casos:

a) si ya se dispone de pruebas fiables que indiquen que la DL50 se encuentra en el intervalo de valores de la categoría 5; u
otros estudios en animales o efectos tóxicos en humanos indican una preocupación por la salud humana de naturaleza
aguda.
b) a través de la extrapolación, estimación o medición de datos si no se justifica la asignación a una
categoría más peligrosa, y
• hay información confiable disponible que indica efectos tóxicos significativos en humanos, o
• se observa mortalidad cuando se analizan hasta valores de Categoría 4 por vía oral, o
• cuando el dictamen de expertos confirme signos clínicos significativos de toxicidad, cuando se analicen
hasta valores de Categoría 4, excepto para diarrea, piloerección o apariencia descuidada, o
• donde el juicio de expertos confirme información confiable que indique el potencial de un efecto
agudo significativo de los otros estudios con animales.

PRUEBAS A DOSIS SUPERIORES A 2000 MG/KG

2. Reconociendo la necesidad de proteger el bienestar animal, las pruebas en animales en los rangos de la Categoría 5 son
desaconsejado y solo debe considerarse cuando existe una gran probabilidad de que los resultados de dicha prueba
tengan una relevancia directa para proteger la salud humana.

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