Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo

Instituto de Ciencias Básicas e Ingeniería

Área académica de Química
Licenciatura en Química

Biotecnología

Julio-diciembre 2022

8º Semestre Grupo: 2

Nombre del catedrático: Dra. Maria Guadalupe Serna Díaz

Práctica 2: TINCIÓN DE MICROORGANISMOS

Integrantes del equipo y roles

 Duran Villeda Osmin: portada,
introducción, objetivos y diagrama
 Hernández Rodríguez Diana Laura:
resultados, discusión y conclusión
 Espinoza Castañeda Jesús Israel:
resultados, discusión y conclusión
 Naranjo Huautla Erika Lizbeth:
cuestionario y bibliografía
 Vera Verde Victoria Monserrat:
cuestionario y bibliografía
Introducción
Las bacterias son microorganismos que no presentan color, debido a ello para
poder identificarlos con ayuda de un microscopio estos deben ser teñidos,
(Rodriguez, J. 2005).
Las tinciones son procedimientos utilizados para teñir microorganismos y
poder visualizarlos, entre algunos están las bacterias, las cuales son teñidas
para poder observarse por ser transparentes. Las tinciones se llevan a cabo
en bacterias desecadas y calentadas para coagular sus proteínas, proceso que
se conoce como fijación (Musto, A. 2013).
La tinción más importante para diferenciar bacterias es conocida como Tinción
Diferencial de Gram. Fue inventada por Hans Christian Gram un científico
danés en 1884. A día de hoy sigue siendo una de las tinciones más utilizadas
debido principalmente a que es una prueba rápida, simple y da resultados
confiables y completos para concluir las clases de bacterias presentes. Está
tinción es de gran utilidad para laboratorios en los cuales se manejan pruebas
microbiológicas, con ella pueden establecer un diagnóstico y poder establecer
un tratamiento basado en el tipo de bacteria causante de la infección (Musto,
A. 2013), (López, L. 2014).
Se nombra “Diferencial” debido a la utilización de dos colorantes que permiten
clasificar a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram
negativas.
Los principios de la Tinción Diferencial de Gram se basan en la diferencia de
estructura de la pared celular entre las bacterias Gram positivas y Gram
negativas. Mientras que las bacterias Gram positivas poseen una pared celular
gruesa compuesta de peptidoglicano (mureína), las bacterias Gram negativas
poseen una capa delgada de peptidoglicano que está envuelta por una
membrana externa. Por ello las bacterias Gram positivas se tiñen de color
morado, debido a que el colorante cristal violeta utilizado tiene afinidad con el
peptidoglicano (queda atrapado en la capa gruesa de peptidoglicano), por el
contrario, las bacterias Gram negativas al poseer una pared celular delgada no
retienen el cristal violeta. El lugol empleado sirve como mordente que impide
que el cristal violeta salga de la pared celular, debido a la formación de un
complejo cristal violeta-yodo, el cual queda precipitado en los espacios del
peptidoglicano de la pared bacteriana. Posteriormente se emplea una mezcla
decolorante de alcohol-acetona comúnmente en proporción 30:70. La mezcla
de alcohol-acetona deshidrata la pared bacteriana de las bacterias Gram
positivas y cierra sus poros, además destruye la membrana externa de las
bacterias Gram negativas, ya que es soluble en solventes orgánicos, la
bacteria se destiñe. En este paso las bacterias Gram positivas al contener una
gran cantidad de peptidoglicano y al cerrar sus poros, retienen con mayor
fuerza el complejo cristal violeta-yodo, por el contrario, a las Gram negativas
que no lo pueden retener por su poca cantidad de peptidoglicano (en este paso
las Gram negativas se encuentran decoloradas). En el último paso, se añade
safranina (segundo colorante), el cual funciona solamente en microorganismos
decolorados, en este caso sobre las bacterias Gram negativas, las cuales
ahora son teñidas de color rojo (Musto, A. 2013), (López, L. 2014).
Al observar los resultados de esta prueba, se observará siempre y cuando
estén presentes ambos tipos de bacterias, por un lado, las Gram positivas con
coloración morada, mientras que por el otro las Gram negativas se observarán
en coloración roja, pudiendo distinguirlas, distinguir su morfología y agrupación.
Objetivo general
Aplicar una técnica de coloración diferencial para la identificación de bacterias.
Objetivos específicos
I. Conocer el fundamento de la técnica de tinción Gram para identificar a los
microorganismos aislados de muestras contaminadas.
II. Identificar a los microrganismos aislados de muestras contaminadas
sembradas en la práctica uno mediante la técnica de tinción Gram.
Diagrama
 Resultados

Tabla 1: Resumen de resultados sobre la morfología colonial

Muestra Yogurt Caldo de
Jamón Jícama
seleccionada natural pollo
Forma No definido Circular No definido Irregular
Color No definido Blanquecina No definido Blanquecino
Morfología
colonial Diámetro No definido No definido No definido No definido
Bordes No definido Ondulada No definido Ondulado
Elevación No definido Elevada No definido Elevada
Consistencia No definido Cremosa No definido Cremosa

Tabla 2: Resumen de resultados sobre la morfología microscópica

Medio de
cultivo de Agar estándar Agar estándar Caldo Nutritivo Caldo Nutritivo
procedencia

Forma de las
Bacilos Cocos Bacilos Cocos
bacterias

Morfología Gram Positiva Gram Positiva Gram Positiva Gram Negativa

Microscópica

Asociación
celular -
Tinción de
Gram
Fig. 1: Muestra 1 Fig. 3: Muestra 3
Fig. 2: Muestra 2 Fig. 4: Muestra 4
Discusión
La tinción de Gram proporciona una distinción en dos grupos principales de
bacterias dependiendo de la coloración observada bajo un microscopio
(Tripathi N., 2021). Las Fig. 1, 2 y 3 obtenidas de los medio de cultivo de agar
así como una muestra realizado en caldo nutritivo muestran una clara tonalidad
purpura obteniendo un resultado positivo para la tinción de Gram, sugiriendo
que estos microorganismos presentan una pared celular con una mayor
proporción de peptidoglicano lo que permite la retención del cristal de violeta,
contrario de lo que ocurre en una resultado negativo en la tinción de Gram para
la segunda muestra en caldo nutritivo (Fig. 4) mostrando una tonalidad rojiza,
donde la pared celular tiene una menor proporción de peptidoglicano por lo que
posterior al proceso de decoloración solo retiene la safranina (Tripathi N., 2021).
Es posible clasificar los microorganismos observados en las figuras en grupos
principales a partir de la morfología que presenta y si son Gram-positivas o
Gram-negativas. Las gram-positivas se componen de muchos géneros de
bacterias, sin embargo se puede hacer una distinción en 2 principales
categorías Cocos y Bacilos (Steward K., 2022), las Fig. 1 y 3 presentan una
morfología en forma de bastoncillos característica de bacilos no formadores de
esporas mientras que las Fig. 2 y 4 tienen una forma circular/ovalada indicando
que pertenecen a bacterias cocos, además se aprecia una morfología en
grupos y no en cadenas por lo tanto, el organismo observado pertenece a algún
miembro de la familia de Staphylococcus (Sagar A., 2022).

Conclusión
De acuerdo a los objetivos establecidos al inicio de la práctica, se logró conocer
el fundamento de la técnica de tinción de bacterias para así mismo identificar
los microorganismos que fueron aislados con anterioridad, permitiéndonos
conocer aspectos básicos de las bacterias como su morfología física y
microscópica, cuyos resultados ya ueron expresados con anterioridad.
Cuestionario
1. ¿Cuál es el fundamento de la tinción de Gram, y ¿por qué es la más
utilizada para la identificación de bacterias?
La tinción de Gram es una técnica muy sencilla que se basa en el uso de un
colorante (tinción) que permite observar las bacterias mejor que bajo el
microscopio, según la distribución del peptidoglicano de la pared celular que
las envuelve, se tiñen de una forma u otra. Así, las bacterias que no se tiñen
mediante esta técnica se denominan Gram negativas. Están formadas por una
pared más fina formada por menos capas de peptidoglicano y una segunda
membrana rica en lípidos (que repele la tinción Gram), al microscopio aparecen
incoloras.
Las Gram positivas tienen una pared celular mucho más gruesa, formada por
un gran número de capas de peptidoglicanos entre las que se inserta la tinción
Gram, dando un color violeta intenso al microscopio y se clasifican como Gram
+.(Ormaechea, 2021)

La gran aportación práctica de la tinción de Gram es que permite determinar el

tipo de antibiótico así como su eficacia. El antibiótico de elección ha de ser
capaz de atravesar la pared bacteriana, en función de si la bacteriana es Gram
positiva o negativa se seleccionará el antibiótico más eficaz.(Ormaechea, 2021)

2. ¿Cuál es la diferencia entre una tinción simple y una diferencial?

En la tinción simple el colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología
celular, a diferencia de que en la tinción diferencial, el colorante utilizado pone
de manifiesto diferencias entre células bacterianas o entre partes de una
misma célula. Estas técnicas utilizan más de un colorante o bienciertos
reactivos complementarios para la tinción, por ejemplo: Tinción de Gram,
Tinción de Ziehl-Neelsen, etc.(Santambrosio, 2009)

3. ¿Qué utilidad tiene el separar a las bacterias en Gram positivas y

Gram negativas?
Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan
en el laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas, la tinción
de Gram se considera básica en la valoración inicial de muestras para análisis
bacteriológico, siendo la mayormarte de las gram negativas, consideradas
como patógenas, sin embargo, hoy en día y con ayuda de bases de datos, es
posible diferenciar de mejor manera a las bacterias.
-Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología (medigraphic.com)
4. ¿Cuál es el paso crítico en la tinción de Gram? Explique por qué.
El paso crítico en la tinción de Gram es el paso de descoloración, que puede
ser influenciado por el espesor del frotis. Por lo demás, una solución
decolorante fresca es muy reactiva, por lo que el resultado debería ser
evaluado cuidadosamente. Durante la descoloración, los tiempos indicados
aquí deberían ser respetados con máxima exactitud, ya que de lo contrario se
podrían presentar resultados incorrectos.(Romeis,2015)
5. ¿A qué se debe que unas células retengan el colorante primario y
otras el secundario?
La pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa
fina de peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las
bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por
peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular externa; así pues, la
composición química y el contenido de peptidoglicano en la pared celular de
las bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y determina las
características tintoriales.
-Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología (medigraphic.com)

6. ¿Qué otros microorganismos, además de las bacterias, se tiñen con la

técnica de Gram?

La tinción de Gram no solo sirve para bacterias, sino también para algunos
hongos y parásitos, no obstante, esta técnica tiene algunos inconvenientes,
como la contaminación con otros microorganismos y la imposibilidad de
visualizar algunas bacterias(Tobón, 2012).

7. ¿Por qué se considera la tinción Gram como una tinción diferencial?

La tinción Gram es considerada como una tinción diferencial debido a que
se utiliza más de un colorante o bien ciertos reactivos complementarios para
llevar a cabo la tinción, además de que se desea observar las características
morfológicas de las bacterias,debido a que estas permiten que las células se
visualicen de mejor manera y se puedan diferenciar las distintas especies por
su coloración, (Santambrosio, 2009)

8. Explica los procesos que se llevan a cabo con la adición de cada

reactive de la tinción en cada grupo de microorganismos (Gram positivos
y negativos).
La tinción de Gram se basa en colocar como colorante primario cristal violeta,
el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana.
Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida
del cristal violeta por la formación de un complejo cristal violetayodo que satura
los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana. En seguida, se coloca
una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra
los poros de la misma, también destruye la membrana externa de las bacterias
Gram negativas debido a que ésta es soluble a la acción de solventes
orgánicos, como la mezcla de alcoholacetona. Las bacterias Gram positivas,
al contener una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza
este complejo, mientras que las Gram negativas no lo pueden retener por tener
menos cantidad de peptidoglicano. Por último, se coloca safranina, la cual
funciona como un colorante secundario o de contratinción y sirve para teñir las
bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo.
-Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología (medigraphic.com)
9. Menciona dos ejemplos de tinciones diferenciales y la utilidad de cada
una
 Tinción de Ziehl-Neelsen
La tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de coloración para identificar
microorganismos alcohol-ácido resistentes (AAR). El nombre de este
procedimiento de microbiología hace referencia a sus autores: el bacteriólogo
Franz Ziehl y el patólogo Friedrich Neelsen.(Equipo Editorial, 2021)
Esta técnica es un tipo de coloración diferencial, lo que implica el uso de
distintos colorantes con la finalidad de crear contraste entre las estructuras que
se desean observar, diferenciar y posteriormente identificar. La tinción de Ziehl-
Neelsen sirve para identificar ciertos tipos de microorganismos.En la tinción de
Ziehl-Neelsen se utiliza el compuesto fenólico carbol fucsina, un colorante
básico. Este tiene la capacidad de interactuar con los ácidos grasos de la pared
celular, la cual es de textura cerosa a temperatura ambiente.(Equipo Editorial,
2021)

 Tinción Ácido-Alcohol Resistentes

Las tinciones ácido-alcohol resistentes se usan para teñir extensiones

preparadas de muestras son sospecha de contener mycobacterias. El
contenido de lípidos de la pared celular de los bacilos ácido-alcohol resistente
dificulta la tinción de los organismos. En las tinciones ácido-alcohol resistentes,
el fenol permite que la tinción penetre, incluso después de la exposición a los
decolorantes. Para que un organismo se denomine ácido-alcohol resistente,
debe resistir la decoloración por ácido-alcohol. Se usa entonces una
contratinción para destacar el organismo teñido.(Ziehl, 1882)
Bibliografía

 Eduardo, S. (2009). practivoIV. Recuperado el 25 de Agosto de

2022, de
https://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotec
nologia/practico4.pdf
 Equipo editorial. (19 de febrero de 2021). Tinción de Ziehl-
Neelsen. Lifeder. Recuperado de https://www.lifeder.com/tincion-
ziehl-neelsen/
 Luis Esaú López-Jácome,* Melissa Hernández-Durán,* Claudia
Adriana Colín-Castro,* Silvestre Ortega-Peña,* Guillermo Cerón-
González,* Rafael Franco-Cendejas. (Enero-Marzo 2014). Las
tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Investigación
en discapacidad, 3, 10-18.
 Ormaechea, E. (11 de Agosto de 2021). Salud. Recuperado el 25
de Agosto de 2022, de https://www.salud.mapfre.es/pruebas-
diagnosticas/otras-pruebas-diagnosticas/tincion-de-gram/
 Romeis - Mikroskopische Technik, Editors: Mulisch, Maria,
Welsch, Ulrich, 2015, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 19.
Auflage
 Tobón, G. A. (2012). Microbiologia. Recuperado el 25 de Agosto
de 2022, de https://www.medigraphic.com/pdfs/medlab/myl-
2012/myl1211-12d.pdf
 Ziehl, F. 1882. Zur Farbung des Tuberkelbacillus. Dtsch. Med.
Wochenschr. 8:451

o Rodriguez, J. T., & Cohrs, D. P. (2005). Microbiologia, lo esencial

y lo practico. Universidad Francisco Marroquin.
o Musto, A. (2013). Manual de Microbiología y Parasitología (2.a
ed.). Universidad Nacional Arturo Jauretche.
o López, L. (2014, enero). Las tinciones básicas en el laboratorio
de microbiología. Academia. Recuperado 31 de agosto de 2022,
de
https://www.academia.edu/11540697/Las_tinciones_b%C3%A1
sicas_en_el_laboratorio_de_microbiolog%C3%ADa