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UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA CURRICULAR DE BIOLOGÍA

BIOLOGÍA DE LOS MICROORGANISMOS (2017773)


BITÁCORA DE LABORATORIO

NOMBRE Aislamiento bacteriano y Tinción de Gram


PRÁCTICA
DOCENTES Yih Wen Fung Jimena Sanchez Nieves
GRUPO 2 FECHA PRÁCTICA Jueves, 12 de septiembre
FECHA ENTREGA Viernes, 20 de HORA ENTREGA 12:00 pm
septiembre
:
INTEGRANTES 1. Dylan Alexander Rodriguez Diaz 2.Laura Milena Hernández
3. Santiago David Ordoñez Mazabel 4.Shakti Michelle Muñetones Martinez
5. 6.

La identificación y clasificación de microorganismos ha resultado vital en el


desarrollo médico y biotecnológico, a lo largo de la historia han ido surgiendo
métodos más seguros, confiables y eficientes para tales fines.

Existe una gran cantidad de pruebas a realizar para la identificación y clasificación


de microorganismos. La microscopía constituye uno de los principales métodos de
CONTEXTO ayuda diagnóstica, siendo la microscopía óptica la de menor resolución y abarcando
una gama de variantes como la de fase de contrastes, campo oscuro, fluorescente
hasta electrónica. Otro método de estudio lo establecen el uso de tinciones como
pueden ser los estudios en fresco, tinciones diferenciales y fluorescentes. Los
cultivos también son una de las principales herramientas diagnósticas para la
identificación de microorganismos, entre los cuales se destacan los medios no
selectivos enriquecidos, selectivos y diferenciales y los especializados. El uso de
pruebas bioquímicas es una herramienta fundamental en la microbiología desde el
uso de baterías bioquímicas convencionales hasta el uso de BBL Crystal. El
diagnóstico molecular constituye uno de los métodos más avanzados para la
identificación microbiana pues permite una mayor resolución y especificidad. los
medios de diagnóstico serológico son una alternativa eficiente para la detección.

Si bien la técnica Tinción de gram es eficiente para cierto acercamiento al


problema, solo permite saber la presencia y aspecto superficial del microorganismo
en cuestión, dejando aparte consideraciones tan importantes como distinguir entre
colonización e infección del patógeno (Tobón & Hoyos, 2012). Además,
dependiendo de las maniobras y sutilezas que tenga el experimentador al realizar el
frotis sobre la lámina, dependerá la correcta clasificación ya que los abultamientos
de bacterias pueden alterar el color aparente del microorganismo. Este tipo de
tinción es viable como primer encuentro microscópico, pero es de gran relevancia
valorar el estado del ambiente natural donde actúa el organismo, por ejemplo si una
zona cutánea tiene hinchazón o no.
Para el desarrollo de esta práctica combinada sólo se tuvieron en cuenta el análisis
macroscópico de las colonias, coloración diferencial mediante la tinción de Gram,

Versión: 1-2 Fecha: Enero 2018 Diseñado por: Yih Wen Fung
cultivo por agotamiento y posterior identificación microscópica de los
microorganismos.

HIPÓTESIS / ¿De acuerdo a diferentes colonias bacterianas alojadas en cajas de Petri,


Pregunta de qué caracteres morfològicos y clasificatorios se pueden hallar mediante la
investigación técnica Tinción de Gram?
¿Es la tinción de gram una forma adecuada para identificar si el aislamiento
bacteriano se realizó de manera correcta?
OBJETIVOS Aprender las diferentes características de la morfológicas para la identificación
bacteriana a partir del reconocimiento macroscópico
Describir microscópicamente los microorganismos sembrados en la caja de petri.
Aislar colonias bacterianas mediante la técnica de agotamiento o por estrías.
Realizar tinción de Gram a diferentes colonias para su posterior análisis y
clasificación.

MATERIALES Asa bacteriológica. Caja de Petri: con colonias, con agar y


Y sola.
EQUIPOS Microscopio, láminas y laminillas Elementos de bioseguridad: guantes,
gorro, tapabocas y bata
Mechero de alcohol

COLORANTES Cristal Violeta Fucsina


Y Lugol Aceite de inmersión
REACTIVOS Alcohol acetona

M SESIÓN 1:
e 1. Introducción teórica.
t 2. Identificación de características macroscópicas de las colonias de las cajas entregadas
o para realizar un repique.
d 3. Montaje de frotis en láminas con método húmedo y seco.
o 4. Coloración de Gram
l 5. Identificación microscópica de microorganismos.
o 6. Siembra de microorganismos a partir de las colonias observadas.
g
i SESIÓN 2:
a 7. Análisis del crecimiento de microorganismos en las cajas sembradas a las 24 horas.
8. Montaje de frotis en láminas con método húmedo y seco.
9. Coloración de Gram
10. Identificación microscópica de microorganismos.
11. análisis comparativo de resultados.

Versión: 1-2 Fecha: Enero 2018 Diseñado por: Yih Wen Fung
R MUESTRA 1 AUMENTO: 40x
E ORIGEN: Ambiental TIPO: Micropreparado TINCIÓN: Tinción de Gram
S OBSERVACIONES:
U
L En un primer acercamiento a la
T colonia problema, se puede
A observar ya una clara
D distinción entre dos tipos de
O microorganismos, que
S levemente dan indicios de
bacterias Gram negativas y
posibles levaduras en un tono
morado más oscuro.

MUESTRA 2 AUMENTO:100x
ORIGEN: Natural TIPO: Micropreparado TINCIÓN: Tinción de Gram
OBSERVACIONES:
En la siguiente imagen se
pueden apreciar bacterias de
tipo bacilo Gram negativas,
con un abultamiento de otra
clase de microorganismo
identificado como levaduras.
La preparación fue realizada en
húmedo y posteriormente
sometida a diversos reactivos
para conseguir la tinción de
Gram.
En esta imagen particularmente
se observan a detalle la vacuola
de forma voluminosa y
tenuemente el núcleo de la
levadura.

Versión: 1-2 Fecha: Enero 2018 Diseñado por: Yih Wen Fung
MUESTRA 3 AUMENTO:100x
ORIGEN: Natural TIPO: Micropreparado TINCIÓN: Tinción de Gram
OBSERVACIONES:

Se observan estructuras en
forma de levaduras y bacilos
Gram negativos sin una
organización definida respecto
a su forma.
En la siguiente muestra se
realizó un frotis y fijación en
seco.

R COLONIA DE COCOS GRAM NEGATIVOS AUMENTO: NO APLICA


E ORIGEN: Ambiental TIPO: Colonia Bacteriana TINCIÓN: NO APLICA
S OBSERVACIONES:
U
L Muestra de una colonia de
T bacterias posteriormente
A identificadas como cocos
D Gram negativos. Es de aclarar
O que debido a cuestiones
S externas de la fotografía, como
la luz transportada por el
diafragma, es difícil apreciar el
color original de las UFC ya
que en realidad son amarillas
opaco y el agar usado es
Nutritivo, por lo que tiene
tonalidades claras.

Versión: 1-2 Fecha: Enero 2018 Diseñado por: Yih Wen Fung
R ILUSTRACIÓN DE COLONIA 4 AUMENTO: 100x
E ORIGEN: Ambiental TIPO: Micropreparado TINCIÓN: Tinción de Gram
S OBSERVACIONES:
U Tinción de gram en seco
L (izquierda):
T Se evidencian bacilos gram
A negativos que no están
D agrupados. Se distinguen con
O mucha facilidad.
S Tinción de gram en húmedo
(derecha):
Bacilos gramnegativos un poco
más amontonados, esto puede
deberse a un exceso de colonia
tomado por el asa.

Muestra No.1, 2 y 3 de la colonia 1 y 2

En esta muestra se observan 2 tipos de colonias cuyas descripciones macroscópicas están


consignadas en la tabla 1 y las muestras 1,2 y 3. Debido a la presencia de 2 colonias reconocibles
D se procedió a realizar el montaje de frotis para cada una de las colonias. los posteriores análisis
I microscópicos lograron evidenciar que no solo se trataba de 2 colonias sino de 2 tipos de
S microorganismos. Por un lado la el frotis y la coloración de Gram permitieron el reconocimiento
C de las colonias rosa salmón, las cuales se identificaron como Bacilos Gram positivos mientras
U que las de color blanco evidenciaron una población de bacterias en forma de Bacilo y Gram
S negativas y Levaduras.
I En la muestra 4 que corresponde a la colonia 4 (Tabla 1) se evidenciaron bacilos gramnegativos,
Ó para llegar a esta conclusión a la muestra se le realizaron dos tinciones; en húmedo y en seco,
N posteriormente en la observación de ambas tinciones se encontraron bacilos gramnegativos. Estas
bacterias gram negativas poseen ciertas características por ejemplo; su pared de lipopolisacarido
les confiere características tóxicas o patogénicas, esto se conoce como endotoxina de las bacterias
gram negativas.(Algorta)
D En el repique realizado a las colonias 1 y 2 se evidenció por medio de la observación
microscópica que hubo un crecimiento de levaduras, la colonia inicial de la que se tomó la
E muestra se encontraba contaminada con estos hongos levaduriformes por lo tanto en el repique se
evidencia su crecimiento también, esto dificultó el aislamiento de las colonias al momento de la
siembra y no permitió una correlación óptima entre el medio inicial y el cultivo final. Entre más
R tiempo de vida, manipulación y exposición al ambiente tenga un cultivo, mayor será el riesgo de
E contaminación de este, por lo que si este cultivo primario del cual se tomó el inóculo ya había sido
S utilizado en prácticas anteriores, su contaminación es más probable.
U Las primeras observaciones microscópicas distaron bastante en relación con las segundas y no
L presentaron un crecimiento adecuado, pues solo se desarrolló hasta el segundo cuadrante de la

Versión: 1-2 Fecha: Enero 2018 Diseñado por: Yih Wen Fung
T siembra por agotamiento sin embargo el aislamiento por agotamiento resultó ser una muy útil
A herramienta para aislar colonias de un medio de cultivo en el que se encontraban, pues se aisló
D satisfactoriamente la colonia 3, esto ocurre gracias a que al hacer la siembra se flamea cada vez
O que se va a dibujar una estría con el objetivo de disminuir la cantidad de carga microbiana
S arrastrada por el asa.(Fung)
Teniendo en cuenta que es uno de los primeros laboratorios, la falta de experticia y destreza aún
no ha llegado a desarrollarse, por lo que otra razón factible podría ser la impericia de los operarios
al momento de manejar el área de esterilidad alrededor del mechero y el uso adecuado del asa al
momento de la siembra. (esterilización, dejar enfriar correctamente y la toma del inóculo).

Respecto al color de la colonia, tomando una posición comparativa respecto a otras zonas de
trabajo, las cajas de petri que presentaban una tonalidad opaca y poco brillante eran generalmente
Cocos, mientra las colonias translúcidas eran Bacilos, como en este caso. Es importante resaltar
que la llegada de levaduras pudo deberse a la contaminación anterior a la práctica realizada, pero
que, por lo demás nos ayuda a comprender que la tinción de gram, aunque solo sirva para
identificación de bacterias, dio las bases para establecer que el color que difería en la colonia
problema representaba la inclusión de levaduras.

Muestra 3
En esta muestra se observaron unidades formadoras de colonia con un color amarillento opaco,
además su consistencia era cremosa y no tenía una transmisión de luz directa, por lo que era
opaca; Se tomaron dos muestras para realizar los métodos de frotis: húmedo y seco. En el frotis
húmedo con el asa bacteriológica se aplicó una gota de agua en una laminilla, posteriormente se
tomó una parte de la colonia bacteriana y se realizó el frotis que luego se fijó al calor; En el frotis
seco se tomó una muestra de la colonia y fue fijada al calor; una vez realizada las muestras de
frotis, se procede a realizar Tinción de Gram que arroja el resultado de bacterias Cocos Gram
negativas, es decir que poseen una tonalidad rosa, lo que indica que la composición de la pared
celular de estas bacterias, tiene una cantidad de capas de peptidoglicano relativamente pequeña.
En la muestra que fue sembrada a partir de estas UFC iniciales se pudieron observar las mismas
características y se determinó que la muestra no llegó a contaminarse.
C
O -El método de aislamiento por agotamiento es muy eficiente para aislar colonias de manera
N óptima, siempre y cuando se lleve a cabo un buen manejo de las técnicas de asepsia que eviten la
C contaminación.
L
U -La tinción de Gram permite identificar de manera diferencial las características microscópicas de
S los microorganismos, principalmente si son Gram positivos o Gram negativos y nos facilitan
I observar su morfología y organización, permitiendo corroborar los resultados obtenidos antes y
O después de una siembra
N
E -Puede existir una posible correlación entre la luz reflejada por la colonia y su naturaleza
S microscópica, así como tonalidades de color diferencial observables a simple vista para la
identificación de microorganismos contaminantes o agregados.

-El método de frotis húmedo puede resultar muy útil en algunos casos para permitir que los
microorganismos queden mas separados para luego realizar la caracterización microscópica,
mientras que el frotis en seco tiene el riesgo de dejar las muestras apiñadas, lo que impide poder
diferenciarlas.

Versión: 1-2 Fecha: Enero 2018 Diseñado por: Yih Wen Fung
B
I 1. Algorta, G. Bacilos Gram Negativos no exigentes: Eenterobacteriaceae,
B Vibrionaceae, Pseudomonas.http://higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2022.pdf
L 2. Brooks, G. F., Carroll, K. C., Butel, J. S., Morse, S. A., & Mietzner, T. A. (2014).
I Microbiologia Médica de Jawetz, Melnick & Adelberg-26. AMGH Editora
O 3. Fung, YW. Laboratorio 3- Aislamiento de microorganismos, Biología de
G Microorganismos, Departamento de Biología, Universidad Nacional de Colombia.
R https://campus.virtual.unal.edu.co/pluginfile.php/1392683/mod_resource/content/1/
A GUIA%20LAB%20%23%203%20Aislamiento%20microbiano.pdf
F 4. Jácome et al. 2014. Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología.
Í https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
A 5. Murray, P. R., Rosenthal, K. S., & Pfaller, M. A. (2017). Microbiología médica.
Elsevier Health Sciences.
Tobón & Hoyos, (2012) Tinción de Gram de tejido: Alcances y limitaciones. Módulo
7, Microbiologìa, número 9. Editora Médica Colombiana S.A. 2012.
6. Rodríguez et al. Hans Christian Gram y su tinción. Sección de Micología, Hospital
General Manuel Gea González.
7. Rodriguez,P,. Arenas,R.,(2018) Hans Christian Gram y su tinción. Dermatología
cosmética, Médica y Quirurgica, Volúmen 16, Numero 2.
https://www.medigraphic.com/pdfs/cosmetica/dcm-2018/dcm182n.pdf
8. López-Jácome et al. (marzo, 2014) Las tinciones básicas en el laboratorio de
microbiología.
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf

ANEXOS:

COLONIA 1 COLONIA 2 COLONIA 3 COLONIA 4

FORMA Puntiforme Puntiforme Circular Circular

BORDE Entero Entero Entero Entero

ELEVACIÓN Plana Plana Plana Plana

SUPERFICIE Lisa Liso Lisa Lisa

CONSISTENCIA Cremosa Cremoso Cremoso Cremoso

COLOR Rosa salmón Crema blanca Amarillo BLANCA

LUZ Translúcida Translúcida opaca Translúcida


TRANSMITIDA

LUZ Brillante Brillante opaca opaca


REFLEJADA
Tabla 1. Descripción macroscópica del estado actual de la colonia problema.
Realizado a partir de los parámetros establecidos en la guia de trabajo.

Versión: 1-2 Fecha: Enero 2018 Diseñado por: Yih Wen Fung
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