UNIVERSIDAD NACIONAL

AGRARIA LA MOLINA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA

CURSO: Laboratorio de microbiología

Profesora: Yvette Ludeña Hinojosa

Informe 1

PRÁCTICA - Tinción diferencial Gram

Apellidos y Nombres de Integrantes Código

Rengifo Gonzales Jaqueline Stefanny 20191141

Llontop García-Zapatero, Mara Cecilia 20191129

LA MOLINA – LIMA – PERÚ

I. Introducción

Existe una gran diversidad de colorantes que en su mayoría son compuestos

orgánicos y que su fundamento radica en que estos colorantes están cargados
positivamente para que se puedan combinar con los compuestos “negativos”, como
los ácidos nucléicos y los polisacáridos (cristal violeta, azul metileno, entre otros).
Por otro lado, hay colorantes que están cargados positivamente como la eosina, la
fucsina ácida, etc.
La tinción Gram es una técnica de laboratorio que nos permite diferenciar dos
grupos importantes de bacterias; las Gram positivas y las Gram negativas. El
fundamento de esta técnica radica en que la pared celular de las bacterias Gram
positivas tiene una gruesa capa de peptidoglicano, mientras que la pared celular de
las Gram negativas tiene una delgada capa de peptidoglicano y se encuentra unida
a unida a una segunda membrana plasmática exterior por medio de lipoproteínas
(Vargas A, et al. 2016).

Para el procedimiento, la aplicación bacteriana se fija a una placa y se calienta al

fuego por un tiempo corto porque la muestra puede quemarse después de ser teñida
con los diversos reactivos mencionados anteriormente. Al igual que el cristal violeta
restante por 30 segundos, se dejó lugol por 1 min, alcohol por 20 segundos y
finalmente safranina por 30 segundos, y las muestras se lavaron con agua destilada
Después del secado manual, se observa al microscopio la separación de grupos de
bacterias Gram negativas y positivas según el color.

El fundamento de la tinción de Gram radica en que las bacterias están cargadas

negativamente por ello, cuando el cristal violeta hace contacto con la muestra tiene
una afinidad por la pared celular debido a la carga positiva del cristal violeta (básico).
Por consiguiente, el lugol (mordiente) cuando es agregado luego de lavarse la
muestra va a incrementar la afinidad de este colorante con el peptidoglucano debido
a que va a formar un complejo que consiste en: cristal violeta + lugol + proteína
ribonucleares. Pero cuando se le pone el alcohol cetona, este cumple una función
completamente diferente, decolora mediante la deshidratación del peptidoglucano.
En el caso de las Gram positivas por tener una capa más gruesa el cristal violeta
queda retenido dentro de la pared celular debido a que los poros están cerrados, en
cambio en las Gram negativas el cristal violeta logra ser desprendido de la pared
celular de naturaleza lipídica, soludibilizándose por el alcohol. Para cuando entra la
safranina, no logra ingresar a las Gram positivas porque los poros han sido cerrados,
tiñéndose de tonalidades azules o moradas. Por otro lado, la pared de las Gram
negativas logra captar a la safranina adaptando su tonalidad roja-fucsia.
II. Objetivo General

● Conocer el fundamento de la Tinción de Gram

III. Objetivo Específico

● Realizar la tinción de dos tipos de bacteria

● Familiarizarse con la técnica de fijación bacteriana y tinción diferencial
● Describir la morfología de microorganismos aplicando la técnica de
observación.

IV. Metodología

Preparación de Frotis
Para iniciar la práctica de tinción de Gram , se debe limpiar inicialmente el
portaobjetos donde se realizará el frotis , dejar secar, con un marcador trazar el
espacio donde se colocará la muestra y colocar una gota de solución salina , luego
se procede a calentar el asa de siembra hasta observar que el metal esté al rojo vivo
y se deja enfriar cerca al mechero para evitar que se contamine nuestros materiales,
tomar el tubo de ensayo con el cultivo contaminado del que se realiza el frotis, para
evitar contaminación, de igual manera se debe pasar levemente por la flama del
mechero , con el fin de evitar contaminación de la muestra, con el asa de siembra
realizar un leve raspado de la muestra que se examinara y se transfiere una
muestra pequeña sobre la gota de agua destilada , trazando de manera estriada
hasta obtener un frotis uniforme.

Fijación bacteriana
Para realizar la fijación bacteriana, se debe utilizar el frotis previamente preparado,
mediante calor se procede a fijar la muestra , con el mechero encendido y el
portaobjeto con el frotis ,se debe acercar la muestra a la flama del mechero con el
frotis hacia arriba , durante 5 minutos aproximadamente continuar moviendo la
muestra cerca a la flama, el calor se controla acercando la muestra al dorso de la
mano y tocarlo de manera que sea soportable la temperatura al tacto, hasta que se
seque completamente y se forme una película de manera blanquecina y luego secar
al aire.

Tinción
Para realizar el último paso , se procede a la tinción en sí , aplicando los diferentes
colorantes. Se inicia aplicando de manera considerable , que cubra todo el frotis el
colorante básico cristal violeta durante 30 seg , lavar con agua destilada con la
piseta, posteriormente se aplicar lugol que se utiliza como mordiente formándose el
complejo cristal violeta-yodo durante 60 seg y se lava , seguidamente se aplica el
alcohol cetona ,usado como decolorante en un intervalo de 10 - 20 seg, este
permitirá que se pueda observar si se retienen o no los colorantes,según el tipo de
 bacteria presente y se procede a lavar , por último se coloca la safranina durante el
cual es un colorante de contraste o también llamado colorante secundario durante
30 seg y se procede a lavar. Luego se deja secar cerca al mechero o al aire del
ambiente .

Microscopia
Observar al microscopio a 100X con el aceite de inmersión para identificar tipo,
morfología y contaminación en la muestra.

V. Resultados/Discusión

El metodo de Tincion de Gram permite diferenciar el tipo de bacteria según

características morfológicas, se basa principalmente en la tinción de bacterias con el
colorante cristal violeta luego la decoloración con el alcohol cetona , este proceso se
lleva a cabo en las Gram - ,mientras que en las Gram + el colorante permanece,
posteriormente se utiliza el colorante contrastante (Safranina) para identificar Gram
- como. De esta manera los microorganismos quedan expuestos a la identificacion ,
los microorganismos Gram + se observan de color violeta , mientras que Gram - se
observan de color rosa (Mora, X. 2012).

Se observa en la figura 2 con aumento de 100X con aceite de ricino la presencia de

estreptobacilos Gram positivos , identificados principalmente por la morfología de
manera de tubos en cadena característicos de bacilos y por la forma consecutiva
uno a otro estreptobacilo .
Por la coloración violeta se identificó el tipo de Gram , la coloración se debe a la
presencia de membrana celular gruesa de peptidoglicano en forma de malla
permeable , en el cual permite la permanencia del colorante en la membrana celular
(Murray, P. 2017).

Figura 1. Observación microscópica de estreptobacilos Gram positivo . Tinción de Gram

100X. (Elaboración propia)

Se observa en la figura 1 con aumento de 100X con aceite de ricino la presencia de

estreptobacilos negativos, identificados debido a la forma tubular típica de bacilos y
al posicionamiento en forma de cadena característico de estreptobacilo.
 Debido a la coloración se pudo llegar a identificar el tipo de bacteria, en este caso
Gram negativa por ser fucsia que es típico de una capa delgada de peptidoglucano
que no retiene el cristal violeta por esa misma razón.

Figura 2.Observación microscópica de estreptobacilos Gram negativos .Tinción de Gram

100X (Elaboración propia).

Se observa en la figura 3 con aumento de 100X con aceite de ricino la presencia de

estafilococos positivos, identificados debido a la forma circular típica de cocos y al
posicionamiento en forma de cadena con varias hileras ubicadas aleatoriamente por
zonas que es característico de estafilococos.
Debido a la coloración se pudo llegar a identificar el tipo de bacteria, en este caso
Gram positiva por ser morado azulado que es típico de una capa gruesa de
peptidoglucano que retiene el cristal violeta por esa misma razón.

Figura 3. Observación microscópica de Staphylococcus Gram positivo .Tinción de Gram

100X (Elaboración propia).

VI. Conclusiones
● Las bacterias Gram positivas (figura 1 y 3) tienen una capa gruesa de
peptidoglicano lo que permite la mayor fijación del cristal violeta reteniendo el
color morado azulado, mientras que las Gram negativas (figura 2) por su
delgada capa de peptidoglicano no puede retener el cristal violeta por lo que
el único colorante retenido es la safranina.
 ● La fijación bacteriana fue aplicada exitosamente debido a que las muestras
se pudieron observar con claridad usando el aceite de inmersión en el
microscopio.
● Se clasificaron las bacterias mediante su morfología, estreptobacilos (figura 1
y 2) y estreptococos (figura 3).

VII. Referencias bibliográficas

López-Jácome, L. E., Hernández-Durán, M., Colín-Castro, C. A., Ortega-Peña, S.,
Cerón-González, G., & Franco-Cendejas, R. (2014). Las tinciones básicas en el
laboratorio de microbiología. Investigación en discapacidad, 3(1), 10-18.

Cardona Villarroel, Ninoska, Rojas Agreda, Carlos, & Zabalaga Salcedo, Lilian.
(2008). Leucocituria y tinción de gram para el diagnóstico de infección urinaria.
Revista de la Sociedad Boliviana de Pediatría, 47(2), 81-85. Recuperado en 19 de
mayo de 2022, de
http://www.scielo.org.bo/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1024-067520080002000
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Hernández, Francisco, & Moraga, Manuel. (1997). Valor diagnóstico de la tinción de

Gram en las vaginosis bacterianas. Revista Costarricense de Ciencias Médicas,
18(1), 49-58. Retrieved May 18, 2022, from
http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-2948199700010000
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Mora, X. (2012). Diferenciando bacterias gram+ y gram. Selecciones Avicolas,

25-27.

Murray, P. R., Rosenthal, K. S., & Pfaller, M. A. (2017). Microbiología médica.

Elsevier Health Sciences.

Vargas. A, Martínez E, Montero D, Pérez F, Potte S. (2016). Informe de Laboratorio

tinción Gram.
https://www.udocz.com/apuntes/174998/informe-de-laboratorio-tincion-de-gram