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Analytica Quimica Acta 1164 (2021) 338519

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Analítica Química Acta

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Determinación de colorantes prohibidos en especias rojas mediante cromatografía

líquida de ultra alta resolución-ionización a presión atmosféricaespectrometría de
masas en tándem

A. Arrizabalaga-Larrán ~agaun, S. Epigmenio-Chamúb, FJ Santosun, E. Moyanoun,*

unDepartamento de Ingeniería Química y Química Analítica, Universidad de Barcelona Av. Diagonal 645, E-08028, Barcelona, España
bFacultad de Estudios Avanzados Cautitlán, Universidad Nacional Autónoma de México, Av. 1o de Mayo S/N, Santa María Las Torres, Campo Uno, 54740,
Cuautitla- n Izcalli, México

Destacar Gráficamente abstracto

- Comportamiento de ionización a presión

atmosférica de colorantes Sudán y rodamina
B.
- EMnortey estudios de espectrometría de
masas de alta resolución para caracterizar los
iones del producto.
- Los estudios de efecto matriz mostraron
un mejor desempeño en APCI y APPI
frente a ESI.
- Nuevo método UHPLC‒APCI‒MS/MS para
la determinación de ocho colorantes
prohibidos en especias.

información del artículo resumen

Historial del artículo: Este artículo informa sobre el desarrollo de un método de espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida de rendimiento ultraalto (UHPLC‒MS/MS) para
Recibido el 5 de enero de 2021 determinar ocho tintes prohibidos (Sudan I-IV, Sudan Orange, Sudan Red 7B, Para Red, Rhodamine B) en productos de cúrcuma, curry y chile. Para ello, se evaluó la
Recibido en forma revisada el 7
factibilidad de electrospray (ESI), ionización química a presión atmosférica (APCI) y fotoionización a presión atmosférica (APPI) para la ionización de estos compuestos. Se
de abril de 2021
estudió la fragmentación por espectrometría de masas en tándem (MS/MS) de todos los compuestos objetivo y se utilizaron espectrometría de masas multietapa y
Aceptado el 11 de abril de 2021 Disponible
espectrometría de masas de alta resolución para establecer las vías de fragmentación e identificar comportamientos de fragmentación comunes. Entre los iones más
en Internet el 17 de abril de 2021
significativos, Se seleccionaron los iones de producto más característicos y abundantes observados en el triple cuadrupolo para proponer un método UHPLC‒MS/MS

(modo de monitoreo de reacción múltiple, MRM) selectivo y sensible de estos compuestos objetivo en muestras de especias después de una extracción rápida y fácil con
Palabras clave:
acetonitrilo. Los estudios de efecto de matriz (ME) realizados en las tres fuentes de ionización a presión atmosférica han demostrado que APCI mostró el mejor
Tintes azo prohibidos
rendimiento con valores de ME que oscilan entre 2 y 25 %. Además, los parámetros de calidad estimados indicaron el buen desempeño del método propuesto,
Especias
Cromatografía líquida proporcionando límites de detección del método bajos (MLOD) (1 Los estudios de efecto de matriz (ME) realizados en las tres fuentes de ionización a presión atmosférica

Ionización a presión atmosférica han demostrado que APCI mostró el mejor rendimiento con valores de ME que oscilan entre 2 y 25 %. Además, los parámetros de calidad estimados indicaron el buen
Espectrometría de masas en tándem desempeño del método propuesto, proporcionando límites de detección del método bajos (MLOD) (1 Los estudios de efecto de matriz (ME) realizados en las tres fuentes

de ionización a presión atmosférica han demostrado que APCI mostró el mejor rendimiento con valores de ME que oscilan entre 2 y 25 %. Además, los parámetros de

calidad estimados indicaron el buen desempeño del método propuesto, proporcionando límites de detección del método bajos (MLOD) (1mi48metrog kg-1), buena

precisión intradiaria (RSD % < 15 %) y cuantificación exacta (error relativo % < 15 %). Finalmente, la aplicabilidad del método desarrollado se demostró mediante el

análisis de productos de cúrcuma, curry y chile. En total, se analizaron 36 muestras diversas provenientes de diferentes países y, aunque ninguno de estos compuestos

se detectó por encima de los MLOD, el análisis de las muestras enriquecidas mostró que el método fue capaz de detectar esta familia de compuestos a niveles bajos.

metrog kg-1.

©2021 Elsevier BV Todos los derechos reservados.

* Autor correspondiente.
Dirección de correo electrónico:encarna.moyano@ub.edu (E.Moyano).

https://doi.org/10.1016/j.aca.2021.338519 0003-2670/©2021
Elsevier BV Todos los derechos reservados.
A. Arrizabalaga-Larrán~aga, S. Epigmenio-Chamú, FJ Santos et al.
1. Introducción
El color es uno de los atributos alimentarios más críticos, siendo considerado
uno de los parámetros que determinan la aceptación de los productos hacia el
consumidor. Sin embargo, el color natural de muchos productos alimenticios
puede perderse durante su fabricación y, por lo tanto, algunas sustancias
coloreadas se utilizan con frecuencia para restablecer y mantener su apariencia
inicial. Los colorantes naturales se han utilizado durante siglos para dar color a los
alimentos, aunque hoy en día, la industria alimentaria suele preferir los colorantes
artificiales/sintéticos a los naturales. Aunque podemos encontrar una amplia
gama de colores en la naturaleza, los adecuados como colorante alimentario son
limitados. Además, los tintes artificiales se pueden producir en masa a un costo
menor en una amplia variedad de colores y pueden ser más duraderos. Sin
embargo, el uso de estas sustancias sintéticas para dar color a los alimentos está
regulado para garantizar la seguridad alimentaria [1] ya que algunos de ellos
pueden ser nocivos para la salud humana. Por ejemplo, colorantes como Sudan I,
Sudan II, Sudan III, Sudan IV, Sudan Orange G, Sudan Red 7B, Rhodamine B y Para
Red, entre otros, están prohibidos en productos alimenticios para consumo
humano [2] debido a su teratogenicidad, genotoxicidad [3] y efectos cancerígenos.
Para Red y todos los colorantes de Sudán son colorantes sintéticos
solubles en grasa con una estructura química similar (Figura 1) que contiene
anillos aromáticos y grupos azo (minorte¼nortemi).Estudios de toxicidad
sobre Sudán I-IV [4,5] han demostrado que estos compuestos pueden
inducir algunas formas de cáncer de hígado y vejiga en animales. Por lo
tanto, han sido clasificados como carcinógenos de Clase III por la Agencia
Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) [6]. Además, los
expertos señalan que sería prudente suponer que la rodamina B [7], así
como Para Red, Sudan Red 7B y Sudan Orange, también deben considerarse
compuestos genotóxicos y cancerígenos potenciales [8]. Esto se debe a que
la rodamina B ha mostrado una toxicidad potencial similar a la de Sudan I-IV,
y falta información sobre la toxicidad de Para Red, Sudan Red 7B y Sudan
Orange. Aunque el uso de esta familia de compuestos como colorantes
alimentarios ha sido prohibido [2,9], todavía se utilizan ilegalmente para
mejorar la percepción de la calidad de los productos alimenticios. Por
ejemplo, las especies en polvo se han adulterado ocasionalmente con
colorantes azoicos para intensificar estos productos de color rojo.10],
convirtiéndose en un riesgo para la salud pública. Sin embargo, Sudán I, III,
IV, Rhodamine B y Para Red se han detectado en chili, curry,
Figura 1.Estructuras químicas y fórmula química de los colorantes prohibidos estudiados.
2
Analytica Quimica Acta 1164 (2021) 338519
y productos de cúrcuma en niveles de concentración que van de 1 a 8700
metrog kg-1[11mi13].
Estos tintes prohibidos han sido determinados por cromatografía líquida
(LC) usando cromatografía de fase reversa y detección espectrofotométrica
(LC/UVmivista) [14,15]. Sin embargo, la técnica más utilizada para su
determinación es la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de
masas en tándem (LC‒MS/MS) ya que la espectrometría de masas en
tándem permite superar las limitaciones observadas en otras técnicas
proporcionando alta sensibilidad, selectividad e información estructural para
la identificación, confirmación y caracterización de analitos en matrices
complejas a bajos niveles de concentración [dieciséis]. La mayoría de estos
métodos LC‒MS/MS utilizaban electrospray (ESI) como técnica de ionización
[17mi19]. Sin embargo, solo unos pocos trabajos han explorado la ionización
de colorantes azoicos por ionización química a presión atmosférica (APCI) [
20,21] y fotoionización a presión atmosférica (APPI) [22]. Aunque estos
estudios destacan las ventajas de la espectrometría de masas en
comparación con los sistemas de detección espectrofotométrica (UV/PDA),
no profundizan en el mecanismo de ionización a presión atmosférica de
estos compuestos y, en general, de la mayoría de los iones seleccionados
para la LC.miEl método MS/MS no está completamente asignado. Además,
algunos de estos estudios solo se centran en la determinación de algunos de
estos colorantes en algunas muestras de especias.
El presente trabajo tuvo como objetivo estudiar el rendimiento de
ionización de ocho colorantes prohibidos azoicos/no azoicos
seleccionados en tres fuentes de ionización a presión atmosférica (API)
(ESI, APCI y APPI) para identificar cuál proporciona el mejor
rendimiento para la detección simultánea selectiva y sensible.
determinación de estos compuestos en varias muestras de especias
mediante LC‒MS/MS utilizando un analizador de masas de triple
cuadrupolo (QqQ). La compatibilidad de una extracción de muestra
simple y rápida con el uso de estas fuentes de API también se exploró
mediante el estudio del efecto de matriz de los coextractos de muestras
de especias (cúrcuma, curry y chile) en la ionización de estos
compuestos objetivo.
A. Arrizabalaga-Larrán~aga, S. Epigmenio-Chamú, FJ Santos et al.
2. Materiales y métodos
2.1. Reactivos y patrones
Todos los productos químicos eran de grado reactivo analítico. Sudán I ( 96 %),
Sudán II (96%), Sudan III (96%), Sudan IV (96%), Sudan Red 7B 96%),
( Sudan Orange G (96%), Para Red (97%) y Rhodamine B 97%) se
( compraron de Sigma- Aldrich (Steinheim, Alemania).
Las estructuras químicas de los compuestos estudiados se muestran enFigura 1.
Soluciones madre individuales (1000 mg L-1) de Sudan I, Sudan II, Sudan
Orange G, Sudan Red 7B y Rhodamine B se prepararon en acetonitrilo. Por el
contrario, el dimetilsulfóxido (DMSO) fue el disolvente utilizado para las
soluciones madre de Sudán IV y Para Red y se empleó acetona para preparar
la de Sudán III. Soluciones individuales intermedias (300 mg L-1) y una
solución de mezcla estándar (50 mg L-1) que contenían todos los compuestos
objetivo se prepararon mensualmente a partir de la solución estándar
madre mediante la dilución adecuada en acetonitrilo. Todas estas soluciones
estándar se almacenaron a 4 C hasta su uso. Se usó la calibración
Matrixmatched para corregir los efectos de la matriz en el rango de
concentración (15mi10,000metrog kg-1para la cúrcuma y el curry, y de 50 a
10.000metrog kg-1para chile). Los extractos se filtraron a través de 0,22
metrom Filtros de membrana de nailon (Whatman, Clifton, NJ, EE. UU.)
antes de su inyección en la UHPLCmisistema MS/MS.
Dimetilsulfóxido EMSURE®ACS (99,0 %), ácido fórmico (98 %),
formiato de amonio (98 %), acetato de amonio (98 %), ácido acético
(99,7 %), clorobenceno y tolueno para HPLC (99 %), anisol anhidro (99,7
%) , tetrahidrofurano (99,7%), y acetonitrilo y agua de LCmigrado MS, se
adquirieron de Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania). Acetona (LiCrosolv
®,pureza 99,8%) se obtuvo de Honeywell (Charlotte, North Caroline,
USA), y cloruro de sodio (99%) de Panreac Química SA (Barcelona,
España). Los solventes utilizados como componentes de la fase móvil
fueron filtrados a través de filtros de membrana de Nylon de 0.22-
metrom tamaño de poro (Whatman, Clifton, NJ, EE. UU.) antes de su
uso.
Nitrógeno (99,95%) utilizado para la ionización por electropulverización
calentada (HmiESI), APCI y APPI se adquirieron de Linde (Barcelona,
España), y el argón de alta pureza (<99,999 %) utilizado como gas de
disociación inducida por colisión (gas CID) en el instrumento de triple
cuadrupolo se adquirió de Air Liquide (Madrid). , España).
2.2. Instrumentación LC‒MS y condiciones de trabajo
Para el método cromatográfico se utilizó un sistema UHPLC equipado
con una bomba cuaternaria Accela 1250, un automuestreador Accela y un
horno de columna (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, EE. UU.). La
separación de fases inversa se llevó a cabo en un Accucore C18columna
analítica (100 mm 2,1 mm id.) llena de partículas superficialmente porosas
(2,6metrotamaño de partícula m) adquirido de Thermo Fisher Scientific. La
separación cromatográfica se realizó utilizando el modo de elución en
gradiente con una fase móvil compuesta por (disolvente A) ácido fórmico/
tampón acuoso de formiato de amonio (pH 3,75, 20 mM) y (disolvente B)
acetonitrilo. El programa de elución en gradiente comenzó con un 60 % de
disolvente A (40 % de disolvente B) durante 2,5 min, seguido de un gradiente
lineal que elevó el disolvente B al 90 % (10 % de disolvente A) en 1,5 min.
Finalmente, el solvente B se elevó al 100% durante 2 min, y estas
condiciones se mantuvieron en un paso isocrático durante 2 min más antes
de volver a las condiciones iniciales. El volumen de inyección fue de 10
metroL, el caudal de la fase móvil fue de 600metroL min-1, y la
temperatura del horno de la columna se mantuvo a 25 C durante la
ejecución cromatográfica.
El sistema UHPLC se acopló a un espectrómetro de masas TSQ Quantum
Ultra AM (Thermo Fisher Scientific) equipado con un analizador de masas de
triple cuadrupolo. Tres fuentes API (H-ESI, APCI y APPI) podrían
intercambiarse en este espectrómetro de masas TSQ. Los parámetros de
trabajo para H-ESI, APCI y APPI fueron los siguientes: vaporizador y
3
Analytica Quimica Acta 1164 (2021) 338519
las temperaturas capilares fueron de 350 C y 250 C, respectivamente; las presiones
del gas del nebulizador y del gas auxiliar fueron 50 y 25 unidades arbitrarias (au),
respectivamente; el voltaje de la aguja de electrospray se mantuvo en±3 kV en H-
ESI, mientras que la corriente de descarga de corona se fijó enþ6/-6metroA en
APCI, y en APPI se utilizó una lámpara de criptón que emite fotones de 10,6 eV.
Finalmente, se optimizó el voltaje de compensación de la lente del tubo para cada
compuesto, y los valores oscilaron entre 15 y 50 V. Con respecto a la fuente APPI,
se compararon la fotoionización directa y la ionización asistida por dopantes, y
varios dopantes (acetona, tolueno, tetrahidrofurano, anisol y clorobenceno) se
añadieron después de la columna a la fase móvil utilizando una pieza en T de
volumen muerto cero. Se seleccionó el clorobenceno como el dopante más
apropiado, y la mejor respuesta se obtuvo cuando se añadió clorobenceno a una
velocidad de flujo del 5% de la velocidad de flujo de la fase móvil después de la
columna.
Los datos espectrales de masas se adquirieron en los modos de barrido
completo y barrido de iones producto para estudios de ionización y
fragmentación, mientras que el modo de monitorización de reacciones múltiples
(MRM) se utilizó con fines de cuantificación, operando ambos cuadrupolos (Q1 y
Q3) a una resolución de 0,7m/zancho completo medio máximo (FWHM). En MRM,
se monitorearon dos transiciones para cada compuesto utilizando 50 ms de
tiempo de permanencia, que fue suficiente para adquirir al menos 23 puntos de
datos en cada pico cromatográfico. La presión del gas de colisión (argón) se fijó en
1,5 mTorr. El XcáliburvSe utilizó el software 2.1 (Thermo Fisher Scientific) para
controlar la configuración del instrumento, así como para adquirir y procesar los
datos de MS.
Los estudios de fragmentación en varias etapas de los compuestos
objetivo se llevaron a cabo en un espectrómetro de masas híbrido (trampa
de iones lineales-Orbitrap), LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific)
utilizando la fuente APCI en modo de iones positivos y negativos. El LTQ-
Orbitrap también se acopló a un sistema de bomba Accela UHPLC (Thermo
Fisher Scientific). Las soluciones estándar individuales, preparadas en una
mezcla adecuada de solventes, se infundieron a 10metroL min-1usando una
bomba de jeringa e introducido en la corriente de la fase móvil (ácido
fórmico/formiato de amonio (pH 3,75, 20 mM): acetonitrilo, (1:1,v/v)300
metroL min-1a través de una pieza en T de volumen muerto cero Valco para
administrar una concentración final de 10 mg L-1en la fuente de ionización.
Las condiciones óptimas de trabajo de APCI fueron las siguientes: corriente
de descarga, 5metroUN; presión del gas envolvente, 40 au; presión de gas
auxiliar, 10 au; y temperaturas del vaporizador y capilar 400 y 350 C,
respectivamente. Con respecto a los parámetros de la trampa de iones
lineales, el ancho de aislamiento fue de 1.0m/z,mientras que el tiempo de
activación y Q de activación se fijaron en 30 ms y 0,25, respectivamente. EM
norteLos datos se adquirieron en el Orbitrap en modos de iones positivos y
negativos de barrido completo (100mi500m/z)a una resolución de 30.000
FWHM (am/z200). El Slens RF se fijó en 60 %, mientras que el tiempo máximo
de inyección y el objetivo de AGC se ajustaron en 200 ms y 106,
respectivamente. Se utilizó el software Xcalibur v2.1 (Thermo Fisher
Scientific) para controlar la configuración del instrumento y adquirir y
procesar el MS y el MSnortedatos.
2.3. Muestras y tratamiento de muestras
En este estudio se analizaron un total de 36 muestras diversas
(cúrcuma, curry y chile en polvo). En los mercados españoles se
compraron muestras procedentes de diferentes países (India, España,
Francia, Alemania, México y Chile) (Tabla S1).
El tratamiento de la muestra se realizó de la siguiente manera: se
pesaron 5 g de muestra en un tubo falcon y se añadieron 5 mL de
acetonitrilo. Después de agitar con un vórtice durante 0,5 min, la solución de
muestra se sonicó durante 15 min y se centrifugó durante 15 min a 4800
rpm. El extracto sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22metrom
Filtro de nailon y almacenado enþ4 C hasta su análisis. Finalmente, 10metro
L del extracto final se inyectó en el sistema UHPLC‒MS/MS.
A. Arrizabalaga-Larrán~aga, S. Epigmenio-Chamú, FJ Santos et al. Analytica Quimica Acta 1164 (2021) 338519

2.4. Control de calidad y validación de métodos
Se introdujeron soluciones estándar de control de calidad y blancos
de procedimiento entre los análisis de estándares y muestras para
garantizar la calidad de los resultados y controlar la separación LC y la
sensibilidad del sistema LC‒APCI‒MS/MS.
Para estimar la eficiencia de extracción (EE, %), tanto una muestra
de polvo de especias en blanco (cúrcuma, curry y chile) como la
correspondiente enriquecida se sometieron al mismo procedimiento de
extracción. Los resultados cuantitativos obtenidos tras su UHPLCmiAPI
miSe compararon las determinaciones MS/MS usando estándares
preparados en la fase móvil. Adicionalmente, se estimó el efecto matriz
(EM, %) en el proceso de ionización para cada compuesto a partir de la
diferencia relativa entre el área del pico observada en el análisis del
extracto blanco enriquecido y la obtenida de las mezclas estándar
preparadas en la fase móvil al mismo tiempo. nivel de concentración
Los límites instrumentales y de método de detección (ILOD y MLOD) y los
(pH 3,75, 20 mM) y (B) acetonitrilo se seleccionaron como componentes de la fase
móvil en el modo de elución en gradiente como se describe en la Sección
2.2. De esta forma, los ocho colorantes prohibidos se separaron en menos
de 8 min, obteniendo buenas formas de pico y resolución de línea de base
excepto Rodamina B y Sudán Naranja G, que coeluyeron parcialmente (
Figura 2). Aunque estos compuestos se pueden separar por espectrometría
de masas en función de las diferencias de susm/zTambién se estudió la
supresión o potenciación de la señal debida a la coelución de estos
compuestos mediante la inyección de soluciones individuales (100metrog L
-1) y una mezcla de ambos compuestos (100metrog L-1). Los resultados
demostraron que las áreas de los picos mostraron diferencias inferiores al
10 %, que fueron similares al RSD% de precisión intradía, lo que indica que la
coelución de rodamina B y naranja de Sudán G no influyó en sus respuestas.
3.2. Estudios de comportamiento de ionización a presión atmosférica

límites de cuantificación (ILOQ y MLOQ) se estimaron como S/N de 3 y 10,

respectivamente. Además, la linealidad dentro del rango de concentraciones
de trabajo (15mi10,000metrog L-1para soluciones estándar y 15mi10,000
metrog kg-1para soluciones de calibración emparejadas con matriz) fue
estudiado. Tanto la precisión intradiaria como interdiaria y la veracidad del
método se estimaron utilizando muestras de curry y cúrcuma en blanco
enriquecidas a temperatura media (150metrog kg-1) y baja (100metrog kg
-1) niveles de concentración. No obstante, estos parámetros se evaluaron
para Sudán II y Sudán III en cúrcuma en blanco y Sudán I en curry a niveles
de concentración de 250metrog kg-1y 200metrog kg-1, respectivamente. En
el caso del chile, el nivel de concentración bajo correspondió a 30metrog kg
-1y la concentración media de uno a 100metrog kg-1para todos los
compuestos excepto Sudán I, para el cual el nivel de concentración utilizado
fue 100metrog kg-1(bajo) y 200metrog kg-1(medio).
El electrospray en modo de iones positivos ha sido la técnica de ionización
elegida tradicionalmente para la determinación por LC‒MS de colorantes Sudan [
11,23] a pesar del importante efecto matriz que suele presentar esta técnica de
ionización. Sin embargo, APCI y APPI generalmente se ven menos afectados por el
efecto matriz y pueden promover la ionización eficiente de los analitos a través de
reacciones de moléculas de iones en fase gaseosa. Por estas razones, el
comportamiento de ionización de estos compuestos objetivo a través de las tres
fuentes API (ESI, APCI, APPI) se ha evaluado en modos de iones tanto positivos
como negativos. De esta manera, cada solución estándar individual de estos
compuestos objetivo se inyectó en el sistema UHPLC‒API‒MS usando el método
óptimo

3. Resultados y discusión

3.1. Cromatografía líquida

En este estudio, la separación cromatográfica de los compuestos

objetivo se llevó a cabo en un UHPLC de fase reversa (Accucore C18),
rellena con partículas superficialmente porosas para aprovechar el
rendimiento ultraalto que ofrece esta tecnología, que debería
proporcionar una separación cromatográfica altamente eficiente en un
tiempo de análisis corto.
Se probaron varias fases móviles y programas de elución en
gradiente para optimizar la separación cromatográfica de colorantes
prohibidos de Sudán y rodamina B. El metanol y el acetonitrilo fueron
evaluados como modificadores orgánicos mostrando al acetonitrilo los
mejores resultados en términos de resolución cromatográfica y tiempo
de análisis. Por lo tanto, se llevaron a cabo más estudios con fases
móviles a base de acetonitrilo. Como disolvente acuoso exploramos el
uso de (i) ácido acético al 0,1 %, (ii) acetato de amonio 10 mM:ácido
acético (pH: 4,0), (iii) ácido fórmico al 0,1 %, (iv) formiato de amonio 20
mM:ácido fórmico (pH: 3,75). Los resultados mostraron que cuando se
usó ácido acético, el primer compuesto eluido (Rodamina B) mostró un
pico de cola y menos retención. Sin embargo, los tampones de formiato
de amonio y ácido fórmico favorecieron la retención y produjeron picos
mucho más simétricos.
con el amonio cuaternario de Rodamina B, lo que aumentaría la
hidrofobicidad de este compuesto y favorecería su retención en el C18
fase estacionaria. Además, la neutralización de las cargas positivas
(amonio cuaternario y amina terciaria) en esta molécula podría evitar
interacciones secundarias como el enlace de hidrógeno con los grupos
Figura 2.Cromatograma UHPLC‒APCI‒MS/MS correspondiente a una solución de mezcla
silanol en la superficie de las partículas de sílice, proporcionando así un
estándar (5 mg L-1) de compuestos específicos obtenidos en condiciones óptimas de
pico más simétrico. elución en gradiente. (1) rodamina B; (2) Sudán Naranja G; (3) Para Rojo; (4) Sudán I; (5)
Por lo tanto, (A) tampón acuoso de ácido fórmico/formiato de amonio Sudán II; (6) Sudán III; (7) Rojo Sudán 7B; (8) Sudán IV.

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A. Arrizabalaga-Larrán~aga, S. Epigmenio-Chamú, FJ Santos et al. Analytica Quimica Acta 1164 (2021) 338519

condiciones de trabajo para cada fuente de ionización (ver sección2.2). tabla
1muestra la asignación de iones y la abundancia relativa de iones
observados en las tres fuentes API (HmiESI, APCI y APPI asistida por
clorobenceno). Todos los tintes de Sudán mostraron principalmente la
molécula protonada [MþH]þen modo de ion positivo, mientras que la
rodamina B produjo el ion molecular [M]þya que es una sal de amonio
cuaternario. Sin embargo, Para Red mostró una mejor relación señal-ruido
de iones (S/N) en modo de iones negativos ya que la conjugación de los
grupos para-nitro y 2-naftalol a través de la funcionalización azo favoreció la
desprotonación del hidroxilo. Por lo tanto, para monitorear todo el conjunto
de compuestos en una sola corrida con una sensibilidad satisfactoria, se
requirió un cambio de polaridad antes y después del área de elución de Para
Red. Cabe señalar que las ventanas cromatográficas entre Sudan Orange y
Para Red (tventana: 0,65 min) y entre Para Red y Sudán I (tventana: 0,18 min)
eran lo suficientemente altas para evitar el corte de pico durante el cambio
de polaridad. bajo HmiESI, los compuestos objetivo no formaron iones de
aducción ni iones de fragmentos CID en la fuente (Figura S1A1: Sudán II y
Figura S1B1: Rojo Sudán 7B). Sin embargo, al ionizar Sudan II y Sudan Red 7B
en condiciones APCI, siempre se observaron algunos iones de fragmentos
CID en la fuente (Rel. Ab. < 30%) (Figura S1A2: Sudán II yFigura S1B2: Rojo
Sudán 7B). Con respecto a APPI, fue posible ionizar todos los compuestos
objetivo en modo de iones positivos sin el uso de un dopante. El alto número
de dobles enlaces y grupos donantes de electrones presentes en la
estructura química de estos compuestos podría disminuir su potencial de
ionización facilitando la fotoionización directa. Sin embargo, como es bien
sabido, en el modo de iones negativos, el mecanismo de fotoionización
siempre ocurre a través de dopantes asistidos.24]. Por esta razón, se
probaron varios dopantes (acetona, tolueno, clorobenceno, anisol y
tetrahidrofurano) para estudiar su efecto sobre la ionización de estos
analitos. Estos estudios se realizaron utilizando las condiciones
cromatográficas previamente optimizadas para la separación de estos
compuestos. Todos los compuestos objetivo generaron un tipo similar de
iones en APPI (Figura S2). El pico base en el espectro de masas de barrido
completo de los colorantes de Sudán siempre fue el ion [MþH]þ, y en ningún
caso se observó ningún catión radical a través del intercambio de carga,
incluso en ausencia de dopantes próticos. La rodamina B siempre produjo la
[M]þcomo pico base en APPI incluso cuando se agregan dopantes con altas
afinidades de protones como acetona y tetrahidrofurano. Por el contrario,
en modo de iones negativos, Para Red produjo el [M - H]‒sin la presencia de
iones de aducción o iones de fragmentos CID en la fuente. Por lo tanto, para
comparar la eficiencia de ionización de los modos APPI directos y asistidos
por dopantes (usando diferentes dopantes), la señal del pico base de cada
compuesto en el caso respectivo se normalizó al máximo.
señal intensa observada para cada compuesto (Figura S3). Los
resultados mostraron que APPI asistido por dopante usando
clorobenceno proporcionó el área de pico más alta para la mayoría de
los analitos, aunque el uso de tolueno como dopante también
proporcionó respuestas satisfactorias para Sudan Orange y Sudan I.
Por lo tanto, como compromiso, se realizaron más experimentos de
APPI con clorobenceno como dopante (Figura S1A3: Sudán II yFigura
S1B3: Rojo Sudán 7B). El porcentaje de clorobenceno añadido al caudal
total de la fase móvil también se optimizó dentro del rango de 1mi10%
(v/v).Las respuestas más altas se obtuvieron al 5% (v/v),sin una mejora
significativa a mayores porcentajes de clorobenceno.
3.3. Cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem
Se evaluó el uso de espectrometría de masas en tándem para mejorar la
detectabilidad y sensibilidad de la UHPLCmiMS y para garantizar la
identificación precisa y la determinación cuantitativa de los compuestos
objetivo. Para cada colorante prohibido, se estudió el barrido de iones
producto de los iones generados en las fuentes API utilizando diferentes
energías de colisión. Los iones de producto más abundantes y
característicos se seleccionaron a partir de estos resultados para desarrollar
un método UHPLC‒MS/MS selectivo y sensible utilizando el modo MRM (
Tabla 2). La fragmentación CID en un triple cuadrupolo podría dificultar la
identificación inequívoca de los iones producto debido a la fragmentación
por colisión múltiple, más aún, cuando existen átomos de nitrógeno en la
estructura química. Por esta razón, se utilizó un LIT‒Orbitrap para
determinar el orden genealógico de los iones producto y la masa exacta
correspondiente, lo que permitió determinar la composición elemental y la
vía de fragmentación, especialmente para aquellos iones producto que se
seleccionaron con fines cuantitativos y de confirmación. .Tabla S2yFigura S4
resumir los iones de producto observados en el LIT-Orbitrap hasta MS3
usando APCI en modo de iones positivos para los tintes estudiados, excepto
Para Red, que se adquirió en modo de iones negativos. Aunque la
fragmentación MS/MS de Sudan I-IV, Para Red y Rhodamine B se han
estudiado previamente en instrumentos de espectrometría de masas de
baja y alta resolución y sus iones de fragmento casi se identificaron [25,26],
su vía de fragmentación no ha sido reportada hasta el momento. Además,
hay menos información reportada sobre la fragmentación CID y la ruta de
fragmentación de Sudan Red 7B y Sudan Orange G. Por esta razón, el
presente trabajo muestra un resumen de los resultados de Sudán I-IV y
brinda información adicional sobre las rutas de fragmentación que
complementan lo que ya estaba publicado. Al mismo tiempo, también se
incluye un estudio de fragmentación más detallado para el resto de
compuestos.

tabla 1
Asignación de iones generados en H-ESI, APCI y APPI (dopante:clorobenceno) en condiciones óptimas.

Compuesto ESI APCI aplicación

m/z (rel. Ab. %) Ion m/z (rel. Ab. %) Ion m/z (rel. Ab. %) Ion
Asignación Asignación Asignación

Sudán I 249.1 (100) [METROþH]þ 249.1 (100) [METROþH]þ 249.1 (100) [METROþH]þ

156.1 (16) [METROþHC6H5O]þ

Sudán II 277.1 (100) [METROþH]þ 277.1 (100) [METROþH]þ 277.1 (100) [METROþH]þ

156.1 (10) [METROþHC8H11NORTE]þ 156.1 (21) [METROþHC8H11NORTE]þ

120.1 (12) [METROþHC10H7NO]þ 120.1 (25) [METROþHC10H7NO]þ

Sudán III 353.2 (100) [METROþH]þ 353.2 (100) [METROþH]þ 353.2 (100) [METROþH]þ

Sudán IV 381.2 (100) [METROþH]þ 381.2 (100) [METROþH]þ 381.2 (100) [METROþH]þ

224.2 (14) [METROþHC10H7NO]þ

Sudán Naranja G 215.1 (100) [METROþH]þ 215.1 (100) [METROþH]þ 215.1 (100) [METROþH]þ

Sudán Rojo 7B 380.2 (100) [METROþH]þ 380.2 (100) [METROþH]þ 380.2 (100) [METROþH]þ

183.1 (36) [METROþHC12H11norte3]þ 183.1 (65) [METROþHC12H11norte3]þ

Rodamina B 443.2 (100) [METRO]þ 443.2 (100) [METRO]þ 443.2 (100) [METRO]þ

Para rojo 292.1 (100) [MH]- 292.1 (100) [MH]- 292.1 (100) [MH]-

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Tabla 2
Transiciones MRM utilizadas en UHPLCmiAPCI‒MS/MS.

Compuesto ión precursor Triple cuadrupolo (QqQ) LIT-Orbitrap Asignación de iones

(m/z) Transición Producción (m/z) NC (V) Relación de iones±Dakota del Surun m/z (ppm)

Sudán I 249.1 q 93.1 30 1.62±0.04 93.0570 (-3.2) [METROþHC10H5NO]þ

q 232.1 15 232.0984 (-4.7) [METROþHOH]þ-
Sudán II 277.1 q 120.1 20 2.49±0.01 120.0811 (3.0) [METROþHC10H7NO]þ
q 106.1 45 106.0649 (-1.6) [METROþHC11H9NO]þ
Sudán III 353.2 q 92.1 38 1.71±0.04 mi [METROþHCdieciséisH11norte3O]þ

q 197.1 dieciséis 197.0943 (-2.3) [METROþHC10H6NO]þ-

Sudán IV 381.2 q 225.1 15 2.40±0.01 225.1256 (-2.1) [METROþHC10H6NO]þ
q 106.1 35 106.0650 (-1.1) [METROþHC17H13norte3O]þ
Sudán Naranja G 215.1 q 93.1 25 1.14±0.03 93.0570 (3.0) [METROþHC6H4NO2]þ
q 198.1 15 198.0782 (-2.9) [METROþHOH]þ-
Sudán Rojo 7B 380.2 q 115.1 40 3.66±0.05 115.0541 (-1.0) [METROþHC15H15norte5]þ
q 183.1 15 183.0909 (-4.2) [METROþHC12H11norte3]þ
Rodamina B 443.2 q 399.2 50 2.95±0.06 399.1715 (3.1) [MC3H8]þ
q 355.1 50 355.1077 (-0.1) [MC3H8-C3H8]þ
Para rojo 292.1 q 264.1 15 2.01±0.02 264.0662 (-1.6) [MHN2]-
q 138.0 25 138.0193 (-2.7) [MHC10H6norte2]-

unSD, desviación estándar (n:5), Q: ion de cuantificación, q: ion de confirmación.

Sudan I-IV, Para Red y Sudan Red 7B comparten una estructura
química similar basada en anillos aromáticos (fenilo y naftilo), que
contienen uno (Sudan I, Sudan II y Para Red) o dos (Sudan III, Sudan IV,
Sudan Rojo 7B) grupos azo. También tienen un hidroxilo en R1, excepto
Sudan Red 7B que presenta un grupo aminoetilo en esta última
posición (Figura 1). Con respecto a la fragmentación de CID en modo de
iones positivos, los tintes de Sudán que contienen unb-El grupo naftol
mostró la escisión del doble enlace azo como una vía de fragmentación
común, lo que condujo a dos iones de producto principales: el ion
nitreno derivado del resto naftol y los iones amina derivados del resto
fenilo. Estos tintes de Sudán mostraron un ión de producto común en
m/z156.0444 (ion de primera generación) correspondiente al ion
nitreno cuando el sustituyente R1era un grupo hidroxilo. Este hecho
indica que el hidrógeno del hidroxilo podría participar en el mecanismo
de fragmentación favoreciendo que la carga positiva permanezca en el
resto naftilo después de la escisión del enlace azo. Además, en el MS3
espectros de masas dem/z156.0444, un ion producto enm/zSe observó
174.0550. Este ion producto puede deberse a la formación de un ion
aducto con agua, lo que puede explicarse por la presencia de trazas de
agua en el nitrógeno utilizado como gas de colisión y el que permanece
dentro del analizador de masas, así como por la mayor tiempo de
residencia de los iones dentro de la trampa de iones [27]. Además, la
EM3espectros de masas también mostraron un ion producto enm/z
128.0495, que puede imputarse a la pérdida de una unidad CO. Este ion
de producto formó además un ion de aducción con agua produciendo
el ion enm/z146.0600. Además, y como se discutió antes, la escisión del
grupo azo generalmente condujo a iones de amina pares e impares.
Por ejemplo, Sudan III y Sudan Red 7B tienen un grupo azofenílico
como R3sustituyente, y por lo tanto su escaneo de iones de producto
mostró los iones de producto comunes enm/z198.1026 [C12H12norte3]þ
ym/z197.0943 [C12H11norte3]þ. Estos iones provienen de la escisión del
segundo grupo azo para producir los iones amina, [MþHC10H5NO]þ(m/z
198.1018) y [MþHC10H6NO]þ- (m/z197.0943) para Sudán III y [MþHC12H
10norte2]þ(m/z198.1021) para Sudán Red 7B (Tabla S2, Figura S4).
Además, Sudán I y Sudán Orange (m/z93.0570), así como Sudán II (m/z
120.0811) y Sudán IV (m/z225.1256), también mostró estas pérdidas en
la formación de los iones producto de primera generación, que fueron
seleccionados para fines de cuantificación. Por otro lado, la escisión de
los dos grupos azo de Sudán III dio lugar a dos iones de producto
abundantes y característicos con carga restante en el resto fenilo que
se seleccionaron para la cuantificación. (m/z92.1) y confirmación (m/z
197.1). Sin embargo, el ion producto enm/z92.1 no fue posible
confirmarlo mediante experimentos LIT-Orbitrap debido a que los
fenómenos de corte que ocurren en la trampa de iones
por lo general no logran atrapar iones en el extremo inferior de lam/zrango
(por debajo de ~1/ 3 delm/zvalor del ion precursor) durante la excitación por
resonancia CID tandem MS. Además, el ion producto proveniente de la
pérdida directa de un radical hidroxi fue seleccionado como ion
confirmatorio para Sudan Orange (m/z198.0788) y Sudán I (m/z232.0984),
mientras que para Sudán II y Sudán IV el ion seleccionado para propósitos
de confirmación fue el ion de producción común de primera generación en
m/z106.0649 que correspondía a un ión radical dimetilbencilo originado por
laun- escisión del grupo azo.
Con respecto al espectro MS/MS de Sudan Red 7B en el triple
cuadrupolo, se observaron iones de producto intensos en la región de abajo
m/z170 (Fig. 3UN). El cambio observado en el máximo de las curvas de
energía de colisión (Fig. 3B) para estos iones de baja producción podría
sugerir que eran iones de producción de mayor generación, que podrían ser
producidos por múltiples colisiones en la celda de colisión. Este hecho se
pudo confirmar en el APCI-MSnorteespectros de Sudan Red 7B en modo de
iones positivos utilizando el LIT-Orbitrap (Figura 4). Por ejemplo, aunque el
ion producto seleccionado para la cuantificación (m/z115.0541) estuvo
presente en baja abundancia en el MS2espectros, también se pudo observar
en el MS3espectros dem/z183.0913 como producto de segunda generación.
Estos iones de producto (m/z183.0913) podría asignarse a la escisión del
doble enlace azo que conduce al ion nitreno derivado del resto naftol,
mientras que elm/z
115.0541 podría atribuirse a la pérdida consecutiva de C3H4norte2
(68,0369 Da). Por otro lado, el catión Rodamina B, que también se observó
en modo iónico APCI positivo, mostró una fragmentación CID baja tanto en
el triple cuadrupolo como en la trampa de iones. Por lo tanto, el principal ion
producto observado enm/z399.1703 se asignó a un ion de primera
generación formado por la pérdida de una unidad de propano (44.0620 Da)
del ion molecular [M]þ. Además, el ion seleccionado con fines de
confirmación (m/z355.1077) se observó en el MS3espectro (trampa de iones)
dem/z399.1703 indicando que se trataba de un ión de producción de
segunda generación proveniente de la pérdida consecutiva de otra unidad
de propano. En cuanto a Para Red, que mostró una mejor sensibilidad en el
modo de iones negativos, el MS2El espectro (trampa de iones) de su
molécula desprotonada solo mostró dos iones de producto enm/z
264.0662 ym/z138.0193 que fueron seleccionados para fines de
cuantificación y confirmación, respectivamente. Estos iones de producción
de primera generación fueron el resultado de la escisión del enlace azo para
perder tanto el resto naftilo como el N.2, en este último caso a través de un
reordenamiento [28].
A partir de estos estudios de fragmentación, se seleccionaron los iones
con fines de cuantificación y confirmación y se estimaron los límites de
detección instrumentales (ILOD) para los tres UHPLC.miAPImiEM/

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Fig. 3.Espectros de masas de iones producto y curvas de energía de colisión para Sudan Red 7B en condiciones de APCI de iones positivos.

Figura 4.EMnorteespectros de masas de los iones de productos más importantes para Sudan Red 7B en condiciones de iones positivos APCI.

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A. Arrizabalaga-Larrán~aga, S. Epigmenio-Chamú, FJ Santos et al. Analytica Quimica Acta 1164 (2021) 338519

Figura 5.Efecto de matriz (%) utilizando diferentes A) disolvente de extracción (fuente: APCI) y B) fuente de ionización a presión atmosférica (disolvente de extracción: acetonitrilo).

Sistemas MS que funcionan en modo MRM (Tabla S3) mediante la inyección de
soluciones estándar a niveles bajos de concentración. Por lo tanto, en la mayoría
de los casos los ILOD (basados en un S/N de 3) usando HmiIES (0,9mi30metrog L
-1) fueron sólo dos veces superiores a las obtenidas por APCI (0,1mi6metrog L-1) y
APPI (0,6mi15metrog L-1). Además, las precisiones instrumentales intradiarias
estimadas en bajas (15metrog L-1) y medio (50metrog L-1) concentración
proporcionó valores RSD% inferiores al 10% en todos los casos (n¼3).
3.4. Rendimiento del método y análisis de muestras
En este estudio se aplicó un método de extracción rápido y rentable para
extraer tintes específicos de muestras de especias como la cúrcuma, el curry y el
chile. Las muestras de polvo de especias en blanco (5 g) se enriquecieron con 20
mg de los compuestos objetivo y se agitaron durante 12 h para obtener una
muestra enriquecida homogénea. Posteriormente, los colorantes prohibidos se
extrajeron utilizando 5 mL del solvente extractante. Para este fin, acetonitrilo y
acetona, acetonitrilo:acetona (1:1,v/v)y acetonitrilo con ácido acético al 0,1%. Los
extractos (muestras enriquecidas y en blanco), después de la centrifugación y
filtración, se inyectaron (10metroL) en el sistema UHPLC‒API‒MS/MS usando las
tres fuentes API. Se utilizó el método de calibración estándar externo para evaluar
la eficiencia de extracción (EE, %) de los solventes probados y el efecto matriz (ME,
%) producido en cada fuente de API por los extractos correspondientes. Los
resultados mostraron que, en todos los casos, el % de EE fue superior al 95 % para
todos los compuestos, lo que indica que todos los solventes de extracción fueron
lo suficientemente efectivos para extraer estos compuestos específicos de las
muestras de especias. En cuanto a ME%, se enriquecieron extractos en blanco (100
metrog L-1) con los colorantes prohibidos y las concentraciones cuantificadas
utilizando las tres fuentes API se compararon con ese
obtenido del análisis de una solución de mezcla estándar preparada al
mismo nivel de concentración en acetonitrilo. Como ejemplo, Figura 5A
muestra la UHPLCmiAPCImiResultados de MS/MS obtenidos al extraer los
colorantes prohibidos de una muestra de cúrcuma enriquecida utilizando los
solventes probados. Como se puede observar, la acetona y sus mezclas con
otros solventes mostraron los efectos de matriz más altos para todos los
compuestos, probablemente debido a la posible coextracción de
compuestos más hidrofóbicos por parte de estos solventes. Además, la
adición de ácido acético al 0,1% al acetonitrilo coextraía más sustancias de
interferencia que el propio acetonitrilo puro. Por lo tanto, se seleccionó
acetonitrilo al 100% como el solvente más eficiente para la extracción
simultánea de los ocho colorantes estudiados. Además,Figura 5B muestra la
comparación del ME% observado usando acetonitrilo puro como solvente de
extracción en HmiESI, APCI y APPI asistida por clorobenceno. Como se
puede observar, HmiESI mostró los valores más altos de ME% produciendo
una supresión de iones del 60%. Por el contrario, el APPI asistido por
clorobenceno mostró supresión de iones o aumento de iones según el
compuesto objetivo con valores por debajo del 28 %. Además, estos estudios
también se llevaron a cabo con muestras de curry y chile, y generalmente se
observó un efecto de matriz más bajo (<25 %) cuando se usó APCI (Tabla S3).
Por lo tanto, se propone acetonitrilo puro como solvente de extracción y
APCI como fuente de ionización (más fácil de operar que APPI) para la
determinación de rutina de estos colorantes prohibidos a bajos niveles de
concentración en muestras de especias.
Además, dado que el efecto matriz puede verse afectado
significativamente por la concentración del analito en la muestra, lo que
también podría afectar la reproducibilidad y precisión del método, el efecto
matriz también se evaluó en todo el rango de concentración de trabajo. Los
efectos de matriz se evaluaron utilizando ambas curvas de calibración
obtenidas del análisis de estándares preparados en la fase móvil.

Tabla 3
Parámetros de calidad del método UHPLC‒APCI‒MS/MS estimados en chile.

Compuesto mlOD (metrog kg-1) mLOQ (metrog kg-1) Precisión intradía (RSD, %) Precisión interdía (RSD, %) Veracidad (RE, %)

Nivel bajoun Nivel mediob Nivel bajoun Nivel mediob Nivel bajoun Nivel mediob

Sudán I 24 80 2 1 15 3 7 2
Sudán II 6 20 7 6 14 5 12 7
Sudán III 1 2 3 2 9 5 4 2
Sudán IV 3 10 11 6 14 8 9 8
Sudán Naranja G 7 22 2 2 5 5 8 5
Sudán Rojo 7B 2 5 6 2 6 4 6 5
Rodamina B 1 3 3 1 8 6 12 7
Para rojo 1 4 3 2 7 6 5 1

unBaja concentración nivel (30metrog kg-1excepto Sudán I; 100metrog kg-1).

bconcentración media nivel (100metrog kg-1excepto Sudán I; 200metrog kg-1).

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A. Arrizabalaga-Larrán~aga, S. Epigmenio-Chamú, FJ Santos et al.
Figura 6.Cromatogramas de iones extraídos mediante UHPLC‒APCI‒MS/MS de una muestra de chile blanco enriquecida a 100metrog L-1para todos los compuestos.
y método de combinación de matrices basado en muestras en blanco enriquecidas
(polvos de cúrcuma, curry y chile) a diferentes niveles de concentración. De este
modo, se compararon las diferencias (en porcentaje) entre las pendientes de las
curvas de calibración emparejadas con matriz y las curvas de calibración basadas
en disolvente. HmiLos estudios ESI presentaron una supresión de iones
significativa mostrando valores de -13% a -83%. Además, para los mismos
compuestos, el valor de ME% tuvo una variación significativa en las diferentes
muestras de especias. Por ejemplo, Sudán I mostró un valor de ME% promedio de
61% (promedio entre las diferentes matrices) con un RSD% de 40%. En contraste,
APCI presentó las menores diferencias entre las vertientes siendo las muestras de
chile las que presentaron menor
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Analytica Quimica Acta 1164 (2021) 338519
mejora de la matriz (15mi30%), mientras que las muestras de cúrcuma y curry
dieron como resultado hasta un 55% (Figura S5). Sin embargo, los valores
promedio de ME% fueron más similares que los de H-ESI para el mismo
compuesto, siendo para Sudán I el valor promedio de ME% de 37% con un RSD%
de 18%. Aunque el APCI se vio menos afectado por el efecto matriz, se seleccionó
la calibración ajustada a la matriz para la cuantificación precisa de estos
colorantes prohibidos en los productos deseados.
La aplicabilidad del método UHPLC‒APCI‒MS/MS propuesto se evaluó
mediante la determinación de los ocho colorantes prohibidos en muestras
de especias en un total de 36 muestras (productos de cúrcuma, curry y chile)
que se analizaron por triplicado. Ninguna de las muestras analizadas
A. Arrizabalaga-Larrán~aga, S. Epigmenio-Chamú, FJ Santos et al.
mostró concentraciones detectables de los compuestos objetivo, por lo que
los parámetros de calidad del método UHPLC‒APCI‒MS/MS desarrollado se
calcularon a partir de muestras de chile enriquecidas (Tabla 3), cúrcuma (
Tabla S4) y curry (Tabla S5) para demostrar la viabilidad del método en
muestras reales. Por lo tanto, la linealidad de la respuesta analítica de los
compuestos objetivo dentro de un rango de trabajo de dos órdenes de
magnitud fue satisfactoria al obtener coeficientes de correlación (r)superior
a 0,998 para todos los compuestos. Además, se estimaron los límites de
detección del método (MLODs) bajo las tres fuentes API. Con respecto a Hmi
ESI, estos valores oscilaron entre 4 y 300metrog kg-1debido a la alta
supresión de iones observada, mientras que APPI dio como resultado
valores de MLOD de 6 a 50metrog kg-1. Sin embargo, los valores de MLOD
estimados para APCI oscilaron entre 1 y 20metrog kg-1para la mayoría de
los analitos en las muestras de chile y curry excepto para Sudán I, que
fueron 24 y 30metrog kg-1, respectivamente. Sin embargo, los MLOD fueron
más altos en las muestras de cúrcuma en todos los casos (hasta 48metrog
kg-1). Estos resultados confirman la buena detectabilidad del método
UHPLC‒APCI‒MS/MS desarrollado. Además, tanto la precisión intradiaria
como la interdiaria se determinaron utilizando la muestra en blanco
correspondiente enriquecida a dos niveles de concentración (descritos en la
sección2.4). De esta forma, se logró una buena precisión intradiaria con
valores de desviación estándar relativa (RSD, %) que oscilan entre el 1% y el
12% (n¼3), mientras que los valores de precisión interdiarios fueron de
hasta un 15%. Además, también se estudió la veracidad, expresada como el
error relativo (RE, %), a los dos mismos niveles de concentración. Los
resultados siempre fueron inferiores al 15% y al 12% (n¼3) en niveles de
concentración bajos y medios, respectivamente, en todos los casos.Figura 6
muestra como ejemplo el cromatograma extraído UHPLC‒APCI‒MS/MS
obtenido al añadir una muestra de chile en blanco a 100metrog kg-1y como
se puede ver, los compuestos objetivo se pueden detectar fácilmente a este
nivel de concentración Sobre la base de estos hallazgos, se ha demostrado la
viabilidad del método UHPLC‒APCI‒MS/MS, y se puede proponer para la
determinación confiable de los ocho colorantes azoicos/no azoicos
prohibidos en muestras de chile, cúrcuma y curry para el control de los
requisitos establecidos en la legislación de la UE.
4. Conclusiones
La UHPLCmiEl método MS/MS desarrollado utilizando la fuente APCI ha
demostrado ser un método fiable y preciso para la determinación
simultánea de siete colorantes Sudan y rodamina B en muestras de
especias. El uso de una columna de fase inversa UHPLC y una fase móvil
compuesta por (A) tampón acuoso de formiato de amonio/ácido fórmico (pH
3,75, 20 mM) y (B) acetonitrilo y operando en modo de elución en gradiente
proporcionó una separación y resolución cromatográficas eficientes. de
todos los compuestos objetivo en un tiempo de análisis corto (<8 min).
Además, los resultados observados sobre el comportamiento de ionización
mostraron que estos compuestos generan los mismos iones en las tres
fuentes de API. En general, la mayoría de los compuestos mostraron la
molécula protonada [MþH]þcomo el pico base en modo de iones positivos,
excepto para la rodamina B catiónica, donde [M]þpredominó el espectro de
masas y Para Red que siempre mostró la mejor eficiencia de ionización
cuando trabajaba en modo de iones negativos produciendo el [MH]‒como
pico base. Además, el estudio MS de múltiples etapas en el analizador de
masas con trampa de iones permitió establecer la relación genealógica de
los iones producto y la identificación de los iones producto más relevantes
para fines de cuantificación y confirmación en la determinación de
colorantes prohibidos por UHPLC-MS/ EM (modo MRM). Además, los iones
de productos comunes identificados, así como los de pérdidas comunes,
podrían usarse como iones de diagnóstico para una detección rápida de
compuestos relacionados objetivo y desconocidos en muestras de alimentos
complejos. Se propone un método de extracción rápido y rentable basado
en una extracción simple con acetonitrilo para extraer simultáneamente los
colorantes específicos de muestras de especias como la cúrcuma, el curry y
el chile desde la extracción más alta.
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Analytica Quimica Acta 1164 (2021) 338519
además de los valores más bajos del efecto matriz se obtuvieron eficiencias.
UHPLCmiMS/MS, APCI proporcionó la mejor sensibilidad y los efectos de
matriz más bajos para todos los compuestos objetivo en las muestras
seleccionadas. La UHPLC desarrolladamiAPCImiEl método MS/MS
proporcionó límites de detección bajos (1mi48metrog kg-1), buena
repetibilidad (% RSD < 15) y alta precisión (% RE < 15). El buen rendimiento
de la UHPLC desarrolladamiAPCImiEl método MS/MS y los resultados
relevantes obtenidos en el análisis de muestras de chile, cúrcuma y curry
han demostrado su aplicabilidad. Se puede proponer para la determinación
de los ocho colorantes prohibidos en las especias.
Fondos
Este trabajo ha sido apoyado por el Ministerio de Ciencia,
Innovación y Universidades de España, a través de la subvención
PGC2018-095013-B-I00, y la Agencia de Gestión de Ayudas
Universitarias y de Investigación (Generalitat de Catalunya), a través de
la subvención 2017SGRmi310.
Declaración de contribución de autoría CRediT
A. Arrizabalaga-Larrán ~aga:Conceptualización, Metodología,
Investigación, Validación, Análisis formal, Redacciónmiborrador original.
S. Epigmenio-Chamú:Investigación, Validación, Análisis formal.
FJ Santos:Metodología, Supervisión, Redacciónmirevisión y edición.
E. Moyano:Adquisición de fondos, Administración de proyectos,
Metodología, Supervisión, Redacciónmirevisión y edición.
Declaración de competencia de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en
competencia ni relaciones personales conocidas que pudieran haber
influido en el trabajo informado en este documento.
Agradecimientos
Ane Arrizabalaga-Larran ~aga gracias a la Agencia de Gestión
de Ayudas Universitarias y de Investigación (Generalitat de Catalunya) y el
Fondo Social Europeo para la FImiDoctorado DGR compañerismo. Salma
Epigmenio-Chamú agradece a la Universidad Nacional Autónoma de México
por la beca para la estancia en el extranjero.
Apéndice A. Datos complementarios
Los datos complementarios a este artículo se pueden encontrar en línea
en https://doi.org/10.1016/j.aca.2021.338519.
Referencias
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del Parlamento Europeo y del Consejo de 16 de diciembre de 2998 sobre aditivos
alimentarios, Off. J.Eur. Unión (2008) 16mi33.
[2]DECISIÓN DE LA COMISIÓN de 23 de mayo de 2005 sobre medidas de emergencia relativas al chile, los
productos del chile, la cúrcuma y el aceite de palma, Off. J.Eur. Unión (2005) 34mi36.
[3] P. Mpountoukas, A. Pantazaki, E. Kostareli, P. Christodoulou, D. Kareli,
S. Poliliou, C. Mourelatos, V. Lambropoulou, T. Lialiaris, Evaluación citogenética y
estudios de interacción del ADN de los colorantes alimentarios amaranto, eritrosina
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