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Abstracto:
Presentamos un novedoso biosensor colorimétrico basado en
nanopartículas Au@Ag no agregables para detectar metanfetamina y
cocaína. El biosensor consta de una sonda informadora (RP) que es una
secuencia específica de ADN monocatenario (ssADN) recubierta de
nanopartículas de Au@Ag, una sonda de captura (CP) conjugada con
perlas magnéticas y un aptámero de ADN de unión a drogas ilícitas
(Apt). Las nanopartículas de Au@Ag se sintetizaron mediante
crecimiento en semilla y se caracterizaron por microscopía electrónica de
barrido (SEM), microscopía electrónica de transmisión de alta resolución
(HR-TEM) y espectros UV-vis. Se utilizó metanfetamina (METH) como
ejemplo para evaluar la viabilidad del biosensor y optimizar las
condiciones de detección. Demostramos que esta plataforma de detección
era capaz de detectar hasta 0,1 nM (14,9 ng L-1) de METH con una
interferencia insignificante de otras drogas ilícitas comunes. Se
introdujeron varias concentraciones de METH en orina y el biosensor
produjo recuperaciones superiores al 83,1%. Además, el biosensor
también mostró una alta sensibilidad para detectar cocaína. Estos
resultados demostraron que nuestro sensor colorimétrico es prometedor
para ser implementado como una plataforma de detección visual para
detectar múltiples drogas ilícitas en muestras biológicas y matrices
ambientales.
1. Introduccion.
El consumo de drogas ilícitas está muy extendido y se ha convertido en una creciente
preocupación mundial [1-5]. La Oficina de las Naciones Unidas contra la Droga y el Delito
ha informado recientemente de que un total de 246 millones de personas, alrededor del
5% de la población mundial con edades comprendidas entre los 15 y los 64 años, han
consumido drogas ilícitas [2]. Entre estas drogas ilícitas, la cocaína (COC) es la principal
droga de interés en América Latina/Caribe y la segunda sustancia ilegal más consumida
tanto en Europa como en Estados Unidos [2,3]. La metanfetamina (METH) es la segunda
droga más consumida en el mundo [6]. El consumo de METH ha aumentado
drásticamente en los últimos años, sobre todo en determinadas regiones. Por ejemplo, la
incautación de MET cristalino ha aumentado de unas 7 t en 2010 a 14 t en 2013 en Asia
oriental y sudoriental [2]. El abuso de drogas ilícitas puede tener graves consecuencias
sociales, como la pérdida de vidas y de la salud de los consumidores, el aumento de los
costes de tratamiento y una mayor incidencia de delitos [1-5].
Las técnicas analíticas comerciales incluyen la cromatografía de gases y la cromatografía
líquida de alta resolución-espectrometría de masas [4,5]. Aunque son muy sensibles y
selectivas, estas técnicas suelen requerir instrumentos caros y un tedioso pretratamiento
de las muestras en el laboratorio, como la extracción en fase sólida (SPE) o la
microextracción en fase sólida (SPME). Por lo tanto, existe una gran necesidad de
desarrollar herramientas rápidas, baratas y sensibles para detectar drogas ilícitas con el fin
de monitorizar y controlar el abuso de drogas ilícitas, preferiblemente en el mismo lugar
de recogida de la muestra.
En comparación con los métodos convencionales, los biosensores son prometedores para
superar los inconvenientes de los métodos analíticos convencionales. Un biosensor es un
pequeño dispositivo con un receptor biológico que genera una señal (electroquímica,
óptica, nanomecánica, sensible a la masa, etc.) en presencia de un analito. Los biosensores
tienen un gran potencial para la detección rápida e in situ de analitos en fluidos corporales
y muestras ambientales, debido a su facilidad para la miniaturización y la capacidad de
medir matrices complejas con una preparación mínima de la muestra [7-9]. En las últimas
décadas, se han desarrollado biosensores para medir numerosos analitos en diversas
matrices, como metales pesados [10,11], moléculas pequeñas [12,13], ADN dirigido [7],
péptidos [14], enzimas [15], proteínas [14,16], antígenos [17], biomarcadores [7,8] e
incluso bacterias [18,19].
Los aptámeros son una secuencia de oligonucleótidos con alta afinidad y especificidad de
unión a una diana mediante la tecnología de evolución sistemática de ligandos por
enriquecimiento exponencial (SELEX). [20,21]. Recientemente, se han dedicado esfuerzos
al diseño de biosensores basados en aptámeros de ADN para la detección de drogas
ilícitas, especialmente COC. La mayoría de los investigadores utilizan aptámeros de ADN
específicos para unirse al COC, lo que genera una señal (electroquímica [22], colorimetría
[23], fluorescencia [24], SERS [25], etc.) en presencia del COC debido a los cambios de
conformación de los aptámeros de ADN. Mokhtarzadeh et al. [3] revisaron los recientes
avances y aplicaciones de biosensores y nanobiosensores basados en aptámeros de COC,
que se centraron principalmente en técnicas de fluorescencia, colorimétricas y
electroquímicas para la detección de COC. Además del AOC, se ha informado de otras
pocas drogas ilícitas utilizando tecnología de detección. Mohsen et al. [26,27]
desarrollaron por primera vez un sensor espectroscópico de impedancia electroquímica
para la metanfetamina utilizando un aptámero específico mediante SELEX. Shi et al. [6]
desarrollaron una determinación colorimétrica y a ojo desnudo de metilanfetamina
urinaria basada en aptámeros y en la agregación inducida por sal de nanopartículas de oro
no modificadas. Yarbakht et al. [28] describieron las nanopartículas de oro no modificadas
como sonda colorimétrica para la detección visual de metanfetamina.
Los metales nano notables, especialmente las nanopartículas de oro, se han utilizado cada
vez más para aplicaciones de biosensado debido a su fácil preparación y a sus excelentes
propiedades ópticas [29-31]. Estas propiedades se utilizan para desarrollar muchos
métodos analíticos, como la colorimetría [32,33], la dispersión de la luz [34,35], la
escanometría [36,37], la dispersión Raman mejorada en superficie [38] y la
quimioluminiscencia [39,40]. En particular, la colorimetría presenta ventajas particulares
como la sencillez, el bajo coste y la amenidad [32,41]. El bio-sensor colorimétrico basado
en nanopartículas de oro (AuNPs) para detectar oligonucleótidos fue descrito por primera
vez por el grupo de Mirkin [29]. En su sistema, las AuNPs modificadas con oligonucleótidos
dispersos se ensamblaron en redes poliméricas agregadas mediante hibridación con
secuencias diana complementarias. Se observó un cambio obvio en el pico de absorción
de la resonancia de plasmón superficial (SPR) entre las AuNPs dispersas y las agregadas,
dando lugar a un cambio significativo de color rojo a azul que podía visualizarse fácilmente
a simple vista [29,41]. Sin embargo, la eficacia de este método para detectar
concentraciones más bajas de dianas se vio limitada por la sedimentación inducida por la
agregación [41]. Para lograr un ensayo altamente sensible, se han sintetizado nuevas
estructuras de AuNPs [42-44], por ejemplo, nano-partículas plasmónicas (PNPs) con
núcleo de Au-Ag como sondas moleculares para la detección de sulfuro. Este ensayo
colorimétrico permite una dependencia logarítmica lineal de las concentraciones de
sulfuro de 50 nM a 100 μM [42]. Yan et al. [43] diseñaron una nanoestructura de núcleo
de Au y cubierta de Ag con un aptámero de ADN marcado con Cy5 para detectar
cloranfenicol mediante dispersión Raman mejorada en superficie (SERS). Este sensor
basado en SERS es capaz de detectar hasta 0,19 pg mL-1 de cloranfenicol. Sin embargo, las
nanopartículas plasmónicas (PNPs) con núcleo de Au-Ag no se han utilizado para la
detección de drogas ilícitas.
En este trabajo, desarrollamos una estrategia colorimétrica no agregada basada en
Au@Ag para la detección de drogas ilícitas utilizando una sonda reportera, una sonda de
captura y un aptámero. Las nanopartículas Au@Ag se sintetizaron por crecimiento de
semillas para mejorar la señal SPR. El biosensor se optimizó variando las concentraciones
de las perlas magnéticas y el aptámero, así como el tiempo de reacción de hibridación. La
selectividad del sensor se examinó utilizando 8 drogas ilícitas comunes distintas del METH.
El sensor optimizado se utilizó para detectar METH en muestras de orina de drogadictos
para evaluar la recuperación. También se demostró que esta plataforma es capaz de
detectar otras drogas ilícitas como la cocaína, lo que indica que podría utilizarse como
enfoque genérico para la monitorización de drogas ilícitas.
2. 2. Materiales y métodos
2.1. Materiales
HAuCl4-3H2O y AgNO3 se adquirieron en Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai,
China). Ltd. (Shanghai, China). Las perlas magnéticas recubiertas de carboxilo (1,05 μm
DynabeadsTM MyOneTM, 10 mg/mL) se adquirieron a Invitrogen en Noruega. El citrato
trisódico se obtuvo de Sigma- Aldrich (EE.UU.). Las secuencias de oligonucleótidos
mostradas en la Tabla S1 se obtuvieron de Sangon Biotech (EE.UU.).
obtenidas de Sangon Biotech (Shanghai, China) Co. Ltd. y purificadas por HPLC. Todas las
drogas ilícitas y metabolitos se adquirieron de Cerilliant (Round Rock, TX, EE.UU.). Las
orinas de los consumidores de METH se recogieron en la provincia de Guangdong con la
ayuda de un centro de rehabilitación local. La recogida de muestras de orina y los
experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo aprobado por el comité de
ética de la Universidad de Pekín y con el consentimiento informado de los adictos. Se
adquirieron filtros de membrana de 0,22 μm a ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai,
China) Inc. En todos los experimentos se utilizó agua ultrapura (18,2 MΩ) de un sistema de
filtración Millipore. Se utilizaron los siguientes tampones Solución PB (solución tampón de
fosfato sódico 10 mM, pH 7,4), tampón PBS-T (solución tampón de fosfato sódico 10 mM,
pH 7,4, 0,1 M NaCl, 0,05% tween-20), tampón MES (ácido 2-[N-morfolino]etano sulfónico,
0,1 M, pH 4,8) y tampón Tris (2-amino-2-hidroximetil-1,3- propanodiol, 50 mM, pH 7,4).
2.2. Síntesis de las nanopartículas Au@Ag core-shell
Las nanopartículas de oro se prepararon por reducción de hidrato de cloruro de oro (III)
utilizando citrato trisódico, siguiendo el procedimiento descrito en una publicación
anterior [45] con pequeñas modificaciones. Brevemente, 50 mL de HAuCl4 al 0,01% (p/p)
se redujeron con 750 μL de solución de citrato trisódico al 1% (p/p) a 100 °C bajo agitación
magnética vigorosa durante 15-20 min hasta que la solución adquirió un color rojo claro.
Las partículas de AuNPs rojas preparadas se utilizaron como partículas semilla. A
continuación, se añadieron 600 μL de solución de AgNO3 (0,5%, p/p) a 100 mL de solución
de semilla de oro en ebullición. Después, se añadió gota a gota 1 mL de solución de citrato
de sodio (1%, p/p) como agente reductor con agitación. La solución se hirvió durante 1 h y
luego se enfrió a temperatura ambiente. El Au@Ag se caracterizó mediante microscopio
electrónico de barrido (SEM) (SIGMA, Alemania), microscopio electrónico de transmisión
(TEM) (JEM-2100) y espectrómetro UV-vis (Perk Elmer, EE.UU.), lo que confirma el éxito
de la síntesis de las nanopartículas Au@Ag core-shell con un diámetro medio de 40 nm.
2.3. Preparación de la sonda reportera y de captura
La sonda reportera se obtuvo modificando las nanopartículas Au@ Ag sintetizadas con una
secuencia de ADN RP parcialmente complementaria al aptámero. Las nanopartículas
Au@Ag suspendidas en 5 mL de tampón PB (pH 7.4, 10 mM de fosfato) se cargaron con 15
nmol de sondas reporteras funcionalizadas con tiol [46]. Después de 24 h, se añadió NaCl
2 M a la solución para generar una concentración total de NaCl de 0,05 M, y luego se
aumentó a 0,1 M después de 8 h. Después de envejecer en sal 0,1 M durante 40 h
adicionales, las nanopartículas se aislaron por centrifugación a 6500 rpm durante 15 min y
se lavaron tres veces con PBS-T (pH 7,4, fosfato 10 mM, Tween-20 al 0,05%).
El reportero de captura fueron perlas magnéticas superparamagnéticas (MBs) con un
recubrimiento modificado con carboxilo, que se conjugaron con la sonda de captura de
ADN utilizando el protocolo sugerido por el fabricante. Antes de la inmovilización, se
lavaron 2,5 mL de perlas magnéticas carboxiladas dos veces con 2,5 mL de tampón MES
(100 mM, pH 4,8) y se resuspendieron en 250 μL de tampón MES (100 mM, pH 4,8). A
continuación, se añadió una mezcla de 36,2 nmol de ADN de captura modificado con NH2
y 36,2μmol de EDC-HCl en 100 μL de tampón MES a las perlas magnéticas lavadas y se
incubaron durante la noche agitándolas suavemente a temperatura ambiente. Por último,
las microesferas magnéticas recubiertas se incubaron con tampón Tris 50 mM (pH 7,4)
durante 15 minutos a temperatura ambiente, con agitación suave, para desactivar los
grupos de ácido carboxílico activados restantes. Las microesferas magnéticas recubiertas
se lavaron tres veces con 2,5 ml de tampón Tris y, a continuación, se volvieron a
suspender en tampón de hibridación (PBS-T) y se almacenaron a 4 °C para su uso.
2.4. Elaboración de biosensores
En este estudio, intentamos desarrollar una estrategia para la detección de drogas ilícitas
basada en el Au@Ag no agregado. Para explorar la eficacia de la estrategia, se empleó
como caso de estudio una nanosonda de Au@Ag no agregada basada en METH. Se mezcló
METH (1 μM, 10 μL) con 10 μL de soluciones de aptámeros METH (200 nM), tras lo cual se
introdujeron 20 μL de tampón PBS-T. Después de incubar durante media hora, se
añadieron a la solución 5 μL de CP (tampón PBS-T) y 50 μL de RP (tampón PBS-T) y se dejó
hibridar bajo agitación en vórtex suave durante 90 min. El volumen total se aumentó a
100 μL en tampón PBS-T. Después de la hibridación, los MBs con nanopartículas core-shell
de Au@Ag enlazadas a la diana junto con los MBs sin reaccionar se atrajeron fácilmente al
fondo del tubo aplicando un imán redondo (diámetro: 3 cm, grosor: 3 mm). Tras la
separación, se midió la SPR del sobrenadante mediante un Shimadzu UV-2550 con
microcubeta de cuarzo de 80 μL.
Se realizaron experimentos de control con las siguientes combinaciones MBs + Au@Ag;
MBs + Au@Ag + METH; MBs + Au@Ag + aptámero. En estos experimentos, cada
componente se añadió en los mismos volúmenes y concentraciones que en presencia de
METH. Los componentes que faltaban se sustituyeron por el tampón PBS-T para mantener
un volumen total constante (100 μL).
2.5. Optimización de los biosensores
La concentración de perlas magnéticas provoca el cambio de la relación entre las sondas
de captura y la sonda reportera, lo que tiene un impacto significativo en la sensibilidad del
ensayo. Para obtener la concentración óptima de perlas magnéticas, en este experimento
se probaron una serie de concentraciones de MBs. El proceso experimental fue el mismo
que el procedimiento experimental de control (MBs + Au@Ag + aptámero) mencionado
anteriormente. El volumen de MBs (10 mg/mL) fue de 0, 0,1 μL, 0,5 μL, 1 y 5 μL.
El tiempo de reacción de la hibridación es un parámetro importante para el biosensor
colorimétrico. Examinamos el tiempo de reacción de la hibridación registrando las
intensidades pico de la señal SPR. El proceso experimental también fue el mismo que el
procedimiento experimental de control descrito anteriormente. Las señales SPR se
registraron cada 15 minutos, de 0 a 105 minutos.
La concentración óptima del aptámero METH se determinó midiendo las intensidades de
absorbancia a 400 nm. El biosensor se optimizó utilizando diferentes concentraciones de
aptámero (0, 10nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM y 60 nM), siguiendo el procedimiento
de los experimentos de control mencionado anteriormente.
2.6. Evaluación del rendimiento analítico
En las condiciones optimizadas, se evaluaron la sensibilidad y la linealidad del biosensor
para METH desde 0,50 nM hasta 200 nM.
La selectividad del biosensor se evaluó con otras 8 drogas ilícitas comunes y sus
metabolitos, a saber, ketamina (KET), norketamina (NK), morfina (MOR), cocaína (COC),
catinona (CAT), metcatinona (MCAT), 3-trifluorometilfenilpiperazina (BZP) y 4,4′- dos
amino dos fenil metano (MDA). El procedimiento del experimento fue el mismo que el
anterior, salvo que el METH se sustituyó por otras drogas ilícitas o metabolitos. Para las
otras drogas y metabolitos se utilizó una concentración mucho mayor (1 μM), mientras
que como control se utilizó una concentración de METH de 50 nM.
2.7. Análisis de muestras de orina con biosensores
Para comprobar la viabilidad de la detección de METH en muestras biológicas, se
determinaron las concentraciones de METH en orinas utilizando el biosensor. Se midió
una alícuota de 20 μL de cada muestra de orina utilizando nuestros sensores después de
filtrarla con filtros de membrana de 0,22 μm. Las concentraciones medidas se compararon
con las determinadas mediante cromatografía líquida de alta resolución-espectrómetro de
masas en tándem (HPLC-MS/MS) utilizando un sistema UFLCXR-LC (Shimadzu, Japón) con
una columna Phenomenex Gemini C18 (100 mm 2 mm, 3 μm) y un espectrómetro de
masas ABI 4000 de triple cuadrupolo (AB SCIEX, EE.UU.). Para el análisis HPLC-MS/MS, las
muestras de orina se diluyeron primero en MeOH por un factor de 6, se agitaron en vórtex
durante 20 s y se centrifugaron durante 1 min a 13.000 rpm. Alícuotas de los
sobrenadantes, añadidas con patrones internos deuterados, se analizaron siguiendo las
condiciones descritas en otro lugar [4,5]. Para examinar la recuperación de METH, una de
las muestras de orina se enriqueció con tres concentraciones (10, 50 y 100 nM). A
continuación se determinaron las concentraciones de METH en las muestras enriquecidas
utilizando el biosensor.
4. Conclusión
Se construyó un biosensor novedoso, rentable y sin etiqueta basado en la no agregación
Au@Ag para la detección de drogas ilícitas. El biosensor consistía en una sonda
informadora que es una secuencia específica de ADN monocatenario recubierta con
Au@Ag, una sonda de captura conjugada con perlas magnéticas superparamagnéticas, y
un aptámero de ADN de unión a drogas ilícitas. El aptámero de ADN podría hibridarse
tanto con RP como con CP, generando una estructura de sándwich de Au@Ag-ADN y
perlas magnéticas (MBs). Cuando se aplica un campo magnético externo, las Au@Ag-DNA-
MB se retiran de la solución, lo que provoca una disminución de la intensidad de la SPR. En
presencia de drogas ilícitas, la estructura sándwich Au@Ag-DNA-MB no puede formarse
debido a la mayor afinidad del aptámero con la droga ilícita que con el ssADN
complementario. La intensidad SPR se correlaciona con las concentraciones de las drogas
ilícitas diana y se utiliza para cuantificarlas. Hemos demostrado la novedosa plataforma de
detección de drogas ilícitas como METH y COC.
El biosensor optimizado es capaz de detectar hasta 0,1 nM de METH
con un rango lineal de 0,5 nM a 200 nM, y otras drogas ilícitas no específicas muestran
una interferencia insignificante. Las recuperaciones de METH en las muestras de orina
enriquecidas fueron superiores al 83,1%. También utilizamos HPLC-MS/MS para analizar
muestras de orina para la validación, y los resultados concuerdan. Además, la plataforma
de detección desarrollada se utilizó para la detección de cocaína con el aptámero de unión
a cocaína, lo que muestra un resultado prometedor y la universalidad de nuestros
biosensores. En resumen, hemos demostrado un biosensor genérico basado en una
estructura no agregada de Au@Ag para la detección sensible de METH y COC, y también
tiene potencial para monitorizar un amplio espectro de dianas, incluidas drogas ilícitas,
sustituyendo el aptámero de ADN respectivo.