Práctica 5.

Bombeo de protones en levaduras

Introducción
Las levaduras presentan mitocondrias donde se lleva a cabo la síntesis de ATP, así como retículo
endoplásmico y aparato de Golgi que se encargan de la síntesis de proteínas que terminan en la membrana
plasmática o el exterior. Estos organismos utilizan fuentes de carbono como los carbohidratos para obtener
energía, entre los carbohidratos que utilizan se encuentra la glucosa y la fructuosa.
En el caso de Saccharomyces cerevisiae, para que pueda utilizar como fuente de energía glucosa o fructuosa
se requieren transportadores específicos para estas moléculas, para esto hay proteínas que transportan los
carbohidratos por difusión facilitada (transporte pasivo a favor del gradiente), independientemente del ATP.
Hay 20 tipos de transportadores de glucosa en la membrana plasmática, los cuales son complejos proteicos
llamados transportadores de hexosas o Hxt, entre los más importantes se encuentran Hxt1 y Hxt3, que
presentan baja afinidad por la glucosa y una alta capacidad de transporte, mientras que Hxt2, Hxt4 y Hxt7
presentan una alta afinidad por la glucosa y una baja capacidad de transporte.
Las levaduras presentan una ATPasa de H+ a nivel membranal, la cual es crucial para su crecimiento y
metabolismo, pues constituye en mayor medida su sistema de regulación de pH y absorción de nutrientes.
Esta enzima energiza la membrana mediante la expulsión de hidrogeniones, generando un potencial eléctrico
de membrana y un gradiente de pH, siendo más positivo y ácido en el exterior; todo esto produce un flujo de
entrada de nutrientes y salida de aniones, para neutralizar la carga negativa del citosol ingresan iones K+
gracias a las proteínas transportadoras que se encuentran en la membrana. Una ATPasa de H+ acopla la
translocación de un protón a través de la membrana por cada molécula de ATP hidrolizada, consumiendo al
menos el 25% del ATP que se produce en la célula. Se genera un gradiente electroquímico de protones
necesario para la impulsión del transporte de carbohidratos (glucosa) al interior de la célula por medio de Hxt.
Hay factores que regulan la actividad de estas enzimas, como la acidez del medio y la oxidación de la
glucosa, este último modifica las propiedades cinéticas de la ATPasa, mientras que la acidificación del medio
durante el crecimiento de la levadura provoca un descenso del pH citosólico, activando la enzima con el
propósito de bombear protones al exterior, liberando iones de hidrógeno que acidifican el medio.
Otra bomba de protones presenta en la membrana interna de las mitocondrias en Saccharomyces cerevisiae
es la ATP sintetasa, cuya función es sintetizar ATP mediante la fosforilación oxidativa, donde una molécula de
ADP adquiere un fosfato, al mismo tiempo que una serie de transferencia de electrones oxidan distintas
moléculas proteicas o lipídicas. En este caso, el flujo de protones a través de la enzima induce la síntesis de
ATP. Entonces, por un lado, la ATP sintasa sintetiza el ATP en la mitocondria, mientras que, en la membrana
plasmática, la ATPasa de H+ hidroliza este ATP para bombear protones al exterior de la célula, por lo que se
genera un gradiente electroquímico necesario para transportar los nutrientes. El tener una correcta
transferencia de electrones provee sustratos energéticos que son necesarios para un buen funcionamiento de
la célula, pues el metabolismo energético es base para las funciones de esta.
La fosforilación oxidativa consiste en una cadena de transporte de electrones y quimiosmosis, esta se
encuentra en la membrana interna mitocondrial. La primera produce un gradiente de protones, almacenando
energía que se puede utilizar para crear ATP durante la quimiosmosis y, genera portadores de electrones,
como NAD+ y FAD, que se utilizan en la glucólisis y el ciclo del ácido cítrico. Las moléculas de este proceso se
organizan en cuatro complejos I, II, III y IV. Las reacciones que se llevan a cabo liberan una energía que los
complejos utilizan para bombear H+ a través de la membrana interna, lo que forma un gradiente de protones a
través de la membrana interna. El NADH y el FADH 2 son portadores de electrones reducidos, el primero
introduce electrones en el complejo II, el único complejo que no bombea protones en el espacio
intermembranal. El NADH y el FADH 2 se convierten de nuevo en portadores de electrones NAD + y FAD,
respectivamente. Tanto el NADH como el FADH 2 transfieren electrones a la ubiquinona, un portador de
electrones móvil que pasa los electrones al complejo III. A partir de ahí, los electrones se transfieren al
portador de electrones móvil, citocromo c, éste entrega los electrones al complejo IV, que los pasa a O 2. El
oxígeno se rompe, formando dos átomos de oxígeno que cada uno acepta dos protones para formar agua.
Estas reacciones liberan energía que genera un gradiente de protones a través de la membrana interna
mitocondrial, el cual libera energía suficiente para la síntesis de ATP por la ATP-sintasa.
Los inhibidores o venenos, como azida de sodio, disminuyen el potencial de membrana. El azida de sodio
afecta la cadena respiratoria de manera que inhibe a los grupos del complejo IV, por lo que detiene las
reacciones redox de la cadena respiratoria y no se libera energía. Como se mencionó, el ATP es utilizado
para el transporte de protones en la levadura, la adición de la glucosa ayuda a activar de dos o tres veces
más la actividad de las Atpasas, dado el movimiento de protones que causa, provoca una baja en el pH
de la solución de levadura. Caso contrario en una solución de azida de sodio puesto a que en ella el
cambio del pH no se da tan drásticamente, al disminuir el movimiento de protones y disminuir el potencial
de membrana.
Por otro lado, el uso de desacoplantes como el DNP (dinitrofenol) disipa el gradiente de protones H+
necesario para el transporte de nutrientes y la generación de ATP. El DNP es un trasportador de protones
lipofílico, que puede difundir libremente a través de la membrana mitocondrial interna. Transporta protones a
través de la membrana, disipando el gradiente de protones; el resultado de esto es una disminución del flujo
de protones a través de la ATPsintasa y, así, una disminución de la producción de ATP. El trasporte de
protones se produce con normalidad, pero sin la producción de ATP.

Objetivos
Objetivo general:
 Relacionar el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos por Saccharomyces cerevisiae
bajo condiciones aeróbicas.
Objetivos específicos:
● Analizar las vías por las cuales la glucosa genera los cambios de pH.
● Evaluar el efecto de diferentes inhibidores y un desacoplante con los cambios de pH extracelular y el
consumo de glucosa en Saccharomyces cerevisiae en condiciones aeróbicas.

Hipótesis
 Si las levaduras consumen glucosa, se afectará el cambio de pH producidos por la Saccharomyces
cerevisiae, esto se observará con una disminución progresiva de la concentración de la glucosa en el
medio de cultivo conforme avance el tiempo, así como cambios en el pH extracelular (se acidficará).
 Si se le agrega DNP y azida de sodio al medio, se causará un aumento de protones en el medio
extracelular, y estos compuestos inhibirán o ralentizarán la cadena transportadora de electrones,
alcalinizando las muestras.
 El azida de sodio alcalinizará el medio extracelular más que los otros tratamientos pues detendrá el
potencial de membrana y el gradiente electroquímico de la cadena de transporte de electrones.

Metodología
Para este procedimiento primero se pesó un gramo de levadura seca activa por cada tratamiento y se disolvió
en 5 ml de agua destilada para obtener en tres suspensiones, estos se agregaron a vasos de precipitado de
100 ml previamente etiquetados como “control positivo”, “dinitrofenol” y “azida de sodio”. A los vasos
etiquetados como “azida de sodio” se les agregó 40 ml de agua destilada, se agitaron y enseguida se les
agregó control positivo (5 ml de agua destilada), 0.2 ml de dinitrofenol y 0.5 ml de azida de sodio. Para la
obtención de la línea basal, se homogenizaron las tres suspensiones en agua destilada manteniendo en
agitación durante todo el procedimiento de toma de lectura de pH. Para la primera lectura se agregó agua
destilada, azida de sodio y dinitrofenol a las suspensiones, después de esta se tomaron las lecturas cada 3
minutos durante 12 minutos. Después de obtener la línea basal se agregaron 5 ml de solución de glucosa al
10% a cada uno de los vasos, luego se tomaron las lecturas de pH de cada vaso cada cinco minutos durante
40 minutos de incubación. Para finalizar, se desecharon todos los residuos en el contenedor que se asignó
para ello y se lavó todo el material de la manera adecuada.

Resultados
Tabla 1. Línea basal. Valor de pH obtenido cada tres minutos.
pH: vaso 2 pH vaso 3 AZIDA DE
Tiempo (minutos) pH vaso 1: CONTROL
DINITROFENOL SODIO
0 5.26 5.49 5.79
3 5.21 5.39 5.78
6 5.13 5.34 5.74
9 5.10 5.33 5.74
12 5.09 5.30 5.75

De acuerdo a la tabla anterior se obtuvo la siguiente gráfica:

Línea basal
6

5.8

5.6

5.4
pH

5.2

4.8

4.6
0 2 4 6 8 10 12 14
Timepo (minutos)

pH vaso 1: CONTROL pH: vaso 2 DINITROFENOL pH vaso 3 AZIDA DE SODIO

Gráfica 1. Línea basal. Valor de pH obtenido cada tres minutos.

Tabla 2. Efecto del pH extracelular después de agregar glucosa.

pH: vaso 2 pH vaso 3 AZIDA DE
Tiempo (minutos) pH vaso 1: CONTROL
DINITROFENOL SODIO
0 5.05 4.67 5.59
5 4.27 4.51 5.50
10 4.05 4.42 5.53
15 4.02 4.35 5.41
20 3.91 4.33 5.38
30 3.88 4.25 5.35
40 3.86 4.26 5.35
A partir de los datos obtenidos en la tabla anterior se obtuvo la siguiente gráfica:

pH después de agregar glucosa

6

3
pH

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (minutos)

pH vaso 1: CONTROL pH: vaso 2 DINITROFENOL pH vaso 3 AZIDA DE SODIO

Gráfica 2. Efecto del pH extracelular después de agregar glucosa.

Discusión
Como se puede observar en la Gráfica 1 y la Gráfica 2, los valores de pH de los tres tratamientos
disminuyeron conforme avanzó el tiempo, ya que, por las bombas de protones presentes en las levaduras, las
ATPasas, que bombean protones en la membrana plasmática hacia la parte externa de la célula, provocando
entonces un gradiente electroquímico y disminuyendo el pH, mostrando que se llevó a cabo un transporte de
protones y cumpliendo, esto, cabe aclarar que fueron resultados de pH sin agregar glucosa.
Comparando estas dos gráficas y los datos obtenidos en la Tabla 1 y la Tabla 2, se observa que, al agregar
glucosa, el pH disminuyó en los tres tratamientos, resultados completamente esperados, pues como se
mencionó en la teoría, la adición de la glucosa a las levaduras ayuda a activar más la actividad de las
ATPasas, causando un movimiento de protones que provoca una baja en el pH de la solución de levadura;
donde, debido a la protonación de la glucosa, por las bombas de protones presentes en las levaduras, las
ATPasas, que bombean protones en la membrana plasmática hacia la parte externa de la célula, se provoca
un gradiente electroquímico y disminuye el pH, mostrando que se llevó a cabo un transporte de protones, y
aumentando la actividad de la enzima, por lo que se mostró un pequeño aumento de acidez en el medio.
Estas enzimas emplean la energía de la hidrólisis del ATP para transportar solutos en contra de su potencial
electroquímico, energizan le membrana mediante la expulsión de hidrogeniones, generando este potencial
eléctrico de la membrana y un gradiente de pH, generando que sea más positivo y más ácido al exterior, para
neutralizar ingresan iones K+.
En cuanto al tratamiento con DNP (dinitrofenol), el cual, como se mencionó en la teoría, es un agente
desacoplante, pues desacopla la cadena de transporte de electrones de la fosforilación oxidativa, disipando el
gradiente de protones H+ necesario para el transporte de nutrientes y la generación de ATP. Este
desacoplante hace a los protones de la membrana interna mitocondrial permeables, deshaciendo la relación
entre la cadena y la fosforilación. Disminuye el flujo de protones a través de la ATPsintasa, disminuyendo la
producción de ATP, llevando a cabo del transporte de protones con normalidad, pero sin la producción de
ATP. Al disipar los iones, el desacoplante hace que disminuya el pH extracelular, y aumente la concentración
de hidrogeniones, pues estos escapan indefinidamente del medio. Esto se puede observar comprando la línea
base control con la correspondiente a dinitrofenol (Gráfica 1 y Gráfica 2), pues en ambas gráficas, se puede
notar que el tratamiento control es el más ácido de los tres “normal”, y se alcalinizó al agregar DNP.
En cuanto al azida de sodio, el comportamiento de pH, muestra los resultados más alcalinos de los tres
tratamientos (Tabla 1 y Tabla 2), esto se puede observar también en las gráficas, donde el azida de sodio
muestra una línea casi constante, pues de acuerdo a la teoría, este compuesto es inhibidor, por lo que
disminuye el potencial de membrana, afectando la cadena respiratoria, específicamente a los grupos del
complejo IV, deteniendo las reacciones redox de la cadena y no liberando energía, en este caso el cambio de
pH no se da tan drásticamente, por eso se observa una línea casi constante. El azida de sodio, a diferencia
del DNP que es un desacoplante, sí interrumpe el bombeo de protones H+, aquí no funcionan las bombas de
protones, por lo que no hay protones que regresen a través del complejo V, cesando la producción de ATP.
Por lo que, los resultados cumplen completamente la teoría, pues se esperaba que el tratamiento con azida de
sodio presentara el pH más alcalino al detener completamente las bombas de protones, seguido del
tratamiento del DNP que presenta solo una ralentización del proceso de la cadena de transporte de electrones
y sin producir ATP, mientras que el tratamiento control se esperaba que presentara la mayor concentración de
H+.
Como se explicó en la teoría todos estos cambios son debidos a los venenos que se introdujeron en los
tratamientos, estos afectan a vías metabólicas en las que participan las bombas de protones como ATPasas y
ATP sintasas. Por eso importante recordar las vías por que las que se producen estos cambios.
La fosforilación oxidativa consiste en una cadena de transporte de electrones y quimiosmosis, se lleva a cabo
en la membrana interna mitocondrial. Se produce un gradiente de protones, que almacena energía que se
puede utilizar para crear ATP durante la quimiosmosis, que genera portadores de electrones (NADH y
FADH2). Las moléculas de este proceso se organizan en cuatro complejos I, II, III y IV. Las reacciones que se
llevan a cabo liberan una energía que los complejos utilizan para bombear H + a través de la membrana
interna, lo que forma un gradiente de protones a través de la membrana interna, las reacciones de estos
complejos liberan energía que genera un gradiente de protones a través de la membrana interna mitocondrial,
el cual libera energía suficiente para la síntesis de ATP por la ATP-sintasa. La ATPasa H+ controla la
concentración de los iones H+, cataliza la descomposición de ATP en ADP y un fosfato libre, presenta como
función un sistema de regulación de pH y absorción de nutrientes. También hay una bomba de protones
ATPasa H+ en la membrana plasmática, la cual se puede comparar como la bomba de protones presente en
los mamíferos (Na+/K+), pues presentan una actividad similar, esta última pasa por ciclos de cambio que le
ayudan a mantener protones que son bombeados a la parte extracelular provocando diferencia electroquímica
con el pH (potencial negativo). El proceso de esta bomba consiste en la salida de tres iones de sodio y la
entrada de dos iones de potasio, los cuales viajan en contra de su gradiente de concentración requiriendo
energía en forma de ATP. En eucariontes, la enzima ATP sintasa (bomba) usa el potencial electroquímico
generado por los complejos de la cadena respiratoria.
El tener una correcta transferencia de electrones provee sustratos energéticos que son necesarios para un
buen funcionamiento de la célula, pues el metabolismo energético es base para las funciones de esta. Por
este motivo, las bombas de protones son complementarias y cada una cumple un papel fundamental en la
cadena de transporte de electrones, y, por lo tanto, en la cadena respiratoria y el metabolismo. Al afectar
estas vías y provocar un cambio de condiciones, se provoca un cambio en el gradiente electroquímico, en
consecuencia. Un cambio en el pH extracelular al cambiar la concentración de iones H+. En el primer caso,
agregando glucosa, donde se acidificó de manera pequeña el medio por la actividad de la ATPasa en la
membrana plasmática, la cual por medio de la liberación de H+ por la acción de la formación de ATP, la
ATP sintasa, al obtener los iones H+ de la glucosa para la formación de ATP, genera un gradiente
electroquímico de protones que se utiliza para impulsar el transporte de nutrientes al interior de la
célula.
Todos estos procesos se modificaron o inhibieron gracias a los venenos que se les introdujeron en
cada tratamiento, como se mencionó, se observó que el DNP alcalinizó el medio comparándolo con
el tratamiento control, haciendo más lenta la síntesis de ATP y sin producirlo, afectando
específicamente la cadena de transporte de electrones al disipar el gradiente de H+, y disminuyendo
la producción de ATP. Por otro lado, el azida de sodio actúa como un inhibidor afectando
directamente a los grupos del complejo IV de la fosforilación oxidativa, deteniendo las reacciones
redox al aceptar o liberar electrones en la cadena de transporte de electrones, capturando la energía
que debería llegar a la membrana de la mitocondria, evitando que se forme un gradiente
electroquímico, y haciendo que el pH se torne alcalino, al detener el proceso y no formar por
completo un gradiente electroquímico, alcaliniza más que los otros tratamientos de manera nos
drástica, disminuyendo el movimiento de protones y el potencial de membrana.

Conclusiones
Los objetivos, entonces, fueron logrados con éxito, así como las hipótesis se comprobaron como acertadas.
La fosforilación oxidativa puede ser desacoplada o inhibida como por distintas sustancias como el dinitrofenol
(DNP) y el azida de sodio, de tal modo que el transporte de electrones continúe, pero no la fosforilación del
ADP, y, por lo tanto, la producción de ATP, en el caso del desacoplante; o que se inhiba por completo la
cadena de transporte en el caso del inhibidor. Estos procesos de inhibición y del desacoplante se pudieron
observar con éxito, con la no liberación de protones H+ y la alcalinización del medio (Gráfica 1 y 2, Tabla 1 y
2); por lo que, los resultados cumplen completamente la teoría, pues se esperaba que el tratamiento con azida
de sodio presentara el pH más alcalino al detener completamente las bombas de protones, seguido del
tratamiento del DNP que presenta solo una ralentización del proceso de la cadena de transporte de electrones
sin producir sin producir ATP al destruir el gradiente electroquímicos y provocar una falta de energía
disponible para impulsar la síntesis de ATP, mientras que el tratamiento control se esperaba que presentara la
mayor concentración de H+. Se logró con éxito comprobar el proceso metabólico de las levaduras
Saccharomyces cerevisiae y como el pH está relacionado a la producción de iones H+ en la cadena de
transporte de electrones, donde un descenso de pH (acidificación) puede ser un indicativo del metabolismo de
glucosa por parte de las levaduras. Así como un aumento de pH (alcalinización) puede ser un indicativo de
agentes inhibidores o desacoplantes, donde se interrumpe el flujo de protones y en consecuencia la
producción de ATP.
Por último, se puede concluir la participación de las bombas de protones en la regulación de pH extracelular y
la relación de estas entre sí y en la vía metabólica. Donde la ATPasa H+ energiza la entrada de nutrientes y
modula el pH; la importancia de esta enzima radica en mantener una diferencia en el pH. Al igual que la
importancia de la enzima ATP sintasa, donde, esta sintetiza el ATP en la mitocondria, mientras que, en la
membrana plasmática, la ATPasa de H+ hidroliza este ATP para bombear protones al exterior de la célula, por
lo que se genera un gradiente electroquímico necesario para transportar los nutrientes

Referencias
- Baynes, John W., Bioquímica médica, 2ed., Elsevier España, 2005
- Nelson, D. L., Cuchillo Foix, C. M., Lehninger, A. L., & Cox, M. M, (2005), Lehninger: Principios de
Bioquímica (5a. ed.). Barcelona: Omega, (p. 587)
- Solomon, Berg, Martin & Villee: Biología de Villee; 3ra ed., Editorial Interamericana, Mc Graw – Hill,
México,
- Fernández, J., & Prieto, M., Efecto de cuatro inhibidores metabólicos, mayo 07, 2022, de JDEN Sitio web:
https://www.osti.gov/etdeweb/servlets/purl/21017436
- Instituto de Ecología, H+-ATPASA, UNAM, Recuperado
de:http://web.ecologia.unam.mx/oikos3.0/index.php/glosario/532-h-atpasa
- Peña, A., & Ramírez, J., (2000), Intercambiadores catión/protón en levaduras, mayo 05, 2022, de Revista
Latinoamericana de Microbiología Sitio web: https://www.medigraphic.com/pdfs/lamicro/mi-
2000/mi004h.pdf