Unidad II.

Cromatografía
CROMATOGRAFIA
1848 Way y Thompson: Reconocieron el fenómeno de intercambio iónico en sólidos.
1850 Runge, Schoenbein, y Goeppelsroeder: Estudiaron el análisis por capilaridad en papel.
1876 Lemberg: Ilustró la reversibilidad y estequiometría del intercambio iónico en
minerales como el silicato de alumino.
1892 Reed: Separación en columna en tubos de kaolín usados para la separación de FeCI3 y
el CuSO4.
1906 Tswett: Inventó la cromatografía en columna con el uso de solventes puros para
desarrollar un cromatograma, usó adsorventes suaves para resolver una mezcla de
pigmentos, (ver más detalles abajo).
1930 Karrer, Kuhn, y Strain: Usó adsorventes como hidróxido de calcio activado, aluminio y
magnesio
1935 Holmes y Adams: Sintetizó resinas orgánicas para intercambio iónico.
1938 Reichstein: Introdujo la cromatografía líquida o fluida, así extendió las aplicaciones de
la cromatografía a sustancias sin color.
La Cromatografía es uno de los métodos de separación más poderosos que se hayan
descubierto.

El término "cromatografía" posiblemente derive de las palabras griegas "chroma" (color) y

"graphein" (escribir), aludiendo a que los pigmentos vegetales separados se ponen
claramente de manifiesto como bandas coloreadas. Sin embargo, el mismo Tswett indica
que también pueden separarse sustancias incoloras por el mismo procedimiento.
Mezcla de componentes Separación de componentes

Columna empacada con silica

Cuando se utiliza una columna rellena de CaCO3 en la que se introduce un
extracto de hojas verdes en éter de petróleo, y seguidamente se añade disolvente
puro (eluyente) es posible la separación de clorofila, carotenos y xantofilas.

En estas separaciones, la fase estacionaria es el relleno (CaCO3), la fase móvil es

el éter de petróleo y los componentes a separar, los distintos pigmentos vegetales,
los cuales se encuentran sometidos a dos fuerzas contrarias: el disolvente tiende a
arrastrarlos hacia la salida y el CaCO3 a retenerlos. Como este último efecto es
diferente para los distintos pigmentos, éstos se mueven a diferente velocidad y
emergen de la columna a distintos tiempos
La característica que distingue a la cromatografía de la mayoría de los métodos
físicos y químicos de separación, es que se ponen en contacto dos fases
mutuamente inmiscibles:
 La FE y la FM
 La muestra en la FM es transportada por la FE
 Los analitos experimentan interacciones
repetidas (repartos) entre la FM y la FE.
 En una FM y FE los analitos se separan
gradualmente en bandas en la FE.
 Al final los componentes separados
emergen en orden creciente de interación
 El componente menos retardado emerge
primero, el retenido eluye al final.

 El reparto entre las fases aprovecha las

diferencias entre las prop. físicas y/o
químicas de los componentes de la
muestra.
 MECANISMO DE LA CROMATOGRAFIA
El movimiento de las substancias es el resultado de dos fuerzas:
Cromatogramas de dos componentes ilustrando dos métodos para mejorar la
separación: a) cromatograma original con los picos solapados; mejora producida por b)
un aumento en la separación de las bandas y c) una disminución de la anchura
(dispersión) de las bandas
 TIPOS DE CROMATOGRAFIA

La cromatografía puede clasificarse de acuerdo al tipo de equilibrio

involucrado, mismo que es gobernado por el tipo de fase estacionaria
utilizada. Así la cromatografía puede ser :

(1)Adsorción
(2) partición
(3) intercambio iónico
(4) exclusión
(5) afinidad
 Cromatografía de Partición
 La fase estacionaria de la cromatografía de
partición es un líquido soportado en un sólido
inerte.

 La fase móvil puede ser un líquido (cromatografía

de partición líquido-líquido) o un gas
(cromatografía de partición gas-líquido, GLC).

 La cromatografía en papel es un tipo de

cromatografía de partición en la cual la fase
estacionaria es una capa de agua adsorbida en una
hoja de papel.
Cromatografía de Adsorción

 La FE es un sólido en el que los componentes de la

muestra son adsorbidos.

 La FM puede ser un líquido (cromatografía líquido-

sólido) o un gas (cromatografía gas-sólido);
los componentes se distribuyen entre dos fases a
través de la combinación de los procesos de
adsorción y desorción.

 La cromatografía de capa fina (TLC) es un ejemplo

especial de cromatografía por adsorción en la cual
la FE es un plano, en la forma de un soporte
sólido en un plato inerte.
Se pueden llevar a cabo separaciones por intercambio
iónico
Columna
Plana

Los intercambiadores cargados + tienen contra-iones

cargados - (aniones) disponibles para ser intercambiados
por lo que son llamados intercambiadores aniónicos.

Los intercambiadores cargados - tienen contra-iones

cargados + (cationes) y se les conoce como
intercambiadores catiónicos.
Cromatografía de intercambio iónico

 Las partículas cargadas (-) se unen a la matriz

sólida cargada (+), y son retenidas

 Las partículas cargadas (+) son rechazadas

por la matriz sólida cargadas (+), y son
eluidas

 La elución de las partículas cargadas (-) se

consigue cambiando el pH del solvente hasta
igualarlo a su PI o hasta invertir su carga neta
Cromatografía de intercambio iónico
• Permite la separación de las moléculas con base a su carga neta.
• Las proteínas cargadas pueden unirse a intercambiadores aniónicos o catiónicos
dependiendo de su carga neta.
• Las proteínas más cargadas se unirán más fuertemente al intercambiador y serán
más difíciles de eluir.
• La afinidad con la que se une la proteína al intercambiador iónico depende de la
fuerza iónica del medio determinada por el pH, debido a la competencia de los
grupos cargados de la proteína y los iones del medio.
• Para eluir las proteínas se debe aumentar la fuerza iónica del medio.
Grupos de intercambiadores iónicos
La naturaleza de la matriz afectará su comportamiento hacia sustancias
biológicas y el mantenimiento de la actividad biológica. La matriz puede
estar fabricada:

Compuestos inorgánicos
Resinas sintéticas
Polisacáridos.

Las características de la matriz determinan sus propiedades

cromatográficas tales como:

Eficiencia Capacidad
Recuperación Estabilidad química
Fuerza mecánica Fluidez
Los experimentos de intercambio iónico se llevan a cabo en cinco etapas:

1.- Es un equilibrio en el cual el intercambiador iónico se encuentra en las condiciones

apropiadas de pH y fuerza iónica, lo que permitirá la unión de las moléculas de soluto.

2.- Se aplicación de la muestra y su adsorción, las moléculas del soluto llevan a cabo el
apropiado desplazamiento de carga de los contra-iones y se unen al gel. Las substancias
que no se unen son eluídas del intercambiador usando el buffer inicial.

3.- Se lleva a cabo la desorción de la muestra cambiando las condiciones de elusión, al

desfavorecer la formación del enlace iónico de las moléculas de la muestra y del
intercambiador. Esto normalmente se logra aumentando la fuerza iónica del buffer de
elusión o cambiando su pH.

4.- La remoción de sustancia no eluídas bajo las condiciones experimentales previas

5.- Regresar al equilibrio de las condiciones iniciales para la siguiente purificación.

Cromatografía de exclusión por tamaño

la fase estacionaria es un material poroso que permite

la elución diferencial de los solutos en función de sus
tamaños moleculares.

Los rellenos empleados en cromatografía de exclusión

por tamaño deben ser :
Inertes Estables
resistentes Tamaño de partícula y poro uniformes.

Están compuestos por pequeñas partículas de sílice o

de polímeros, con un diámetro entre 5 y 10 μm, que
tienen una red de poros donde se quedan atrapadas las
moléculas de soluto.
El principio de la separación es el siguiente: el material que llena la columna (fase
estacionaria, gel o resina) está formado por partículas con poros de un cierto intervalo
de tamaños. Las moléculas mayores que los poros no pueden entrar en ellos, por lo
que "pasan de largo" y avanzan por la columna (eluyen) con mayor rapidez que las de
tamaño menor, que pueden entrar en los poros y así realizan un recorrido mayor,
progresando más lentamente a lo largo de la columna.

En una cromatografía en columna lo habitual es recoger fracciones del líquido que

sale (o eluye), para analizarlas individualmente y así trazar el perfil de eluciónde la
cromatografía.
Cromatografía de exclusión por
tamaño

En la cromatografía de exclusión puede

separarse moléculas solvatadas de
acuerdo a su tamaño y habilidad a
penetrar en una estructura tamiz (la
fase estacionaria).

La separación en cromatografía de
exclusión por tamaño se lleva a cabo
por diferencias en tamaño molecular y
la habilidad de diferentes moléculas
para penetrar los poros de la fase
estacionaria a diferentes tamaños o
magnitudes.
Cromatografía de afinidad
Se utiliza para la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a
un determinado ligando.

Se trata de un tipo especial de cromatografía de adsorción sólido-líquido en la que la

sustancia de naturaleza bioquímica se enlaza químicamente en soportes sólidos
adecuados, retienen a los solutos (analitos), también de naturaleza bioquímica, de
manera reversible y selectiva.

Las separaciones se basan en el acoplamiento ¨llave-cerradura¨ típico de la biología

molecular.
Ligandos de afinidad

Son las moléculas bioquímicas que se encuentran

ancladas químicamente sobre el soporte sólido inerte,
y son las responsables de la adsorción específica de los
solutos-analitos. Se clasifican por:

 Naturaleza
Macromoléculas biológicas
Moléculas de bajo peso molecular

 Selectividad
Ligandos específicos: anticuerpos , que se enlazan reversiblemente a un solo soluto
Ligandos generales: lectinas y nucleótidos , enlazados con un determinado grupo de
compuestos bioquímicos.
Soportes
El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con el
ligando de afinidad. Debe poseer las siguientes propiedades como :

 Tener una gran superficie,

 Tamaño del grano controlable,
 Porosidad controlable,
 Carácter suficientemente hidrofílico para evitar adsorciones no específicas de proteínas
u otras moléculas,
 Estabilidad mecánica, en especial para trabajar a alta presión.

El material utilizado generalmente para el soporte son:

 Geles orgánicos derivados de los polisacáridos como la agarosa (sepharosa),
 Polímeros de acrilamida,
 Fractogel TSK
 Sílices CPG.
Fundamento de la cromatografía de afinidad
Una muestra de naturaleza biológica se introduce en la
columna que contienen un soporte polimérico inerte que
retienen a la sustancia activa enlazado covalentemente y
que se denomina ligando de afinidad.
Sólo existe interacción específica entre este ligando y
analito (proteína) de la muestra insertada que queda
retenido (adsorbido). Se procede a la elución de los
demás componentes de la muestra mediante una primera
fase móvil que no influye en el acoplamiento.

Una nueva fase móvil desactiva el acoplamiento por

alteración de los sitios activos del inhibidor-ligando
(cambio de pH, modifica las características de los sitios
activos); se eluye así el soluto de interés.
Algunas interacciones biológicas típicas usadas frecuentemente en cromatografía de
afinidad son:
 Enzima = sustrato análogo, inhibidor, cofactor.
 Anticuerpo = antígeno, virus, célula.
 Lecitina = polisacárido, glicoproteína, receptor de superficie celular, célula.
 Ác. nucleico = secuencia base complementaria, histonas, polimerasa de ácidos
nucleicos, proteína de unión al DNA.
 Hormona = vitamina receptor, proteína acarreadora.

La cromatografía de afinidad tiene una serie de características generales que la

distinguen de otros tipos de cromatografía líquidas:

 Alta selectividad en el mecanismo de retención

 Campo de aplicación restringido
 Separación de un solo soluto analito
 Empleo de sistema de baja presión
 Columnas cortas de escasa eficacia cromatográfica
Factores que influyen en el grado de separación de una mezcla en cualquier técnica
cromatográfica:

1. Velocidad de flujo del solvente

2. Solubilidad de las sustancias en el solvente
3. Efectos de fraccionamiento (partición)
4. Efectos de adsorción

Los dos primeros son responsables de la movilización de los componentes a través

de la FE y los dos últimos del retardo del movimiento .

Por lo tanto los factores primordiales que determinan la separación cromatográfica

son la combinación de la solubilidad y el flujo del solvente.
 Columna C18 o octadecilo
Separación de fase reversa (FR, compuestos hidrofóbicos), los componentes son
separados basados en la diferencia de sus polaridades que crea interacciones de
fuerzas especificas entre el gel, la fase movible y el analito.

El material de empaque es, típicamente, gel de sílice, y se modifica con varios

grupos funcionales hidrofóbicos, entre los cuales el octadecilo es el más
comúnmente empleado.

El grupo funcional es una cadena recta de 18 carbonos; un gran número de

hidrocarburos de esta cadena está atado en la superficie del gel de sílice como
también dentro de sus poros.