LABORATORIO 2

DOSAJE LDH
Mblgo. Dr. Enrique Martin Alva
C.B.P. : 3582 R.N.B.E : 0090
 DOSAJE LDH FUNDAMENTOS DEL METODO
https://www.labster.com/simulations/enzyme-kinetics/ NAD+-oxidoreductasa; EC 1.1.1.27
PROCEDIMIENTO
http://unitslab.com/es/node/152 Basado en el siguiente esquema de reacción:
LDH
I- TECNICA CON REACTIVO UNICO
Piruvato + NADH + H+ L-lactato + NAD+
A) 30-37 C
o

En una cubeta mantenida a la temperatura de

trabajo, CALCULO DE LOS RESULTADOS
colocar:
Reactivo único 1 ml LDH (U/l) = ΔA/min x factor de Calculo (Fc)/0.01667
Preincubar 3’ luego agregar:
Muestra 20 ul Fc correspondiente de acuerdo a T° de Rx (30-37oC o
Mezclar inmediatamente y disparar 25oC ) y a la técnica empleada (con Reactivo único o
simultáneamente el cronómetro. separados)
Esperar 30 segundos. Leer la absorbancia
inicial y luego a los 1, 2 y 3 ‘ de la primera lectura.TECNICA CON REACTIVO UNICO
Temperat.
Determinar la diferencia promedio de absorbancia/ 25oC 30-37oC VALORES REF.
min (ΔA/min), restando cada lectura de la anterior y Long. onda
340 nm 4.921 8.095 230-450 U/L
promediando los valores.
334 nm 5.016 8.253
Utilizar este promedio para los cálculos.
366 nm 9.118 15.000
https://www.merckmanuals.com/es-
us/professional/multimedia/table/v8508814_es
 DOSAJE DE LDH
λ: BH2O: Cst ¿?mg/dL 8.095
F : ------------- =
DPS
A:
DI0: DII0:
0
10 0
nm nm A 0.00 V.R : DI1': DII1':
-
- -
T100 % DII2':
230-450 U/L DI2':
1000 1
1
uL - PUSH
DII3':
-
2 2
-
DI3':
-
3
3
DPDI= DPDII =
S D2
-

D1
-
BH2O
[LDH]I : DPMI x F = 340.7.8 U/L
4 4
- - BH2O
5
[LDH]II : DPMII x F = 339.7U/L
5

- - - -
Rx.T
H2O 1.0 ml
Des
A+B
tilada
4/1

: - FUNDAMENTO
- -
Minutos
T° -
- °C : Vademecum Wiener Lab, Rosario, Argentina

Enzima responsable de la conversión del piruvato a

20 ul 20 ul
lactato empleando NADH. Enzima citosólica.
1. ml 1. ml
Rx.T
Distribución: amplia. Hígado, músculo, corazón.
A+B
4/1 Preincubar 3’ luego agregar: Muestra 20 µL Isoenzimas por subunidades H y M.
Mezclar y disparar el cronómetro. Piruvato + NADH+ H+ ----------------Lactato + NAD+
Esperar 30 ‘. Leer la absorbancia inicial y luego a La conversión del NADH a NAD+ se mide a 340 nm
los 1, 2 y 3 ‘ de la primera lectura. A 340 nm
Dr. Enrique Martin A. Determinar la diferencia promedio de Reactivo A: Buffer tris y piruvato pH 7.2
C.B.P. : 3582 R.N.B.E : 0090 absorbancia/ Reactivo B: NADH.
Rx.T
min (ΔA/min), restando cada lectura de la anterior y Reactivo de Trabajo (Rx.T ):
A+B
promediando los valores
Dr. Enrique Martin A.
(A+B) 4/1 4/1

C.B.P. : 3582 R.N.B.E : 0090

http://www.scymed.com/es/smnxtb/tbcbgrh1.htm
 Liquido seroso: Liquido de cavidad pleural,
Tabla I. Criterios bioquímicos para diferenciar pericárdica y peritoneal.
entre exudado y trasudado en líquido pleural Tabla 2. Características macroscópicas de los
Trasudado Exudado líquidos serosos
Turbidez Color
LPl-LDH /Srm-LDH < 0,6 > 0,6 Claro o transparente Amarillo claro
Turbio Amarillo anaranjado
LPl-LDH < 2/3 valor superior > 2/3 valor superior Purulento Amarillo verdoso
del intervalo de del intervalo de Opalescente o lechoso Hemático
referencia en suero referencia en suero Quiloso Hemorrágico

LPl-Proteina < 0,5 > 0,5

/Srm-Proteína

LPl-bilirrubina / < 0,6 >0,6

Srm-bilirrubina

LPl-colesterol / < 0,3 >0,3

Srm-colesterol

Srm-albúmina- > 12 g/L < 12 g/L

LPl-albúmina
Srm= Material de referencia estándar
 LIPIDOS
ACIDOS POLISACA
PROTEINAS LIPIDOS COMPLEJOS
NUCLEICOS RIDOS MME
EIM
4H+
Ox (O) Oxidación 4H+ 2Cit
c
2H+
2e¯ 3H+
AMINO NUCLEOT MONOSA AC. 2e¯ 2e¯
CARIDOS
GLICEROL GRASOS
Fe-S QH
QH22 Cit c1
ACIDOS IDOS FMN C I 2e¯ Q
Fe-S
C III
e¯ CuA C IV
C II Fe-S a
2e¯ 2Cit b
2e¯
GLUCOSA 2H+ FADH2 FAD + 2H+
a3 CuB
NADH
Succinato Fumarato
Gliceraldehido- 2e¯
3-fosfato H+ + NAD+ ½ O2 + 2H+ H2O
MATRIZ
PIRUVATO Fox (PADP
) + Pi ATP
ΔpH + ΔΨ = FMP Fosforilacion
Acetil
-CoA MMI
ΔpH +++++++++++++++++++++ ΔΨ
Ciclo
de CO2
Glucosa : Combustible Universal
Krebs MITOCONDRIA

e- Rica en energía: Ox completa a CO2 y H2O

NADH
FADH2 Gluc + 2ADP + 2 Pi → 2lactato + 2 ATP + 2H2O + 2H+
NH4 Transporte de e- y
Fosforilacion Oxidativa
ADP O2 Cloroplasto Glucosa + 6O2 → 6CO2+ 6 H20 = 32-38 ATP
Anabolismo H2O
ATP NAD+
∆G0’ = - 2840 kJ/mol
Catabolismo
FAD LUZ
Flujo de e-
Resumen Oxidación de Combustibles (GED) kcal/día. = [TMB, TMR,GER] + AF + [TID]
La glucosa combustible universal Producción de moléculas en:
2/3ATPOx.Comb MATRIZ
TRANSPORTE Ox (O)
CITOSOL MITOCONDRI
Proceso AL
ELECTRONICO Fox (P)
Glucosa
(C6H12O6) GLUCOLISIS PGK,PK 2 ATP 2ATP
2ADP ( SUBSTRATO) GAPDH 2 NADH 6 ATP 6ATP (5)
( SUBSTRATO) 2ATP PDH
2e- Ac. Piruva
2 x (1 NADH) 2 x (3 ATP) 6ATP(5)
NAD+ NADH 2e
2e
-
-
RESPI A CoA
SCS ( SUBSTRATO)

2Piruvato
RACI CICLO DE
2 x (1 ATP) IDH,α -CGDH ,MDH
2 ATP
Lactato 2e- 2 x (3 NADH) 2 x (9 ATP) 18ATP (15)
∆ LDH (C3H4O3) α – Cetoglutarato ON KREBS
2 x (1 FADH2) 2 x (2 ATP)
SDH 4 ATP (3)
CO2
2e-
CO2 TOTAL :38-32 ATP
CoA ADP ATP ADP ATP ADP ATP
Amino Succinil-
CoA 4H+/1 ATP
ácidos Acetil-
Cuerpos ( SUBSTRATO) GRADIENTE DE PROTONES (10H+) H2O
cetónicos
CoA GTP
Cit a3
NADH2 Cit a
FMN CoQ Cit b Cit c ATP
Ácidos 2e- 2e- 2e- 2e- 2e- ½ O2 +
grasos 2e- Sintasa
Acetato 2H+
2e- FADH2
2e- ADP + Pi ATP
2e- Ox (O) Fox (P)
 GLUCOLISIS ANAEROBIA COND. AEROBICAS Glucosa + 6O2 → 6CO2+ 6 H20
Cuerpos Acidos grasos
Gluc + 2ADP + 2 Pi → 2lactato + 2 ATP + 2H2O + 2H+ 2 ATP 2 ADP + cetonicos
2 Pi Aminoacidos
Glucosa 2 Piruvato
Glucosa
VelcOx Comb y ATPgasto 2 NAD+ NADH
2 ADP + 2 NADH + Nitrogeno

α
2 Pi 2NAD+ 2 H+ NADH FADH2

2 ATP
Reg Acetil -CoA
Urea
Phase 1
FeeddbackCTE y Vias Ox
2NADH + 2H+ O= C– O-
O= C–O -
Ciclo Oxidación
C=O H = C - OH
Ejem. ATC combustibles
CO2
CH3 LDH CH3 < E°W = ↑glucógeno o grasa X
XH2 CO2
5 Isoenzimas GTP
2Piruvato 2Lactato La (TMB),
Velc Lanzaderas G-3-P y
2FADH2
pH intracelular 7,35, el equilibrio calóricoVelc
SíntesisATP y el ΔG° Malato- Aspartato
3NADH
Ac. láctico (pKa 3,85 ) anión Oxid C Phase 2
CUANTIFICAN
Phase 1 LOSNADH I
carboxilato, lactato y H+ = Generación ATP.
REQUERIMIENTOS DEETC E° y la E° T II O2
Fosforilacion
LACTOACIDOSIS
C.KrebsANFIBOLICA
derivada de Ox Combustibles 32-38 E III
H2O Oxidativa
ATP
•Eritrocitos(sin mitocondrias)
Velc Phase 2
IV
++
•Músculo esq.
HidrolisisATP H+
ADP + Pi
+ ∆p
ejercicio intenso) calor Phase 3 ATP
Phase 3 CO2 ATP
HIPOXIA = Lactoacidemia Hidrolisis ATP
Producción de Utilización de energía
Regulacion
↓O2 Medula Renal, energía via Biosíntesis
Oxidacion de : Destoxificacion
Carbohidratos Contracción muscular
Lipidos Transporte activo iones
¿ APLICACIÓN CLÍNICA ?
enzimática Proteinas Termogénesis

O2 ADP + Pi
 Isoenzimas específicas de tejido, Enzima
GLUCOLISIS REGULANDO EN condiciones VARIABLES limitante
ATP 1 HK MUSCULO (Km=0.1mM)
Glucosa + 2 ATP + 2 NAD + 4 ADP + 2 Pi → 2 Ac pirúvico + 2 NADH + 2 (4) ATP -
ADP GK
HIGADO (Km=10mM)
Función : GENERAR ATP

BENEFICIOS PREPARATORIA
GLUCOSA-6-P

Consumen 2 ATP 2 PGI

ATP,CITRATO
Tejidos: todos Localización: citosol FRUCTOSA-6-P
- AMP,ADP, F2,6BP
•Principal combustible de la > organismos (5Rx) ATP
3 PFK-1 (Gluconeogenesis)
ADP
• Rica en energía: Ox completa a CO2 y H2O FRUCTOSA-1-6-BP TPI DIHIDROXI-ACETONA-P
4
glucosa + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H2O : ∆G0’ = - 2840 kJ/mol Aldolasa TPI
4 5
•3 destinos:
Pi GLICERALDEHIDO-3P Pi
GLICERALDEHIDO-3P
- Almacenamiento (glucógeno-genesis), Forman
NADH NADH
- Ox. vía glucolisis / VPP, (si↑ necesidades energéticas)
6 2 NADH 6 GAPDH
NAD+
1,3-BIS-P-GLICERATO y NAD+
1,3-BIS-P-GLICERATO
- Degradación = ↑↑[metabolitos] = Rx. biosintéticas.
ATP ATP
Intermediarios fosforilados: 7
ADP
7 PGK
ADP
-Hidrólisis compuestos ↑energía acoplada a síntesis ATP. 3--P-GLICERATO 3--P-GLICERATO

-fosfato ionizados(-) a pH 7 . No difunden (5Rx) 8 4 ATP 8 PGM

2--P-GLICERATO 2--P-GLICERATO
Tres tipos de transformaciones químicas: 9 9 Enolasa
ATP,AcoA,
-(ruta de los C) FOSFOENOLPIRUVICO Ac.Grasos FOSFOENOLPIRUVICO

-fosforilación ADP a ATP (ruta de los fosfatos) ATP - ATP

-transferencia de e- NAD+ →NADH (ruta de los e-) ADP

10
PK + ADP,Ca2+
ADP
10 PK
F1,6BP
Ac. Pirúvico(C3H4O3) Ac. Pirúvico(C3H4O3)
 1
Función hepática ≈ [glucosa]sérica
metaboliza SOLO ↑↑[glucosa]sérica
∴
α Alimentacion =↑[Insulina]
= (Sintesis GK) ⊕ GK
ATP
ADP
1

GLUCOSA-6-P
2
HK
GK
PGI
-
MUSCULO (Km=0.1mM)

HIGADO (Km=10mM) ⊕
HEXOQUINASAS ATP,CITRATO
FRUCTOSA-6-P
-
ATP AMP,ADP, F2,6BP
3 PFK-1 +
Hexoquinasa
3 ADP
FRUCTOSA-1-6-BP TPI
(Gluconeogenesis)
DIHIDROXI-ACETONA-P
- 4 Aldolasa 4
5 TPI
Act. Alosterica (PFK-2 GLICERALDEHIDO-3P GLICERALDEHIDO-3P
⊕ Pi Pi
Glucoquinasa fosforilada.) NADH NADH
6 6 GAPDH
Su ∆ es proporcional a NAD+ NAD+
la [Glu]SERICA 1,3-BIS-P-GLICERATO 1,3-BIS-P-GLICERATO
ATP ATP
PFK-1 y PDH, vinculan glucólisis y 7
ADP
7 PGK
ADP
Actividad máxima a [Glu]
en sangre de 5mM
ATC, 3--P-GLICERATO 3--P-GLICERATO

Regulados POR USO ATPMUSC 2--P-GLICERATO 8 8

2--P-GLICERATO
PGM

ESQUELETICO 9
ATP,AcoA, 9 Enolasa
FOSFOENOLPIRUVICO Ac.Grasos FOSFOENOLPIRUVICO
ATP - ADP,Ca2+ ATP
NAD+ NADH ADP
10 PK +
F1,6BP ADP
10 PK

LACTATO ↑Piruvato (C3H4O3) Pirúvato(C3H4O3)

Reg. Desfosforilacion y ∆ LDH
10 Fosforilacion NAD+
Piruvato - NADH,Ac.CoA

↑↑NADH/NAD+ PDHmitc IRREVERSIBLE

∆
+
↑ Insulina/Glucagon NADH
↑↑Ac.CoA
ADP,Ca2+
 1.- RENDIMIENTO ENERGÉTICO DE LA GLUCÓLISIS AERÓBICA
¿Cuáles son los pasos generadores de energía cuando el piruvato se oxida por completo a CO2 para producir 12,5(15)
moléculas de ATP por piruvato?
Glucosa + 6O2 → 6CO2+ 6 H20
Producción de moléculas en:
MATRIZ TRANSPORTE
Proceso CITOSOL
MITOCONDRIAL ELECTRONICO

( SUBSTRATO) PGK,PK 2 ATP 2 ATP

GLUCOLISIS
GAPDH 2 NADH 6 ATP 6 ATP
ACIDO PDH
PIRUVICO a 2 x (1 NADH) 2 x (3 ATP) 6 ATP
ACETIL CoA
RESPIRACION SCS ( SUBSTRATO)
2 x (1 ATP) IDH,α-CG-DH ,MDH
2 ATP
CICLO DE KREBS 2 x (3 NADH) 2 x (9 ATP) 18 ATP
2 x (1 FADH2) 2 x (2 ATP) 4 ATP
SDH
TOTAL :38 ATP
 3. TEJIDOS QUE DEPENDEN DE LA GLUCÓLISIS ANAERÓBICA
♂reposo w70 kg 300g/carb/dia
Baja demanda de ATP, ↑↑ [Enz. glucolíticas ] y pocos capilares,
Producción diaria Lactato g/dia
Producción Total 115 La falta de mitocondrias, o > ∆ glucólisis ≈ función celular.
Eritrocitos 29
Piel 20 Erit maduro no mitoc Metb oxid podría interferir transporte O2 unido Hb
Encefalo 17
Musc. Esquel. 16 ácido láctico en la piel se secreta en el sudor, antibacteriano
Medula Renal 15
Mucosa Intestinal 8
Otros tejidos 10
Tumores grandes carecen de capilares en su centro

En tejidos con POCAS mitocondrias, glucólisis aeróbica como la anaeróbica ocurren de

manera simultánea.
Demanda e- excede CTE y OXFOX para producir ATP, se activa glucólisis anaeróbica y

> NADH/NAD+ dirige el exceso de piruvato hacia el lactato.

 4. DESTINO DEL LACTATO → ↑↑∆ NADHOx en CTE o Gluconeogénesis
hígado, corazón y
músc esquelético Lactato + NAD+ ↔ piruvato + NADH + H+
Musc Esquelético Corazón generar energía.
M4 H4
LDH :tetrámero ,2 subunidades Ciclo de Cori.
M, músculo esquelético) y
H, corazón,).
Glucosa Glucosa Glucosa
M4,
M3H1, 6ATP
Gluconeogenesis Glucolisis
M2H2, Sangre
M1H3
2ATP
H4 2Lactato 2Lactato 2Lactato

Los tejidos del ojo también dependen en parte de la glucólisis anaeróbica.

• Cels transmiten luz, No mitocondrias o lechos capilares.
Epitelio corneal genera ATP aerobico y Anaerobico
• El cristalino (No mitocondrias) ATP necesaria glucólisis anaeróbica,
No necesita oxígeno ni emplea capilares.
 Mecanismos de regulación enzimática
A. Regulación por cambios en la cantidad de enzima
i. Síntesis
ii. Degradación

B. Regulación de la eficacia catalítica

no covalente: Enzimas alostéricas

a. Unión de Fosforilación
ligandos ADP-ribosilación,
covalente:
Metilación y Acetilación

b. Rupturas proteolíticas: zimógenos

c. Múltiples formas de la enzima: Isoenzimas, complejos multienzimáticos

Isoenzimas Resultados: De un paciente que tuvo hace una semana un infarto de
miocardio se hace una determinación y se obtiene 1,000 UI.
Diferentes formas estructurales de una enzima que catalizan la misma reacción
 Difieren en sus secuencias de aa, parámetros cinéticos y/o propiedades reguladoras

 Juegan un papel importante en la regulación de procesos metabólicos

 Codificados por diferentes loci

 Ejemplo: Lactato deshidrogenasa Piruvato Lactato (en ausencia de O2)

http://biomodel.uah.es/lab/acetato/LDH.htm
Dos cadenas H y M
Corazón Riñón Mov. Elec pH 8.6
Act. Enz. 60°/30’ Cel. rojas Cerebro Leucocitos Músculo Hígado % SRM

No se destruye H4 LDH 1 30% Muy rápido

No se destruye
H3M1 LDH 2 35% Rápido

H2M2 LDH 3 20% Rápido

Parcialmente

HM3 LDH 4 10% Lento

Destruida
M4 LDH 5 5% Muy lento
Destruida
 Isoenzimas o isozimas

 Aunque catalizan la misma reacción difieren en sus valores de Km para el piruvato

 El piruvato inhibe alostéricamente H4 pero no M4
Músculo Corazón

Glucosa Glucosa

LDH (M4) LDH (H4)

Piruvato Láctico Piruvato Láctico
Km Km

C02 + H20 C02 + H20

Trabajo anaerobio Trabajo aerobio

 LACTATO DESHIDROGENASA (LDH) VR : ♀ ♂ 100-200 U/L o 230-450 U/L
Eritc = 100 veces que plasma = Hemolisis ↑↑ (LDH) y en Ejerc extremo.
INFARTO MIOCARDIO AGUDO (IAM)
LDH y IAM
↑↑[LDHTOTAL ] y ↑↑[H4] 5-10 veces.
Marcador Aparición Pico Duración
Area ∝ Tamaño Infarto
CK-MB 3-6 hr 18-24 hr 36-72 hr
Troponinas 4-10 hr 18-24 hr 8-14 días
LDH 6-12 hr 24-48 hr 6-8 días
AST 24-36 hr 4-5 d 10-12 días
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Mioglobina 1-4 hr 6-7 hr 24 hr
Dias después del infarto
Diagnósticos diferenciales Resultados: De un paciente que tuvo hace una semana un infarto de miocardio se hace una
determinación y se obtiene 1,000 UI.

LDH anemias hemolíticas, daño hepatocelular, distrofia muscular, carcinomas,

leucemias y necrosis ∴ , isoenzimas es de mayor significado.

Valor diagnostico limitado( es inespecífica)

LDH-2 (H3M1) >LDH-1 (H4);
Responder Cuestionario , presentación virtual
1.¿A que vía pertenece la LDH?
2.¿Qué factores que afectan la actividad de la enzima
determinada en el laboratorio?
3.¿Qué son isoenzimas?
4.¿Cuáles son las isoenzimas de la LDH y cuál es su distribución
en los tejidos? ¿Cuál isoenzima predomina en el corazón?
5.¿Cómo interpreta los resultados del paciente?
6.¿Cuáles son las principales aplicaciones de la LDH en el
diagnóstico médico?