LABORATORIO DE QUMICA ORGNICA I PARA BQD

PRCTICA

Cromatografa de capa fina (ccf)

y Cromatografa en columna

Objetivos:
General: Conocer la cromatografa en columna como tcnica de separacin de mezclas de sustancias, sus
caractersticas y los factores que en ella intervienen.

Particulares:
Conocer la tcnica de cromatografa en capa fina, ccf, y en columna, cc.
Aplicar y comparar los mtodos cromatogrficos de capa fina y columna, para separar, identificar y purificar
compuestos orgnicos.
Observar el efecto de diferentes fases mviles en tu cromatofolio y decidir cul es el adecuado para la separacin de
ellas.
Calcular valores de Rf de varias sustancias y correlacionarlo a la seleccin adecuada del eluyente y deducir la relacin
que existe entre la polaridad de las sustancias que se analizan y la de los eluyentes utilizados.
Aplicar la tcnica de ccf como criterio de pureza e identificacin de sustancias por comparacin con patrones de las
sustancias puras.
Analizar la composicin de algunos medicamentos de tipo analgsico. Para ello utilizaremos la cromatografa de
capa fina (TLC) como mtodo de anlisis.
Extraer los pigmentos fotosintticos y separarlos mediante una tcnica sencilla de cromatografa en papel.
Separar los diferentes componentes de las muestras problemas con la ayuda de la cc.

Generalidades
Los mtodos cromatogrficos se utilizan con frecuencia en el laboratorio de qumica orgnica con el propsito de separar mezclas de
compuestos sintticos o naturales y para la purificacin de diversas especies orgnicas, ya que de esta manera se fraccionan los
componentes de una mezcla. Tambin se puede lograr la identificacin tentativa de compuestos mediante la comparacin de estos
con otros que se creen idnticos.
El trmino Cromatografa (del griego chroma = color y graphos = escritura), aunque implica color, ha sido utilizado indistintamente
para procesos en donde se emplean materias coloridas e incoloras. En general, el mtodo presenta una fase estacionaria,
comnmente slida, la cual absorbe o adsorbe la mezcla por separar y una fase mvil (lquido o gas), que pasa sobre la fase

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estacionaria y compite con ella por los constituyentes de la mezcla, presentando stos una migracin selectiva a travs del sistema
de dos fases.
As, la mayor o menor permanencia de los componentes de la mezcla sobre la fase estacionaria al emplear diferentes fases mviles
es la base del sistema cromatogrfico; por otra parte, la tcnica seala la manera en que se desplaza la muestra a travs de la fase
estacionaria y tambin la fuerza con que el disolvente se adsorbe en dicha fase. En la Tabla 4.1 se esquematizan los mtodos
cromatogrficos ms comunes.

Fase estacionaria
Fase mvil
M
E
T
O
D
O
S

Tabla 4.1. Mtodos cromatogrficos.

Lquido
Slido
Gas
Lquido
Gas
Lquido
CROMATOGRAFA
Gas-Lquido
LquidoGas-Lquido
Lquido-Slido (CLS)
(CGL)
Lquido (CLL)
(CGS)
Adsorcin
Reparto

Adsorcin

Intercambio inico
Exclusin molecular

Cromatografa de reparto. Involucra una fase mvil, que puede ser un lquido; en este caso se trata de cromatografa
lquido-lquido (CLL), o un gas, en cuyo caso es cromatografa gas-lquido (CGL). La CLL se lleva a cabo en celulosa y gel de slice
hmeda. En el gel de slice el agua presente acta como soporte de la fase estacionaria, por lo que se emplea para separar
sustancias hidrosolubles. La separacin se efecta al repartirse la sustancia entre la humedad del soporte y el eluyente que fluye
sobre ella. A su vez, la CGL involucra una fase estacionaria la cual presenta una estructura anloga a la de las sustancias que
componen la mezcla. Para ello se crea una pelcula muy fina que hace la funcin de fase estacionaria, la cual debe poseer baja
volatilidad sobre el soporte slido, por lo que aumenta as la superficie interfasial entre el gas y el lquido.
Cromatografa de intercambio Inico. Involucra grupos funcionales comunes de los intercambiadores inicos: grupos
+
catinicos (como -S03H, -CO2H, -OH, -SH, -P03H2, -NR3 ) o grupos aninicos (como NH2, -NHR, -NR2). Estos grupos funcionales se
unen covalentemente a la fase estacionaria slida, lo cual es, por lo comn, una resina constituida por grupos reactivos
asociados a iones lbiles capaces de intercambiarse con otros iones presentes en el medio que los rodea. Consecuentemente, los
iones del soluto, de carga opuesta a los de la fase estacionaria, son atrados por sta ltima mediante una fuerza electrosttica.
La fase mvil es un lquido, con lo que el equilibrio de los iones de soluto entre el disolvente y los sitios fijos (positivos o
negativos) cargados de la fase estacionaria fundamenta este mtodo cromatogrfico.
Cromatografa de adsorcin. Ideada por Tswett y reimplatada por Kuhn y Lederer en 1931. La separacin de los componentes
de una mezcla, se logra por las diferencias de equilibrio adsorcin-desorcin, que los compuestos presentan sobre el slido
estacionario. La adsorcin es la capacidad de un sistema para detener o concentrar selectivamente sobre su superficie gases o
lquidos arrastrados por la fase mvil. As, en un sentido cromatogrfico, el trmino adsorcin se refiere al resultado de las
fuerzas intermoleculares entre la superficie del slido y las molculas del soluto, ello como consecuencia de su interaccin
debida a una o ms de las siguientes causas:
1. Fuerzas de London (fuerza de atraccin neta dbil) entre todas las superficies y molculas adsorbidas.
2. Fuerzas electrostticas entre las superficies polares y cualquier molcula adsorbida o entre superficies no polares y molculas
polares adsorbidas.

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3. Fuerzas de transferencia de carga entre donadores electrnicos fuertes y aceptores.

4. Formacin de enlaces de hidrgeno.

Al respecto, es conveniente mencionar que estas fuerzas que conducen a la adsorcin fsica son ms dbiles que las que se
encuentran en las especies inicas o covalentes. En cualquier fenmeno de adsorcin influyen tres variables: adsorbente, eluyente y
solutos. La polaridad, as como la acidez o basicidad de los tres elementos anteriores, es importante, pues influye en el
comportamiento de una sustancia en disolucin y en el poder adsorbente de la fase estacionaria.
Slidos muy porosos adsorbentes: Gel de Slice (SiO2); Almina (Al2O3)
La superficie del gel de slice interacciona con los compuestos orgnicos mediante
interacciones de carcter polar.

O
O
O

Si
O

O
Si

OH

O
O

Si

OH

Puentes de Hidrgeno
Interaccionas electrostticas
Los compuestos ms polares interaccionan ms fuertemente con la slica

O
OH
Si
O

OH

R1
H
O

Si

H
H

R2
R3

Si

O
H

O
Si

OH

Si

Si

O
H

O
O

Si

Interacciones muy dbiles

Interacciones muy fuertes

Figura 4.1

Es decir, el poder adsorbente (Figura 4.1) de una sustancia est en funcin del disolvente, as como del tamao de partcula del
adsorbente ya que cuanto menor sea esta, mayor ser el grado de separacin de la mezcla; sin embargo, disminuir la velocidad con
la que el disolvente o la disolucin pasarn a travs de la fase estacionaria. Por otra parte, para aumentar esta rapidez se puede
aplicar presin reducida (parte inferior) o presin (por la parte superior) en el caso de que necesariamente se tenga que utilizar un
polvo muy fino como adsorbente, para el caso de una cromatografa en columna.

Cromatografa en capa fina o capa delgada. Esta tcnica se designa con las siglas CCF (TLC, del ingls thin layer
chromatography), y comenz a utilizarse normalmente en 1960. Se trata de una cromatografa de adsorcin y consiste
en recubrir una placa, usualmente de vidrio, con una capa uniforme de una suspensin de un adsorbente adecuado en
polvo (fase estacionaria, Tabla 4.2).
Tabla 4.2. Algunos de los adsorbentes comunes para cromatografa de adsorcin.
Adsorbentes
Fuertes

Intermedios

Dbiles

Almina
Carbn activado
Tierra de diatomeas
(Tierra Silcea G)

Carbonato clcico, potsico y/o sdico

Gel de slice
Sulfato clcico
Magnesia
Cal apagada

Sacarosa
Inulina
Almidn
Talco
Acetato de celulosa

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Se coloca cerca del origen de la placa una muestra de una disolucin del compuesto a separar (ver Figura 4.2, donde se comenta la
tcnica de realizacin de un aplicador) en estudio, se deja que un disolvente adecuado (fase mvil) ascienda por la capa del
adsorbente por capilaridad y el (los) compuesto (s) se localiza (n) en la placa, directamente en el caso de los compuestos coloridos o
con ayuda de un revelador cuando los compuestos son incoloros.

Figura 4.2. Esquema grfico que muestra la preparacin de capilares para la aplicacin de las muestras en la placa cromatogrfica.
Los compuestos ascienden con velocidades distintas por la capa de adsorbente en relacin al eluyente, ocasionando la separacin de
los componentes de una mezcla.(Figura 4.3)

Figura 4.3. Un ejemplo de TLC

Reveladores
Los reveladores son mtodos (visuales) empleados para la localizacin de sustancias coloridas e incoloras y por consiguiente
invisibles.
Estos mtodos se pueden clasificar en fsicos y qumicos. Los
primeros utilizan propiedades particulares de los compuestos, tales
como la fluorescencia y la radioactividad, aunque su aplicacin es
muy limitada; tal es el caso de la luz ultravioleta que slo permite
reconocer entidades qumicas que presentan una iluminacin
caracterstica a longitudes de onda de la luz emitida larga de (366
nm) o corta de (254 nm). Luz UV: si la sustancia absorbe luz
ultravioleta, se puede usar una fase estacionaria impregnada con un
indicador fluorescente (F254 F366), el nmero que aparece como
subndice nos indica la longitud de onda de excitacin del indicador Figura 4.4. Lmpara para revelar placas cromatgraficas con
rayos UV
utilizado. (Figura 4.4)

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Los mtodos qumicos hacen reaccionar a las sustancias por revelar con algn agente qumico con el
que forman un compuesto colorido; el revelado con mtodos qumicos se puede realizar en uno o
varios pasos y en muchas ocasiones es necesario calentar para completar la reaccin, se presentan
algunos de los reveladores ms comunes.

La introduccin de la placa en vapores de yodo.

El roco con una solucin de agua/H2SO4 1:1 (dentro de un compartimiento especialmente protegido y bajo una campana de
extraccin de gases).
Despus calentar intensamente, por ejemplo, con un mechero hasta carbonizar los compuestos.

Concepto de Rf
La interaccin muestra, fases estacionaria y mvil fija las velocidades
relativas a las que el frente del disolvente y el soluto ascienden por la
capa del adsorbente que recubre la placa de vidrio. As, para posibles
identificaciones se calculan valores de la relacin de frentes o frentes de
retencin (Rf,). El Rf se define como el cociente entre la distancia
recorrida por el compuesto utilizado como soluto y la recorrida por el
eluyente en el mismo tiempo.(Ver Figura 4.5)
Figura 4.5

La cromatografa en capa fina es una tcnica para determinar el nmero de componentes de una mezcla y como una prueba
preliminar para realizar una cromatografa en columna, entre otros.

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Cromatografa en columna. En la cromatografa de columna (CC) se lleva a cabo la separacin

de mezclas que tiene lugar en una columna que se encuentra empacada con un adsorbente
adecuado (fase estacionaria). Se coloca la mezcla en la columna y se hace pasar por ella un
disolvente o mezcla de ellos (eluyente) o fase mvil; las sustancias son arrastradas por el
eluyente a diferente velocidad; este continuo fluir se llama desarrollo de la columna. (Figura 4.6).
Las sustancias que tienen los ms altos coeficientes de distribucin se trasladan ms
rpidamente hacia abajo en la columna y viceversa, con lo que se logra la separacin de los
compuestos los cuales son eluidos con diferentes tiempos por la columna.
Si las sustancias a separar son compuestos coloridos, se puede ver como se desplazan
sucesivamente en bandas separndose unas de otras al salir de la columna para su
identificacin, sin embargo, en la mayora de las separaciones cromatogrficas los compuestos a
separar son incoloros y, en estos casos, el fluido que abandona se recoge fraccionadamente para
ser analizada posteriormente por CCF. Los principales factores que influyen en la eleccin del
adsorbente para una cromatografa se resumen a continuacin:

Figura 4.6. Separacin

de pigmentos vegetales,
carotenos por CC

1. Debe ser insoluble en el disolvente que se va a utilizar para la separacin.

2. No debe de reaccionar con las sustancias que se van a separar, as como con el eluyente.
3. No debe actuar como catalizador de su descomposicin, transposicin, polimerizacin, isomerizacin, etctera.
Necesita presentar una composicin uniforme, debiendo ser incoloro si se emplea para compuestos coloridos.

Fue la forma original de cromatografa lquida realizada por primera vez en 1906 por Tswett. La fase estacionaria normalmente se
encuentra dentro de una columna de vidrio de 5 a 30 mm de dimetro. Se utilizan muchas clases de materiales de empaque que van
desde la almina, gel de slice, tierra de diatomeas, hasta resinas sintticas y derivados polisacridos. Se usan todos los tipos de
cromatografa lquida. Lo habitual es que la fase mvil se deje percolar a travs de la columna por gravedad. No se usa mucho en el
anlisis de alimentos ya que es una tcnica para la separacin cromatogrfica de mezclas de sustancias.
Sin embargo, hoy en da existe un sistema cromatogrfico completo y automtico diseado para el anlisis bioqumico que se
conoce como cromatografa lquida rpida para protenas. Estos instrumentos emplean un rango de fases en columnas de plstico
de 5 o 10 cm que operan bajo presin moderada.
Se revolucion el uso de la cromatografa en columna para la purificacin de soluciones de prueba o para extraer las sustancias
deseadas de las soluciones, debido a la introduccin de cartuchos cortos de plstico y desechables de minicolumnas, preempacados
con una variedad de fases de separacin con partculas de tamao relativamente grandes, por ejemplo, cartuchos de Bond-Elut y
Sep-Pak.
Las soluciones de prueba, de lavado o extraccin pasan rpidamente a travs de los cartuchos con un poco de vaco generado a
travs de una bomba de agua. La mayora de los mtodos de purificacin tales como la extraccin lquido-lquido, la TLC y la
cromatografa en columna de vidrio que se usan antes de la espectofotometra, la GLC, la HPLC etc, pueden ahora realizarse en
forma ms eficiente usando estos cartuchos.

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Colorantes que nos rodean

El color es una de las caractersticas ms frecuentes de los objetos y como tal nos permite
diferenciarlos entre s. Lo primero que mencionamos cuando se nos pide una descripcin es el
color. Esta propiedad de los materiales ha sido parte de la historia del ser humano y es por ello
que la encontramos en el arte, en las vestimentas, en las paredes de las viviendas... Incluso se
habla de que es posible curar a travs del color, mediante la cromoterapia.
Uno de los cristales de la figura 4.7 es el cuarzo, un xido de silicio que fue uno de los primeros
minerales utilizados por el hombre prehistrico. El xido de silicio se presenta bajo una gran
variedad de colores y formas cristalinas. Los cristales transparentes ms conocidos como el
cristal de roca, el citrino (amarillo), la amatista (morado) y la turmalina (verde) son piedras
semipreciosas ampliamente usadas en joyera. La variedad de sus colores depende de la forma
cristalina la cual, actuando como prisma, origina diferentes tonos que reflejan la luz de manera
distinta.

Figura 4.7

Pero, qu es el color?

El color es la propiedad que tienen los objetos de absorber y reflejar la luz visible. La radiacin
que constituye la luz visible puede incidir totalmente sobre un objeto y, a la vez, reflejarse
parcialmente. Al ser reflejada, la radiacin es captada por el ojo humano. La radiacin, en una
escala de energa cuantificada mediante valores de longitud de onda, puede ser discriminada
por el ojo humano asignando a cada valor de longitud de onda un color. Los valores de longitud
de onda perceptibles por el ojo humano estn en la regin del espectro electromagntico
denominado visible y corresponden a aquellos que estn entre los 400 y 700 nm.

En 1672, Sir Isaac Newton descubri que se poda separar la luz en diferentes
colores mediante un prisma y not que los tonos se organizaban de manera precisa
formando el denominado espectro.

Se parecen, pero no hay que confundirse

A diferencia de los alcanos donde los enlaces sencillos permiten la rotacin del enlace que conecta los carbonos, en los
alquenos el doble enlace no puede rotar sobre s mismo y, en consecuencia, los tomos unidos a los dos carbonos que
forman el doble enlace pueden tener dos orientaciones relativas diferentes: estar del mismo lado o en el lado contrario,
lo que se conoce como isomera cis-trans. El ismero cis de un determinado alqueno difiere en sus propiedades del
ismero trans, aunque presenten la misma frmula molecular.

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Interesante
Los conos y bastones que se encuentran en la retina poseen una protena
responsable del proceso de la visin llamada rodopsina, la cual contiene un
fragmento de cis-retinal, un compuesto conjugado con un doble enlace cis.
Durante el proceso de la visin hay un cambio, activado por la absorcin de luz,
de cis-retinal a trans-retinal.
Estructura de -caroteno
El color de los compuestos orgnicos est asociado con la presencia de varios
enlaces conjugados. Las molculas como el retinal o el beta-caroteno tienen la
caracterstica de ser coloreada. El beta-caroteno es de color naranja y se
encuentra en naranjas, zanahorias, las espinacas y melocotones; el licopeno,
otro compuesto altamente conjugado, es de color rojo y se encuentra en
tomates, patillas y toronjas.
Rodopsina

Estructura del caroteno

Colorantes de alimentos
Seguramente ha escuchado la frase que dice que la comida entra por los ojos. En realidad es el color el que induce a relacionar el
alimento con su calidad y de esa manera a conectarlo directamente con el sabor. Con el advenimiento de los mtodos de
conservacin de alimentos, los colorantes naturales fueron sensibles a los procesos de esterilizacin alterando sus estructuras y con
ello sus colores. Por esa razn fue necesario sustituirlos por otros colorantes ms estables: los colorantes sintticos.
Ejemplos de Colorantes naturales
Caramelo
El caramelo se produce de forma natural al calentar productos
ricos en azcares. Lo encontramos en muchas bebidas de cola,
ron, coac. Tiene, adems, usos en repostera, en la fabricacin
de caramelos, de cerveza, helados, postres, sopas preparadas.
Es el colorante ms utilizado en alimentacin: representa ms
del 90 % del total de todos los empleados.

Crcuma
Es el colorante de la rizoma de la crcuma cultivada en India.
Se usa como colorante y aromatizante. La crcuma es un
componente fundamental del curry, especie a la que le
confiere el color amarillo. La encontrars como colorante de
mostazas y en los derivados lcteos.

Colorantes alimentarios sintticos

Frecuentemente se oye decir que todo lo de origen qumico o sinttico causa cncer y/o es txico: esta afirmacin es errnea. En
cualquier caso, las cantidades de los compuestos y el tiempo de exposicin a ellos son los responsables del efecto. Dentro de los
aditivos alimentarios sintticos, los colorantes son los que han generado mayores controversias sobre su toxicidad en el ser humano.
En la mayora de los pases ha sido limitado su uso, mientras que en otros la ley los ha restringido. Cada pas tiene sus propias
regulaciones, pero en general toman como patrn a las emitidas por la FDA (EE.UU.) o por la ECC de la Unin Europea.
La tartrazina o amarillo N 5 la encontrars en las bebidas refrescantes; es la que confiere el color "limn". Sustituy al azafrn como
condimento para paellas y est presente en la mayora de las golosinas. Existe una alerta ya que estudios clnicos han indicado que la
tartrazina produce alergias, somnolencia y modificaciones en la conducta.

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Desarrollo Experimental
A. Anlisis de Analgsicos
1.
2.
3.

Cada alumno analizar dos pastillas distintas (X e Y).

Tomar aproximadamente una octava parte de una pastilla y triturarla bien (envolverla en un trozo de
papel y aplastarla con ayuda de una esptula).
Introducir el polvo obtenido en un vial.

4. Aadir 1 ml de metanol, agitar con ayuda de una esptula durante un par de minutos y dejar reposar.
5. En una placa de TLC trazar una lnea a lpiz 0.5 cm por encima del borde inferior de la placa. Sobre la
lnea hacer 5 marcas equidistantes etiquetndolas X, A, C, I, P. En cada una de esas marcas
pincharemos: X, el compuesto desconocido; y A, C, I, P las disoluciones patrn de Aspirina, Cafena,
Ibuprofeno y Paracetamol respectivamente. Utilizar un capilar para realizar las aplicaciones. Como se
muestra en la Figura 4.7

Figura 4.7

Importante! Limpiar el capilar despus de cada pinchazo introducindolo en un vial con metanol y
vaciando su contenido sobre un papel de filtro varias veces.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.

En la cmara cromatogrfica introducir una tira de papel de filtro.

A continuacin, con una pipeta Pasteur cargar el eluyente en la cubeta.
Muy importante! el nivel del eluyente en la cubeta debe de ser menor que la distancia entre el borde inferior de la placa de
cromatografa y los puntos donde hemos aplicado.
Con ayuda de unas pinzas, introducir muy cuidadosamente la placa en la cmara cromatogrfica y tapar la cmara.
Una vez que el eluyente haya alcanzado casi el final de la placa, extraer la placa de la cmara y trazar una lnea con lpiz
sealando el frente del eluyente.
Dejar que el eluyente se evapore.
Visualizar las manchas con la lmpara UV.
Marcar los contornos de las manchas obtenidas con lpiz. Repetir la operacin para la pastilla Y.
Una vez analizadas ambas pastillas completar la tabla siguiente (pregunta al profesor los nombres comerciales de los
analgsicos que has analizado) y calcula los Rf de las cuatro sustancias.
Nombre del analgsico

Ingrediente activos (si o no)

Valor de Rf

cido Acetilsaliclico
Cafena
Ibuprofeno
Paracetamol
cido Acetilsaliclico
Cafena
Ibuprofeno
Paracetamol

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B. Influencia de la estructura de los compuestos y de la polaridad del eluyente en el Rf

En esta experiencia se pretende profundizar un poco ms en la cromatografa de capa fina como ejemplo de tcnica
cromatogrfica. Se estudiar la influencia de la estructura del sustrato en su factor de retencin Rf. Para ello se comparar el
comportamiento de cinco compuestos orgnicos con diferentes grupos funcionales en cromatografa de capa fina.
OH

OH

NH2

Alcohol benclico

cido benzoico

Anilina

As mismo, se estudiar la influencia de la polaridad del eluyente en la retencin que experimentan los compuestos en
cromatografa.
1. Tomar tres tubos de ensayo y disolver en cada uno de ellos respectivamente una 1 gota de alcohol benclico, 1 gota de
anilina y unos 15 mg de cido en 1 ml de CHCl3. Etiquetar bien los tubos para no confundirlos.
2. Preparar una placa de forma semejante al apartado anterior y aplicar las cinco disoluciones, cada una en un lugar
diferente.
3. Trasvasar la cmara cromatogrfica utilizando como eluyente una mezcla de Hexano: Acetato de etilo, 4: 1 y realizar la
cromatografa.
4. Revelar el cromatograma con la ayuda de la lmpara UV, rodeando el contorno de cada una de las manchas. Ordenar los
compuestos en orden de Rf creciente.
5. Observa la estructura qumica de cada uno de los compuestos y razona el orden de Rf obtenido relacionndolo con la
polaridad de los diferentes grupos funcionales.

Compuesto

6.
7.

Rf (Hex: AcOEt, 4:1)

Utilizando nicamente alcohol benclico realiza cromatografas utilizando como eluyentes las siguientes mezclas: Hexano
puro; Hexano: Acetato de etilo, 10: 1; Hexano, Acetato de etilo, 1:5; Hexano, Acetato de etilo, 1: 1.
Calcula los Rf en cada caso y compara los resultados de las distintas cromatografas.

Eluyente
Hexano
Hex: AcOEt, (10:1)
Hex: AcOEt (1:1)
Hex: AcOEt (1:5)

Rf (Alcohol benclico)

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Diagrama de Secuencia Experimental Ecolgica:

Cromatografa en capa fina

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Desarrollo Experimental para Cromatografa

en Columna
A. Cromatografa de Carotenos
1.
2.

Lavar las hojas de espinacas, retirar los nervios y ponerlas en un mortero, junto con el alcohol etlico y una pequea
cantidad de carbonato clcico (que evita la degradacin de los pigmentos fotosintticos.
Triturar la mezcla hasta que las hojas se decoloren y el disolvente adquiera un color verde intenso (Fotografa 1)

3.

Filtrar con un embudo y gasa, 2 veces. (Fotografa 2)

4.

Colocar la columna para cromatografa con una pinza universal o con una pinza para bureta e
introducirle por medio de un agitador, un trozo muy pequeo de algodn hasta la base de la misma.

5.

Empacar la columna con slica gel adicionando por la parte superior una suspensin de 1 g de slica gel
en una mezcla de hexano: Acetato de etilo 1:1 manteniendo un goteo uniforme en la llave de salida
del disolvente durante todo el procedimiento.

6.

Agregar un poco de sulfato de sodio anhidro, como agente desecante. Verter el eluyente.

7.

Dejar gotear el disolvente y esperar hasta que el disolvente quede ligeramente arriba de la fase
estacionaria, depositar sobre el papel filtro 1 mL del concentrado de espinacas con ayuda de una
pipeta graduada, cuidando de no derramarlo por las paredes de la columna, nunca permitir que el
nivel del disolvente baje ms all de la superficie de la slice, ya que sta se agrietara y no permitira
un desarrollo homogneo).

8.

Mantener el goteo hasta que los pigmentos penetren en la slice y llenar lentamente la columna con la mezcla de hexanoacetato de etilo 1:1.

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9.

Volver a abrir la llave para permitir el desarrollo del cromatograma, manteniendo constante el volumen del eluyente.

10. Recoger la primera fraccin colorida en tubos de ensayo numerados y cubiertos con papel aluminio.
11. Cuando termine de eluir esta primera fraccin, cambiar el eluyente a acetato de etilo: metanol 1:1 y recoger la siguiente
fraccin en tubos de ensayo numerados y cubiertos con papel aluminio.
12. Observe las diferentes coloraciones e investigue posteriormente cules son los pigmentos vegetales que contiene la
muestra y dicha informacin inclyala en su reporte.

C. Cromatografa de Colorantes Artificiales y Caramelos

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

8.
9.

Mismo procedimiento que el anterior para el llenado de la columna.

Si son caramelos, disuelve cada uno por separado en una pequea cantidad de agua hasta obtener una solucin coloreada.
Pesar 0.5 g de colorante artificial. Para empacar la columna sujtela en el soporte con las pinzas.
Introduzca hasta el fondo un pequeo pedazo de algodn ayudndose con la varilla de vidrio,
agregue 10 mL de eluyente (nota 1) y presione suavemente el algodn para que quede bien colocado y sin burbujas (nota
2).
Prepare una suspensin de 10 g de slica gel para columna en 50 mL de eluyente y agite por 5 minutos hasta eliminar las
burbujas de aire.
A travs del embudo de vidrio vierta la suspensin en la columna golpeando ligeramente con los dedos para que el
empacado sea uniforme.
Abra la llave para eliminar el exceso de disolvente teniendo cuidado de no dejar la slica gel sin disolvente (nota 3). En un
vaso de precipitado de 150 mL disuelva la mezcla problema con la mnima cantidad de eluyente (5 mL), ayudndose con el
agitador, virtala con cuidado para que quede distribuida uniformemente encima de la superficie de la slica.
Abra la llave para colectar el disolvente y se adsorba la muestra aplicada (cuidando que no se seque la columna),
inmediatamente inicie la elusin. eluya a muestra.
Colecte las fracciones de los diferentes pigmentos de la muestra problema en los frascos viales.

Notas:

(1)

Otra opcin para preparar la columna es, agregando 10 mL de eluyente indicado y despus colocar en el fondo de la columna un
pedazo de algodn o fibra de vidrio ayudndose con la varilla de vidrio presionando suavemente sin apretar el algodn.
(2) Mantenga siempre el nivel del eluyente 0.5 cm por arriba del nivel del adsorbente.
(3) Para aplicar las muestras a la cromatoplaca utilice los capilares, los que previamente deben ser estirados en la flama del mechero con el
fin de que tengan el dimetro adecuado.

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Diagrama de Secuencia Experimental Ecolgica:

Cromatografa en columna

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Aprende haciendo:

Actividades, Resultados, Cuestionario e Informe

a)-Por qu el producto principal eluy y el colorante se adsorbi en la fase estacionaria?

b) S se desea recuperar el colorante adsorbido, qu debe hacerse?

c) Qu debe hacerse para encontrar el eluyente adecuado para una sustancia en una cromatografa en columna?

d) La recuperacin cuantitativa del producto principal, sera ms completa s se recogieran fracciones mayores o menores de 10 ml
por qu?

e) Qu tratamiento debe darse a residuos de disolvente orgnico como Acetato de Etilo, para desecharlos?

f) Es recuperable la gel de slice para columna? Indique algunas de las aplicaciones de la cromatografa de adsorcin en columna y
capa fina.

g) Escriba una lista de eluyentes utilizados en cromatografa en columna en orden de polaridad decreciente (anote su bibliografa).

h) Cul es la diferencia entre la cromatografa en capa fina y la cromatografa en papel.

i) Indique la toxicidad de las sustancias que utiliz y como se podran desechar.

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i) Qu pigmentos adems de los carotenos puede encontrase en la muestras que se trabajaron?

j) Cules son los nombres comerciales de los colorantes que se utilizaron en la prctica en la parte de caramelos y colorantes
alimenticos?

k) Escriba la ficha bibliogrfica completa de 5 libros de cromatografa en capa fina y columna (tcnica y teora) especializada.

Gua de estudio: El alumno necesita tener los siguientes antecedentes acadmicos para realizar la
prctica:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.

Investigar el concepto de cromatografa, as como su clasificacin.

Qu es una cromatografa de absorcin y de particin? D ejemplos de cada uno.
Qu son los fenmenos de reparto o particin?
Defina al coeficiente de reparto, factor de retencin el Rf
Cules son las caractersticas de la ccf, as como sus aplicaciones?
Cules son los eluyentes, absorbentes y reveladores ms comunes para ccf?
Explique los factores que influyen en una separacin por cromatografa de capa fina.
Defina los siguientes conceptos: Eluyente, eluato, eluir.
Cmo se realiza la seleccin de los eluyentes para separar mezclas de compuestos por cromatografa en columna?
Cules son las tcnicas de separacin cromatogrfica por elucin, adsorcin y desplazamiento?
Diga cules son los eluyentes y adsorbentes para cromatografa en columna y capa fina? Y los factores que influyen en la separacin por
cromatografa.
12. Investigue los componentes de cada una de las muestras que va a trabajar, as como las propiedades de inters para esta prctica de los
reactivos a utilizar.

Referencias de Consulta Sugeridas

1)
Clement B. Organic Chemistry Laboratory Manual. Texas A&M University, USA, 2002.Pag. 143-146
2) Hammond C. Experimental Organic Techniques. Freeman & Co. USA, 1999
3)
Ault A. Techniques and Experiments for Organic Chemistry. University Science Books. USA 1998 Pag.113-121
4) Roberts R.M. Modern Experimental Organic Chemistry. 3rd. Ed. Holt. Rinehart Winston, N.Y., 1979
5) Abbot D. y Andrews R.S. Introduccin a la Cromatografa. 3a. Ed. Alhambra, Madrid, 1970.
6) Avila. Qumica Orgnica: experimentos con un enfoque ecolgico. UNAM, 2000
7) Moore J.A. and Dalrymple D.L.Experimental Methods in Organica Chemistry Second Edition, W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1976.
8) Roberts R.M., Gilbert J.C. and Rodewald L.B. Modern Experimental Organic Chemistry, Third Edition,
9) Holt, Rinehart and Winston, N.Y. 1979.
10) Abbott D. y Andrews R.S. Introduccin a la Cromatografa 3a. Ed. Alhambra S.A., Madrid, 1970.
11) Brewster R. Q., van der Wert C. A., McEwen W. E., Curso Prctico de Qumica Orgnica, 2 ed., Madrid, Alhambra, 1979.
12) Miranda, R. Hernndez, E. Tcnicas bsicas para la experimentacin en qumica orgnica, Mxico, FESC-UNAM, 2004.

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