INFORME #1

ESPECTROFOTOMETRÍA Y DILUCIONES

INTEGRANTES:
DANIEL ALBERTO GOMEZ VERGARA - 01210172024
VIRLEY DAYANNA PORRAS JAIMES - 01210172018
KAREN YULIETH RANGEL GONZALEZ - 01210172028
YINETH ALEXANDRA GONZALEZ - 01210171056

BIOQUIMICA 1

DOCENTE:
GLADYS MERCEDES GONZÁLEZ SEDANO

BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO

FECHA:
06/09/2022

UNIVERSIDAD DE SANTANDER - UDES

BUCARAMANGA
 ESPECTROFOTOMETRÍA Y DILUCIONES

OBJETIVOS:

❖ Adquirir destrezas en el manejo de las fórmulas de dilución.

❖ Analizar la relación directa que existe entre la concentración de una sustancia y la
absorbancia.
❖ Reconocer los espectros de absorción y emisión.
❖ Reconocer las partes y funciones del espectrofotómetro.
❖ Entender la utilidad de la espectrofotometría para analizar moléculas con grupos
cromóforos.

INTRODUCCIÓN:

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones

biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación
absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y
una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

La absorción de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de

las moléculas, y es característica para cada sustancia química; cuando la luz atraviesa una
sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún
efecto sin ser absorbida.

El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz
blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda
no absorbidas.

La espectrofotometría proveniente del sol, es decir la radiación ultravioleta-visible usa haces

del espectro electromagnético y radiaciones del campo UV de 80 a 400 nm, principalmente
de 200 a 400 nm y usa haces de luz visible de 400 a 800 nm , por lo que es de gran utilidad
para caracterizar las soluciones en la región ultravioleta y visible del espectro.

Valores de absorbancia mayores de 2 no son confiables porque muy poca luz está alcanzando
el detector para permitir mediciones acertadas. Cuando la medición de absorbancia es mayor
a 2 se diluye adecuadamente la muestra.
METODOLOGÍA:

RESULTADOS:

1. ESPECTRO DE ABSORCIÓN:

Resultados obtenidos empleando permanganato de potasio como muestra, para la observación

del espectro de absorción.

Las cubetas se dan en el espectrofotómetro con diferentes longitudes de onda, para medir el
nivel de absorbancia de la muestra según la onda que pudiera traspasar a través de la misma
Longitud de Absorbancia Longitud de Absorbancia Longitud Absorbancia
onda onda de onda
(nm) (nm) (nm)

420 0,026 510 0,721 580 0,277

430 0,030 515 0,747 590 0,121

440 0,046 520 0,827 600 0,092

450 0,052 525 0,941 610 0,078

460 0,127 530 0,906 620 0,072

470 0,205 540 0,851 630 0,066

480 0,288 550 0,826 640 0,062

490 0,440 560 0,545 650 0,053

500 0,590 570 0,501 660 0,044

Tabla 1. Determinación del espectro de absorción del Permanganato de potasio(KMnO4)

Figura 1. representación de los valores de la tabla 1.

La máxima absorbancia es de 0,941 de la longitud de onda 525 nm, el cual esto quiere decir
que cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslúcido, una parte de esta luz es absorbida
por el cuerpo, y el haz de luz restante atraviesa dicho cuerpo, es decir, a mayor cantidad de
luz absorbida, mayor será la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de luz será transmitida
por dicho cuerpo. También se dice que en esta longitud de onda es la absorbancia máxima del
permanganato de potasio, por lo tanto ahora las absorbancias serán proporcionales a la
concentración del analito, cumpliéndo así la ley de Lambert Beer. Por medio de una regresión
lineal se pudo calcular el coeficiente de absorción molar que corresponde a la pendiente de la
gráfica obtenida.
Nota: estos valores son sacados de la web el cual nos ayuda a entender los valores de la
longitud de onda y absorbancia.

2. CURVA DE CALIBRACIÓN: azul de metileno

a: cálculos de soluciones (50/100/150/200 ppm)

se preparan 25 ML de una solución de azul de metileno a una solución de 50 ppm
a partir de una solución de 100 ppm

v1: ? v1:50ppmx25ml
c1:200 ppm 200ppm
v2:25 ml v1:6,25 ppm
c2:50 ppm

se preparan 25 ML de una solución de azul de metileno a una solución de 100

ppm a partir de una solución de 200 ppm

v1: ? v1:100 ppm 25ml

c1:200 ppm 200ppm
v2:25 ml v1:12,5 ppm
c2:100 ppm

se preparan 25 ML de una solución de azul de metileno a una solución de 150

ppm a partir de una solución de 200 ppm

v1: ? v1:100 ppm 25 ml

c1:200 ppm 200ppm
v2:25 ml v1:18,75 ppm
c2:150 ppm

se preparan 25 ML de una solución de azul de metileno a una solución de 200

ppm a partir de una solución de 200 ppm

v1: ? v1:200 ppm 25 ml

c1:200 ppm 200ppm
v2:25 ml v1: 25 ppm
c2:200 ppm
Concentraciones Longitud de Absorbancia %Transmitancia
onda (nm)

50 ppm 620 Nm 2,386 0,41%

100 ppm 620 Nm 3,287 0,020%

150 ppm 620 Nm 3,691 0,041%

200 ppm 620 Nm 3,921 0,057%

Tabla 2. mediciones del espectrofotómetro

Fórmula de la transmitancia:
%Transmitancia =
A=2- log (0,41%)= 2,39%
A=2- log (0,020%)= 3,70%
A=2- log (0,051%)= 3,29%
A=2- log (0,047%)= 3,33%
 Figura 2. valores de transmitancia.

En la figura 2 se observan valores diferentes a los trabajados antes, en esta figura se muestra
valores que se deberían dar para que la transmitancia se pueda leer de una manera correcta.
ANALISIS Y DISCUSION:

ESPECTRO DE ABSORCIÓN: Espectro que presenta una secuencia de frecuencias, en un

intervalo relativamente ancho, correspondientes a los fotones absorbidos por una sustancia,
generalmente representando el coeficiente de absorción en función de la frecuencia o longitud
de onda. =⇒ A nivel molecular, el sistema sufre una transición de un estado de (menor)
energía En a una de (mayor) energía Em, gracias a la energía del fotón (hν):

A(En) + hν → A ⋆(Em).

UTILIDAD
Se refiere a una variedad de técnicas que emplean la interacción de la radiación
electromagnética con la materia. En la espectrometría de absorción, se compara la intensidad
de un haz de luz medida antes y después de la interacción con una muestra. Las palabras
transmisión y remisión se refieren a la dirección de viaje de los haces de luz medidos antes y
después de la absorción. Las descripciones experimentales por lo general asumen que hay una
única dirección de incidencia de la luz sobre la muestra, y que un plano perpendicular a esta
dirección pasa por la muestra.
LUZ VISIBLE
La luz es constituida por partículas energéticas, llamadas fotones, que poseen una cantidad de
energía específica y correspondiente a una determinada frecuencia o longitud de onda,
medido en nanómetros (nm).
La luz visible al ojo humano comprende la gama de longitudes de onda entre los 380 nm y los
720 nm y es apenas una pequeña parte del espectro electromagnético, también constituido por
una amplia gama de radiaciones que nuestros ojos no consiguen detectar (Ultravioletas,
Infrarrojos, Rayos X, etc.) (Fig. 1).

ABSORCIÓN Y ESPECTRO DE ABSORCIÓN

Cuando todas las longitudes de onda que constituyen la luz visible están presentes, la luz
aparece blanca. El color presentado por un determinado compuesto u objeto es determinado
por las longitudes de onda de la luz blanca que ésta absorbe.
De un modo simplificado, un compuesto que aparece azul transmite o refleja la luz azul y
absorbe los restantes colores del espectro de la luz visible. Por otro lado, el color presentado
también puede ser debido a una elevada absorción de luz en la gama de su color
“complementario”. Siendo así, una elevada absorción de fotones “rojo”, hace que el
compuesto aparezca verde a nuestros ojos. El círculo cromático (Fig. 2) permite visualizar la
complementariedad entre las longitudes de onda absorbidos y las longitudes de ondas
transmitidas y reflejadas.

Figura 2. Círculo cromático simplificado

•La región ultravioleta comprende entre 10 y 400 nm y la región visible comprende entre 350
y 750 nm.
•Las radiaciones UV y visible tienen en común el hecho de que la absorción de ambas
regiones por moléculas, provoca la excitación de e- de enlace a niveles de E superiores.
•Los picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos de enlaces de la especie
absorbente, base de su aplicación cualitativa

- Un espectro de absorción es una representación gráfica de la absorbancia de un

analito (o de otra magnitud equivalente) en función de la longitud de onda de la
radiación λ (o de otro parámetro relacionado con la energía de la radiación utilizada).
- El máximo de absorbancia obtenido en el espectro de absorción de un analito, nos
dará la longitud de onda que proporciona la mayor sensibilidad posible, y por tanto
será la que se utilizará en el análisis espectrofotométrico de dicho analito.
 LEY DE BOUGUER-LAMBERT-BEER
se conoce también como ley de Beer-Lambert-Bouguer y fue descubierta de formas
diferentes e independientes en primer lugar por el matemático y astrónomo francés Pierre
Bouguer en 1729 ́Luego por el filósofo y matemático alemán, Johann Heinrich Lambert en
1760 y por último el físico y matemático también alemán, August Beer en el año 1852. Se
puede decir que esta ley se trata de un medio o método matemático, el cual es utilizado para
expresar de qué modo la materia absorbe la luz. En óptica (Rama de la física que se encarga
del estudio de la luz) La ley de Beer afirma que la totalidad de luz que emana de una muestra
puede disminuir debido a tres fenómenos de la física, que serían los siguientes:
1. El número de materiales de absorción en su trayectoria, lo cual se denomina concentración.
2. Las distancias que la luz debe atravesar a través de las muestras. Denominamos a este
fenómeno, distancia del trayecto óptico.
3. Las probabilidades que hay de que el fotón de esa amplitud particular de onda pueda
absorberse por el material. Esto es la absorbencia o también coeficiente de extinción.
La relación anterior puede ser expresada de la siguiente manera:
A = - εcd
Donde, A = Absorbancia
ε = Coeficiente molar de extinción
d = Recorrido (en cm)
c = Concentración molar

A medida que la luz atraviesa un medio que la absorbe, la cantidad de luz absorbida en
cualquier volumen corresponde a la intensidad de luz que incide, luego se multiplica por el
coeficiente de la absorción. Frecuentemente la intensidad de un haz de luz incidente declina
significativamente a medida que pasa a través del medio absorbente.
Cuando esta relación se expresa como Ley de BOUGUER LAMBERT-BEER,
tenemos que:

Donde, T = Transmitancia
ε = Coeficiente molar de extinción
c = Concentración molar del absorbente
d = Recorrido en cm
La transmitancia se puede expresar como la intensidad de la radiación incidente, Io. Esto
puede dividir a la luz que emerge de la muestra, I. Se refiere a la relación I/Io como
transmitancia o como T.

unificando estas dos leyes se obtiene la ley fundamental que rige la absorción de todos los
tipos de radiación electromagnética, aplicable a disoluciones y también a gases y sólidos. Nos
dice que la absorbancia de radiación electromagnética producida por una especie absorbente
es directamente proporcional a la trayectoria de la radiación a través de la disolución y a la
concentración en ésta de la sustancia que produce la absorción.
A=a b c
log (P0 /P)=a b c=-log(P/P0 )=-log T
P/P 0 =10 -a b c

a=constante de proporcionalidad, absortividad, es una propiedad intensiva de la materia y por

tanto relacionada únicamente con la naturaleza de la misma. b=trayectoria de la radiación a
través de la muestra (cm)
c=concentración (g/l) , entonces a tiene unidades de l·g-1 ·cm -1

La absortividad pasa a denominarse absortividad molar y se expresa con el símbolo ε, cuando

la concentración está en (moles/litro) y b en (cm), siendo sus unidades l·mol-1 ·cm -1.

Recta de calibrado: La ley de Lambert-Beer permite la determinación de concentraciones de

disoluciones problema, a partir de una recta de calibrado obtenida midiendo las absorbancias
de disoluciones patrón de concentraciones conocidas. Para hacer las determinaciones
cuantitativas se elige, en general, la longitud de onda correspondiente a un máximo, pues el
error de medición es mínimo y la sensibilidad máxima. Si es válida la ley de Beer para esa
sustancia a esas concentraciones, la relación debe ser una recta que pase por el origen de los
ejes cartesianos. A menudo se observan desviaciones debidas a diversos factores.
Limitaciones de la ley de Lambert-Beer: No se conocen excepciones a la generalización de
que la absorbancia está relacionada linealmente a la longitud del camino óptico. En cambio,
las desviaciones de la proporcionalidad directa entre la absorbancia medida y la
concentración, para b constante, son más frecuentes. Algunas de estas desviaciones son tan
fundamentales que representan limitaciones reales de la ley, otras ocurren como una
consecuencia de la manera en que se hacen las mediciones de absorbancia (desviaciones
instrumentales), o como un resultado de cambios químicos asociados con cambios en la
concentración(desviaciones químicas). A continuación se describen los principales factores
que limitan la aplicabilidad de la ley de Beer.

♦ La concentración. Sólo es aplicable a disoluciones diluidas (<10 -2 M); en disoluciones

concentradas la distancia entre partículas absorbentes es tan pequeña que se produce una
modificación en la distribución de cargas de las mismas, lo que se traduce en una alteración
en la capacidad de absorción a una longitud de onda determinada. Este efecto se puede
eliminar mediante dilución.
♦ Desviaciones instrumentales por el uso de radiación no monocromática, puesto que la
ley está definida para radiaciones con una sola longitud de onda. Sin embargo, si la calidad
del equipo no es buena, se obtienen bandas de radiaciones con un estrecho intervalo de
longitudes de onda. También provoca desviaciones la presencia de radiación dispersa.
♦ Falta de uniformidad de la muestra o especie absorbente, o presencia de impurezas.
♦ Desviaciones químicas, debidas a reacciones del absorbente con el disolvente, como en el
caso del dicromato en disoluciones no amortiguadas. Para cualquier longitud de onda la
absortividad molar del ion dicromato y del cromato son muy diferentes, de modo que la
absorbancia total depende de la razón de concentraciones entre las formas diméricas y
monoméricas. Esta razón cambia notablemente con la dilución y provoca una desviación de
la linealidad entre la absorbancia y la concentración total de cromo(VI).

CONCLUSIONES:

De esta práctica de laboratorio sabemos que para lograr resultados precisos y óptimos es
necesario que los equipos e instrumentos son vitales para desarrollar esta práctica, para
nuestro equipo no fue posible el correcto desarrollo de la práctica debido a que el instrumento
no tomó la medición, sin embargo podemos obtener resultados a través de la teoría, podemos
también concluir que el análisis instrumental nos permite determinar la concentración de una
muestra, para obtener correctamente la concentración debemos hacer correctamente el
manejo de cifras significativas y un correcto análisis de los datos suministrados para lograr
resultados verídicos y exactos, también empleando los factores y métodos de las diluciones se
pueden tener absorbancias y ser registradas en el equipo para determinar correctamente la
concentración sin errores.

BIBLIOGRAFÍAS:

● https://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/transmitancia-y-absorbancia

● https://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/23438/1/QCE_GradoQuimica_Apuntes
_Tema10.pdf

● https://knoow.net/es/ciencias-tierra-vida/biologia-es/espectro-de-absorcion/

● https://www.uv.mx/personal/aherrera/files/2014/05/L.-Ley-de-Bouguer-Lambert-
Beer-0.pdf

● https://www.upct.es/~minaeees/espectro_electromagnetico.pdf