UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO

FACULTAD DE QUÍMICA
ACADEMIA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

NOMBRE DE LA ASIGNATURA: Microbiología

SEMESTRE: Tercero
CLAVE: BA-12
ÁREA DE CONOCIMIENTO: Ciencias Básicas
ASIGNATURAS PRECEDENTES: Ninguna
ASIGNATURA SUBSECUENTE: Ninguna
HORAS POR SEMANA: 4 horas laboratorio
CREDITOS:
INTRODUCCIÓN

El estudio de la Microbiología requiere indudablemente de una interacción entre la

teoría y la práctica. El laboratorio complementa y fortalece la adquisición de
conocimientos que se obtienen al estudiar la parte teórica de esta ciencia, es por esto
que en este manual se describen algunas de las herramientas básicas para el estudio
de los procesos vitales de los microorganismos. Estas herramientas ayudaran al
alumno a enfrentar los problemas prácticos en los campos de acción de la
biotecnología.
Este manual consiste en una serie de prácticas de laboratorio que ayudan al
estudiante a aplicar los conocimientos previos para formarse un criterio propio acerca
del estudio de los microorganismos.

OBJETIVOS
El laboratorio de Microbiología tiene como objetivo que los estudiantes realicen
prácticas de laboratorio que los pongan en contacto con los conceptos aprendidos en la
teoría y que analicen los avances en la materia con la lectura de artículos relacionados
a los tópicos estudiados, para impulsar a los estudiantes en la formación de criterios
propios que puedan servir de base para un trabajo independiente.

i
 ÍNDICE
Introducción i
Objetivos i
Índice ii
Práctica 1: Preparación de medios de cultivo y técnicas para manipular
microorganismos 1
Práctica 2: Técnica aséptica de manejo de microorganismos 5
Práctica 3: Cultivo y estudio de hongos 8
Práctica 4: Recuento microscópico de células 11
Práctica 5: Recuento de células viables 15
Práctica 6: Recuento de Bacterias Mesófilas Aerobias (BMA) 18
Práctica 7: Recuento de células viables por el método del Numero Más Probable
(NMP) 21
Práctica 8: Metabolismo y nutrición microbiana 24
Práctica 9: Influencia de los factores físicos sobre el desarrollo de los
microorganismos 27
Práctica 10: Influencia de los factores químicos sobre el desarrollo de los
microorganismos 31

ii
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QUERETARO
FACULTAD DE QUÍMICA

LABORATORIO DE CLAVE
MICROBIOLOGÍA

LICENCIATURA DE
BIOTECNOLOGÍA

Nombre de la practica:
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE Practica: Paginas:
CULTIVO Y TÉCNICAS PARA 1
MANIPULAR MICROORGANISMOS
Realizó: Autorizó:
QA. Rodrigo Jiménez Pichardo Dra. Blanca García Almendárez
Fecha de realización: Fecha de entrega:

INTRODUCCIÓN:
Los principios de la técnica aséptica como la manipulación de microorganismos y
medios estériles fueron iniciados por Pasteur, involucra fundamentalmente el uso del
calor para eliminar los contaminantes. Koch fue quien se dio cuenta de la importancia
de los cultivos puros, y desarrollo el método para aislar colonias. Un cultivo puro
consiste en un solo tipo de microorganismo.
Un medio de cultivo es el soporte (líquido, semisólido o solido), sobre el cual se da el
crecimiento de los microorganismos. Este medio de cultivo ofrece los macro y
micronutrientes necesarios para el desarrollo, los macronutrientes son carbono,
nitrógeno, fosforo, azufre y minerales. Dentro de los micronutrientes, llamados así por
la baja concentración en que son necesarios, se encuentran los requerimientos
específicos para cada microorganismo como cobalto, hierro, níquel, entre otros. Otros
componentes importantes son los factores de crecimiento, que son compuestos que no
son sintetizados por los microorganismos y son necesarios como algunas vitaminas,
aminoácidos, entre otros. Si se tiene la composición exacta del medio de cultivo se
habla de un medio definido, por el contrario si se utilizan extractos de plantas o
animales se trata de un medio de cultivo complejo o indefinido, ya que no se sabe la
composición exacta de los ingredientes.
La adición de un agente solidificante, como el agar, es la diferencia entre un medio
líquido y uno semisólido o solido. Este agente es muy utilizado ya que no tiene un valor

1
nutritivo para la mayoría de los microorganismos, además de que la temperatura de
fusión y solidificación son apropiadas para el uso dentro del laboratorio. Dado que cada
tipo de medio presenta ventajas y desventajas sobre los otros es importante elegir
correctamente el que se utilizará.
Si se agrega a los medios de cultivo componentes específicos como antibióticos,
fuentes de carbono o nitrógeno complejas, indicadores de pH, entre otros, con el fin de
aprovechar características metabólicas específicas del microorganismo se tiene una
gran gama medios de cultivo que facilitan la identificación o purificación de
microorganismos.
Antes de utilizar un medio de cultivo es necesario esterilizarlo, para eliminar los
microorganismos presentes que pudieran interferir en el estudio. Generalmente se
utiliza el método de esterilización por calor húmedo, si se esteriliza material seco
entonces utilizamos la estufa.

OBJETIVOS:
El objetivo de esta práctica es entender los principios de la técnica aséptica para
manipular los microorganismos.
Ejercicio 1:
• Establecer los fundamentos para la preparación de medios de cultivo
• Diferenciar entre los tipos de medio de cultivo y sus usos
• Preparar un medio de cultivo y aprender los principios del proceso de
esterilización
Ejercicio 2
• Inoculación de un medio de cultivo en tubo de agar inclinado
• Transferir un cultivo de un medio de cultivo líquido a otro tubo
• Extender un cultivo bacteriano sobre la superficie de un medio sólido, para
obtener colonias separadas

MATERIALES Y EQUIPO:
Plancha caliente con Asa bacteriológica e hisopo
Probeta de 250 mL
agitación estéril
Agitador magnético
Cajas Petri Papel aluminio
(mosca)
Matraz Erlenmeyer de Agar y Caldo Soya-
Cinta masking
500mL Tripticaseina (AST)
Autoclave u Olla, mechero
Balanza Cinta testigo
y base para olla
Espátula Mechero Agua destilada
5 viales con 10 mL
Potenciómetro Torunda de algodón
Solución salina 0.85%
Tubos de ensaye 15x150
Pipeta graduada de 10 mL Propipeta o jeringa
con tapa de rosca

2
METODOLOGÍA:

1. Pesar la cantidad necesaria de medio de cultivo para preparar 250 mL de Agar

Soya-Tripticaseina (AST) y colocar en el matraz.
2. Medir 250 mL de agua destilada en la probeta y verterla en el matraz Erlenmeyer
3. Colocar el matraz Erlenmeyer en la plancha caliente y agitar con ayuda del
agitador magnético
4. Pesar la cantidad necesaria de medio de cultivo para preparar 25 mL de caldo
Soya-Tripticaseina
5. Ajustar el pH según indicaciones del medio de cultivo, en el caso del caldo vaciar
en tubos de vidrio con rosca y colocarlos directamente en la olla.
6. Calentar el medio de cultivo con agar hasta ebullición
7. Retirar el matraz Erlenmeyer de la plancha y retirarle el agitador magnético
8. Verter 5 mL en tubos de vidrio con rosca, o a la mitad del volumen, uno por
equipo.
9. Tapar el matraz Erlenmeyer con una torunda y papel aluminio
10. Colocar dentro de la autoclave el matraz Erlenmeyer con el medio de cultivo,
la solución salina, los tubos y las cajas Petri selladas.
11. Esterilizar a 121°C o 15 lb/in2 por 15 minutos
12. Trascurrido el tiempo liberar la presión de la autoclave y abrir cuando el
manómetro este en cero
13. Enfriar el medio de cultivo sin retirar el tapón
14. En la zona aséptica vaciar 15 mL de medio en las caja Petri, previamente
rotuladas
15. Esperar a que solidifique el medio y tapar las cajas
16. El medio de cultivo con agar en el tubo inclinarlos aún caliente, para obtener un
medio sólido inclinado.
17. Inocular con el asa estéril el tubo inclinado con el cultivo bacteriano previsto,
18. Con el hisopo ligeramente humedecido en la solución salina tomar una
muestra ambiental e inocular una caja Petri.
19. Transferir el cultivo al tubo con caldo de manera aséptica
20. Esparcir un cultivo sobre la superficie de un medio sólido para obtener colonias
asiladas.
21. Incubar las cajas Petri a 30°C por 24 horas
22. Limpiar la autoclave o la olla.

3
RESULTADOS:
Calificar con 1 o cero, cada placa si has obtenido calificación de 5 en alguna, sabes
manejar adecuadamente los microorganismos.

OBSERVACIÓN CAJA UNO CAJA DOS (MANO)

1. Patrón adecuado de aislamiento
2. No más de una incisión en el agar
3. Presencia de al menos 10 colonias
aisladas
4. Ausencia de contaminantes aéreos.
5. Reconocimiento de cultivo puro

PREGUNTAS
1. Principales fuentes de carbono y nitrógeno empleadas en los medios de cultivo
2. Ventajas y desventajas de los tipos de medio de cultivo
3. Cantidad de agar utilizado en un medio semisólido y uno sólido
4. Clasificación de los medios de los tipos cultivo en cuanto a su función
5. Tipos y condiciones de esterilización
6. Técnica aséptica para manejo de microorganismos.
7. Métodos para evitar aerosoles.

BIBLIOGRAFÍA:

Becker Jeffrey M., Caldwell Guy A., Zachgo Eve Ann., 1996. Biotechnology: A
Laboratory Course, 2da edición, editorial Academic Press, UK.
Madigan Michael T., Martinko John M., Parker Jack, traducción Gacto Fernandez M., y
otros, 2003. Biología de los Microorganismos, 10ma edición, editorial Pearson,
España.
Tortora Gerard J., Funke Berdell R., Case Christrine L., traducción Rondinone Silvia y
otros, 2007. Introducción a la Microbiología, 9na edición, editorial
Panamericana, Argentina.

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QUERETARO
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LABORATORIO DE CLAVE
MICROBIOLOGÍA

LICENCIATURA DE
BIOTECNOLOGÍA

Nombre de la practica:
Practica: Paginas:
TÉCNICA ASEPTICA DE MANEJO DE
2
MICROORGANISMOS
Realizó: Autorizó:
QA. Rodrigo Jiménez Pichardo Dra. Blanca García Almendárez
Fecha de realización: Fecha de entrega:

INTRODUCCIÓN:
Uno de los puntos más importantes en el estudio de los microorganismos es el
trabajar con cultivos puros, es decir que solo se encuentre una especie en el medio de
cultivo. La pureza de los cultivos se puede verificar realizando una trasferencia a una
placa con medio solido, le presencia de colonias con una misma morfología es un
indicativo de que se está trabajando un cultivo puro.
Para asegurar esta pureza se ha desarrollado una técnica mediante la cual se
transfieren microorganismos a diferentes medios de cultivo, con ayuda de un asa
bacteriológica, con la finalidad de obtener colonias aisladas. A esta técnica se le
denomina Técnica Aséptica, la cual consiste en una serie de procedimientos que
evitan la contaminación durante la manipulación de los cultivos. Otra herramienta
importante es el microscopio y las técnicas de coloración de células. Este conjunto de
técnicas y herramientas se han utilizado con buenos resultados, aunque requieren de
mucha practica.
Los cuidados que hay que tener para disminuir los posibles contaminantes son:
Limpiar y desinfectar la zona de trabajo, trabajar con instrumentos estériles, trabajar
dentro de la campana de flujo laminar o cerca de la flama del mechero, además de
realizar el trabajo lo más rápido posible para minimizar el tiempo de exposición a los
posibles contaminantes.

OBJETIVOS:
• Manipular adecuadamente los cultivos puros

5
 • Establecer los principios de la técnica aséptica
• Identificar y describir las características microscópicas de algunas bacterias
• Realizar una tinción diferencial de microorganismos

MATERIALES Y EQUIPO:
Cinta testigo
Probeta de 250 mL
Plancha caliente con
agitación
Mechero
Cajas Petri
Asa microbiológica
Porta objetos
Torunda de algodón
Cinta masking Propipeta o jeringa
Tubos de ensaye 15x150
Espátula
con tapa de rosca
Matras erlenmeyer de 500
Agitador magnético
y 250 mL
Vaso de precipitados de
Microscopio
100mL
Colorantes para tinción de
Gradilla
Gram
Piceta con agua destilada Pinzas
Agar Soya Tripticaseina Caldo Soya Tripticaseina
Pipeta de 10 mL Propipeta o jeringa

METODOLOGÍA:
1. Preparar el agar y caldo soya tripticaseina
2. Verter 5 mL en tubos de vidrio con rosca, o a la mitad del volumen, uno por
equipo.
3. Esterilizar el material
4. Enfriar los medios de cultivo
5. Vaciar 15 mL de agar en cajas Petri dentro de la zona aséptica
6. Esperar a que solidifique el medio y tapar las cajas
7. Inclinar los tubos con medio de cultivo con agar aún caliente, para obtener un
medio sólido inclinado
8. Tomar una asada del cultivo proporcionado e inocular el tubo inclinado y la caja
Petri para obtener colonias aisladas. Existen varios patrones para el asilamiento
de colonias. Recordar rotular primero en la base de la caja el nombre dl
microorganismo, fecha y su nombre. Colocar cerca del mechero. Aflojar la rosca
del tubo que contiene el cultivo. Esterilizar el asa y permitir que se enfrié tomar
una pequeña cantidad el cultivo. Extender el cultivo en una dirección con líneas
muy cercanas. Volver a esterilizar el asa y tomar de un extremo para cambiar
de dirección. Posicionar la caja en ángulo para observar la luz incidente y evitar
volver a tocar la extensión previa.
9. Incubar las cajas Petri a 30°C por 24 horas
10. Registrar las características morfológicas de las colonias
11. Realizar una tinción de Gram de alguna colonia aislada de la caja.
12. Observar las muestras bajo el microscopio
13. Registrar las observaciones

6
RESULTADOS:
Calificar con 1 o cero, cada placa si has obtenido calificación de 5 en alguna,
sabes manejar adecuadamente los microorganismos.

OBSERVACIÓN CAJA UNO CAJA DOS

6. Patrón adecuado de aislamiento
7. No más de una incisión en el agar
8. Presencia de al menos 10 colonias
aisladas
9. Ausencia de contaminantes aéreos.
10. Reconocimiento de cultivo puro

Ilustrar con detalle las observaciones al microscopio:

FECHA:
MUESTRA:
TINCIÓN:
AUMENTO:
DESCRIPCIÓN:

PREGUNTAS:
1. Principio de la técnica aséptica
2. Fundamento de la tinción de Gram
3. Procedimiento de la tinción de Gram
4. Diferencias morfológicas entre bacteria Gram positivas y negativas
5. Ventajas de las tinciones diferenciales

BIBLIOGRAFIA:
Becker Jeffrey M., Caldwell Guy A., Zachgo Eve Ann., 1996. Biotechnology: A
Laboratory Course, 2da edición, editorial Academic Press, UK.
Madigan Michael T., Martinko John M., Parker Jack, traducción Gacto Fernandez M., y
otros, 2003. Biología de los Microorganismos, 10ma edición, editorial Pearson,
España.

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LABORATORIO DE CLAVE
MICROBIOLOGÍA

LICENCIATURA DE
BIOTECNOLOGÍA

Nombre de la practica: Practica: Paginas:

CULTIVO Y ESTUDIO DE HONGOS 3
Realizó: Autorizó:
QA. Rodrigo Jiménez Pichardo Dra. Blanca García Almendárez
Fecha de realización: Fecha de entrega:

INTROUCCIÓN:
Los hongos son células eucariotas, por lo que carecen de clorofila y tienen una
pared celular rígida; pueden ser uni o pluricelulares, además de microscópicos o
macroscópicos. Al carecer de clorofila deben nutrirse a expensas de materia orgánica.
Estos organismos tienen hábitats muy diversos, se les puede encontrar en los mantos
acuíferos, aunque la mayoría son de vida terrestre, encontrándose en el suelo.
Al cuerpo de los hongos se les denomina talo y éste puede ser unicelular, de
forma ameboidea u ovoide; o bien puede ser pluricelular con aspecto filamentoso
(mohos), esponjoso o carnoso. Bajo condiciones ambientales específicas algunos
hongos pueden presentar dimorfismo, es decir, pueden desarrollar como levaduras y
bajo otras condiciones desarrollan en forma filamentosa.
El aspecto filamentoso de los hongos se debe a la estructuras largas y finas,
llamadas hifas, al conjunto de hifas se le denomina micelio, el cual puede ser profundo
(micelio vegetativo), o aéreo. En cada especie las hifas crecen, se ramifican y
entretejen en forma más o menos constante, lo que da características típicas a cada
especie. Las hifas aéreas tienen una función y denominación específica. Estos hongos
pueden reproducirse sexualmente o asexualmente, en la punta de las hifas se forman
conidios, estos conidios son esporas asexuales, frecuentemente pigmentadas y
resistentes a la desecación, y sirven como forma de dispersión a un nuevo hábitat; si
hay una fusión de dos hifas sexuales se produce una espora sexual. Tanto una espora
sexual como asexual puede germinar para originar un nuevo micelio.

8
 Al comparar los requerimientos nutricionales de los hongos con las bacterias,
estos son menos complejos, es decir, los requerimientos nutricionales son más
simples, debido a esto el desarrollo es más lento, por lo que es necesario un tiempo de
incubación más largo. El estudio de los hongos implica el examen microscópico, la
observación del aspecto macroscópico de sus colonias y la determinación de sus
propiedades fisiológicas.

OBJETIVOS:

• Manejar las técnicas básicas para el cultivo e identificación de hongos

• Aplicar las técnicas de preparación y tinción adecuadas para el estudio
microscópico de hongos
• Reconocer y describir las características morfológicas y estructurales de los
hongos filamentosos

MATERIALES Y EQUIPOS:
Cajas Petri Portaobjetos Agua glicerinada
Asa micológica (asa
Agar Papa-Dextrosa Microscopio
microbiológica recta)
Bisturí o cúter Azul de algodón Acetona
Pinzas Xilol Cubreobjetos
Metanol Caja de Koplin

METODOLOGÍA:
1. En zona aséptica, con el bisturí estéril cortar un cuadro de 1 cm2 de agar papa-
dextrosa
2. Colocar en el centro de uno de los portaobjetos contenidos en la caja de Petri el
cuadro de agar
3. Con el asa micológica inocular cada uno de los lados del cuadro
4. Con las pinzas flameadas, colocar sobre el cuadro el segundo portaobjeto estéril
5. Para mantener la humedad, agregar aproximadamente 10 mL de agua
glicerinada, teniendo cuidado de no inundar para que el liquido no toque el
cultivo
6. Incubar durante 7 días a 28-30°C
7. En condiciones de asepsia, saque los portaobjetos de la caja
8. Observar el desarrollo del hongo que se presenta alrededor del cuadro de agar
9. Separar cuidadosamente los portaobjetos
10. Retirar el agar, tratando de no dañar el desarrollo del hongo
11. Fijar las preparaciones, agregando gotas de metanol, eliminar el exceso y dejar
secar al aire
12. Cubrir la preparación con un papel filtro y saturar con azul de algodón
13. Calentar la preparación, con vapor de agua, durante 10 minutos teniendo
cuidado de no dejar secar la preparación, debiendo adicionar colorante cada vez
que sea necesario. Retirar la preparación del calentamiento
14. Decolorar con etanol

9
 15. Colocar la preparación en una caja de Koplin con acetona, dejar durante 10
minutos
16. Transferir a otra caja de Koplin con una mezcla de xilol-acetona 50:50, dejar 10
minutos
17. Repetir el procedimiento empleando xilol durante 10 minutos
18. Secar a temperatura ambiente
19. Colocar una gota de bálsamo de Canadá en el centro de la preparación y taparlo
con un cubreobjetos
20. Observar con los objetivos 10X y 40X, registrar las observaciones

RESULTADOS:

Ilustrar con detalle las observaciones al microscopio:

FECHA:
MUESTRA:
TINCIÓN:
AUMENTO:
DESCRIPCIÓN:

PREGUNTAS:
1. Esquematiza un hongo filamentoso e identifica sus partes
2. Los hongos presentan hifas con función y denominación específica, ¿cuáles son
estas?
3. ¿Cuáles son las características morfológicas y estructurales que se utilizan para
identificar y clasificar de los hongos?
4. ¿por qué es necesario acidificar el medio de cultivo para los hongos?

BIBLIOGRAFIA:
Madigan Michael T., Martinko John M., Parker Jack, traducción Gacto Fernandez M., y
otros, 2003. Biología de los Microorganismos, 10ma edición, editorial Pearson,
España.
Tortora Gerard J., Funke Berdell R., Case Christrine L., traducción Rondinone Silvia y
otros, 2007. Introducción a la Microbiología, 9na edición, editorial
Panamericana, Argentina.

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LABORATORIO DE CLAVE
MICROBIOLOGÍA

LICENCIATURA DE
BIOTECNOLOGÍA

Nombre de la practica:
Practica: Paginas:
RECUENTO MICROSCOPICO DE
4
CÉLULAS
Realizó: Autorizó:
QA. Rodrigo Jiménez Pichardo Dra. Blanca García Almendárez
Fecha de realización: Fecha de entrega:

INTRODUCCIÓN:

Existen numerosos métodos que permiten establecer el número de microorganismos

en una muestra, estos datos son útiles para determinar la presencia o ausencia de
microorganismos contaminantes o la proporción en que se encuentran, así mismo para
estandarizar la concentración de un inóculos o realizar un seguimiento en la dinámica
poblacional de un cultivo puro.
Los ensayos de cuantificación de células se pueden agrupar en: métodos
directos e indirectos. Los métodos directos determinan la cantidad total de
microorganismos, es decir que no hace una discriminación entre vivos y muertos, para
determinar la cantidad solo de los microorganismos se utilizan los métodos indirectos.
Las variables importantes que deben ser tomadas en cuenta son el tipo de
microorganismos que se desea contar y la cantidad de estos presentes en la muestra.
Cualquiera que sea la muestra se debe partir de un volumen o peso de muestra
conocido.
Si la muestra ha sido sometida a tratamientos tendientes a disminuir la cantidad
de microorganismos se esperaría tener cuantas bajas o ausencia de estos. Por otra
parte, se puede dar el caso de que la cantidad de microorganismos sea excesiva, en
este caso es necesario realizar diluciones en un volumen conocido de agua u otro
diluyente para poder determinar la concentración con una mayor confiabilidad.
Los métodos directos de cuantificación ofrecen ventajas y desventajas por lo que
si se utilizan no deben dejarse de observar estas, es decir, se debe complementar la
11
información con métodos más precisos. Estos métodos son: turbidimetría,
microscópicamente o con contadores electrónicos, a su vez para realizar el conteo
puede haber varios técnicas bajo el mismo principio.

Las levaduras son hongos unicelulares, normalmente son de forma oval, aunque
se pueden encontrar de forma esférica o cilíndrica, en algunas ocasiones pueden
presentar un crecimiento filamentoso en respuesta a las condiciones del medio. El
tamaño de las levaduras es mayor al de las bacterias y presentan organelos como
núcleo.
La forma en que se reproducen es por gemación, es decir, la nueva célula se
forma como un pequeño apéndice en el extremo de la célula madre, el cual crece hasta
separase. Algunos géneros de levaduras pueden reproducirse por conjugación
(reproducción sexual), al fusionarse con otra célula.
El hábitat de donde se puede aislar con facilidad a las levaduras son los frutos
frescos, así como en los zumos de frutas, mieles florales, cortezas de arboles, entre
otras fuentes de carbono fácilmente fermentables.

OBJETIVOS:

• Aplicar las técnicas de preparación y tinción adecuadas para el estudio

microscópico de las levaduras
• Observar y describir las características microscópicas de las levaduras
• Explicar el fundamento de las técnicas más utilizadas en el recuento directo de
microorganismos
• Establecer la cantidad de microorganismos en una muestra mediante la
aplicación de un conteo directo

MATERIALES:

Cámara de Neubauer o Petroff - Hausser o

Cajas Petri
Hemocitómetro
Asa microbiológica Microscopio Puntas amarillas
Porta objetos Mechero Azul de metileno
Cubre objetos Micropipeta 100 μL Agar Sabouraud

METODOLOGÍA:

• Primer día
1. Preparar 30 mL del Agar Sabouraud
2. Esterilizar el medio de cultivo y 2 cajas Petri
3. Dejar enfriar el medio de cultivo y vaciarlo en las cajas Petri
4. Estriar las cajas Petri con la preparación de levaduras proporcionada
5. Incubar por 24 horas a 28°C
A. Limpiar la cámara de Neubauer con agua destilada
B. Llenar el área hundida de la cámara con 100 μL de la suspensión de levaduras
C. Tapar con un portaobjetos

12
 D. Colocar la cámara en el microscopio y enfocar con el objetivo 4X
E. Ubicarse en la cuadricula central y pasar al objetivo de 10X
F. Realizar el conteo de 5 cuadros (cuatro esquinas y el central)
G. Realizar la conversión correspondiente para determinar el número de
microorganismos en la suspensión
• Segundo día
1. Observar y registrar las características coloniales presentes en la superficie de
las cajas Petri
2. Realizar un frotis sobre el portaobjetos con una colonia aislada
3. Fijar las células a la flama del mechero
4. Colocar unas gotas de azul de metileno sobre la preparación y dejarlo actuar por
1 minuto
5. Enjuagar el colorante restante con agua destilada
6. Observar al microscopio con los objetivos 10X y 40X, registrar las observaciones

Objetivo 4X Objetivo 10X Objetivo 40X

RESULTADOS:

Ilustrar con detalle las observaciones al microscopio:

FECHA:
MUESTRA:
TINCIÓN:
AUMENTO:
DESCRIPCIÓN:

Cálculos necesarios para determinar el número de microorganismos en la suspensión

proporcionada.

13
PREGUNTAS:

1. Describir el fundamento de los diferentes métodos de cuantificación directa

2. Enlistar las ventajas y desventajas de los métodos de cuantificación directa
3. ¿Cuáles son los requerimientos nutricionales para el desarrollo de las
levaduras?
4. ¿Cuáles son las características coloniales para describir el desarrollo de las
levaduras?
5. Principales usos de las levaduras en la industria biotecnológica

BIBLIOGRAFIA:

Madigan Michael T., Martinko John M., Parker Jack, traducción Gacto Fernandez M., y
otros, 2003. Biología de los Microorganismos, 10ma edición, editorial Pearson,
España.
Becker Jeffrey M., Caldwell Guy A., Zachgo Eve Ann., 1996. Biotechnology: A
Laboratory Course, 2da edición, editorial Academic Press, UK.

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LABORATORIO DE CLAVE
MICROBIOLOGÍA

LICENCIATURA DE
BIOTECNOLOGÍA

Nombre de la practica: Practica: Paginas:

RECUENTO DE CÉLULAS VIABLES 5
Realizó: Autorizó:
QA. Rodrigo Jiménez Pichardo Dra. Blanca García Almendárez
Fecha de realización: Fecha de entrega:

INTRODUCCIÓN:
En algunos casos el conteo directo de microorganismos no da la información
adecuada, en ocasiones es necesario conocer la cantidad de células capaces de
desarrollarse en el medio ambiente, para esto se utilizan los métodos de conteo de
células viables. Estos métodos se fundamentan en que cualquier célula viable, es decir
sana, inoculada en un medio de cultivo es capaz de multiplicarse. Esta capacidad de
las células se identifica por la formación de colonias, por la producción de turbiedad,
gas o cambios en el pH.
Al igual que en los métodos directos estos métodos no son absolutamente
confiables para estimar el numero de microorganismos, sobre todo si estos no son
cultivos puros, ya que no hay condiciones de incubación (medio de cultivo,
temperatura, pH, condiciones de aireación, etc.) que permitan el desarrollo de todos los
grupos microbianos. Lo anterior indica que el estudio de muestras heterogéneas
involucra el recuento de cada grupo presente por separado.
Los métodos de conteo indirecto o culturales más empleados son: vertido en
placa, extensión superficial, método de la gota o Miles-Misra, conteo por número más
probable (NMP), entre otros. Los métodos que involucran conteo sobre placas de agar
(vertido en placa, extensión en superficie, Miles-Misra) se basan en que cada célula
viable al multiplicarse dará origen a un cúmulo de células, los resultados se reportan
como Unidades Formadoras de Colonia por mililitro (UFC/mL), el conteo se realiza a
simple vista.
El método de número más probable (NMP) parte de que al menos un
microorganismo estaba presente en la alícuota, dando una respuesta positiva. En base

15
a la teoría de la probabilidad y con ayuda de una ecuación matemática es posible
calcular el número más probable de células por volumen o peso de la muestra. Se
pueden encontrar un gran número de tablas del NMP que toman en cuenta diferentes
volúmenes de inoculo, rangos de dilución y número de tubos o repeticiones para cada
dilución.

OBJETIVOS:
• Explicar el fundamento de las técnicas más utilizadas en el recuento indirecto o
cultural de microorganismos
• Establecer la cantidad de microorganismos en una muestra mediante la
aplicación de un conteo indirecto
• Comparar los resultados obtenidos por diferentes métodos de cuantificación

MATERIALES:
Mechero L de vidrio Micropipeta de 100 μL
Cajas Petri Jeringa o propipeta Puntas amarillas
Pipetas 10 y 1 mL Agar Cuenta Estándar Hipoclorito de sodio al 5%
Tubos de vidrio con tapa de
Solución salina al 0.85% Gradilla
rosca de16X150 mm
Vaso de precipitado de 250 mL

METODOLOGÍA:
Preparación de las diluciones:
1. Colocar 9 mL de solución salina en cada tubo y esterilizarlos
2. Dejar enfriar la solución y rotular los tubos como 10-1 hasta 10-8
3. Agitar el tubo con cultivo para homogenizaron, esta es la dilución 100
4. Con una pipeta de 1 mL estéril tomar 1 mL de de la dilución 100 y pasarlo al tubo
marcado como dilución 10-1, introducir la pipeta en la solución de hipoclorito de
sodio al 5%
5. Tapar el tubo y agitarlo mediante movimientos de abajo hacia arriba,
describiendo un arco de 30 cm aproximadamente
6. Trasferir 1 ml al tubo de la siguiente dilución con una pipeta estéril, agitar el tubo.
Desechar la pipeta en la solución de hipoclorito de sodio
7. Repertir el procedimiento anterior hasta la dilución 10-8

Método de extensión en placa

8. De la dilución 10-6 a 10-8 transferir 100 μL a una caja de Petri y extender la gota
por toda la superficie con la L de vidrio. Realizar el procedimiento por duplicado
9. Dejar que la muestra se absorba en el medio, invertir la caja e incubar
10. Contar las cajas que tengan entre 30 y 300 colonias desarrolladas en la
superficie y calcular el número de UFC por mL de muestra

Método de Miles-Misra
11. Dividir las cajas en tres partes iguales y marcarlos como 10-6 a 10-8
12. Con la micropipeta tomar 20 μL de la dilución correspondiente y verterla sobre el
agar a forma de dejar una gota, en total se colocaran 3 gotas de cada dilución en
el área marcada correspondiente
16
 13. Dejar que la muestra se absorba en el medio, invertir la caja e incubar
14. Contar las gotas que tengan entre 20 y 50 colonias desarrolladas y calcular el
número de UFC por mL de muestra
PREGUNTAS:
1. Ventajas y desventajas de los métodos de conteo indirecto en comparación con
los métodos directos
2. ¿Por qué se considera una célula viable y por qué puede perder esta condición?
3. Indica los pasos necesarios para cuantificar una muestra heterogénea

BIBLIOGRAFIA:
Madigan Michael T., Martinko John M., Parker Jack, traducción Gacto Fernandez M., y
otros, 2003. Biología de los Microorganismos, 10ma edición, editorial Pearson,
España.
Becker Jeffrey M., Caldwell Guy A., Zachgo Eve Ann., 1996. Biotechnology: A
Laboratory Course, 2da edición, editorial Academic Press, UK.

17
 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE
QUERETARO
FACULTAD DE QUÍMICA

LABORATORIO DE CLAVE
MICROBIOLOGÍA

LICENCIATURA DE
BIOTECNOLOGÍA

Nombre de la practica:
Practica: Paginas:
RECUENTO DE BACTERIAS
6
MESÓFILAS AEROBIAS
Realizó: Autorizó:
QA. Rodrigo Jiménez Pichardo Dra. Blanca García Almendárez
Fecha de realización: Fecha de entrega:

INTRODUCCIÓN:
Uno de los exámenes microbiológicos de rutina y de mayor importancia es la cuenta
bacteriana total, específicamente el recuento de bacterias mesófilas aerobias (BMA),
las cuales se desarrollan a temperatura ambiente (25 - 30°C). Este recuento aporta
información sobre la microbiota total existente en un producto, permitiendo evidenciar la
exposición a fuentes de contaminación, las condiciones de almacenamiento, el nivel de
frescura, la eficiencia de tratamientos antimicrobianos y las condiciones higiénicas
prevalecientes en la obtención, preparación, transporte o comercialización de un
producto y advirtiéndonos de una posible presencia de microorganismos patógenos,
dado que éstos suelen ser mesófilos.
El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias que se desarrollan
en el medio de elección después de un cierto tiempo y temperatura de incubación,
presuponiendo que cada colonia proviene de un microorganismo de la muestra bajo
estudio. El método admite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas
controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.
El método de vertido en placa consiste en verter un mililitro de la suspensión de
la suspensión bacteriana dentro de la placa, posteriormente se añade el agar a una
temperatura adecuada y se mezcla con movimientos suaves y se deja solidificar.
Después del tiempo de incubación se procede a cuantificar el número de Unidades
Formadoras de Colonia y se realiza la estimación de UFC totales en el volumen de la
muestra.

18
OBJETIVOS:
• Efectuar el recuento de Bacterias Mesófilas Aerobias (BMA) de una muestra
utilizando el método de vertido en placa y el de Miles-Misra
• Comparar los resultados obtenidos por diferentes métodos de cuantificación

MATERIALES:
Plato caliente con
Mechero Gradilla
agitación
Cajas Petri Jeringa o propipeta Vaso de precipitado de 250 mL
Pipetas 10 y 1 mL Agar Cuenta Estándar Hipoclorito de sodio al 5%
Tubos de vidrio con tapa de Micropipeta de 100μL y puntas
Solución salina al 0.85%
rosca de16X150 mm amarillas

METODOLOGÍA:
Preparación de las diluciones:
15. Colocar 9 mL de solución salina en cada tubo y esterilizarlos
16. Dejar enfriar la solución y rotular los tubos como 10-1 hasta 10-6
17. Agitar el tubo con cultivo para homogenizaron, esta es la dilución 100
18. Con una pipeta de 1 mL estéril tomar 1 mL de de la dilución 100 y pasarlo al tubo
marcado como dilución 10-1, introducir la pipeta en la solución de hipoclorito de
sodio al 5%
19. Tapar el tubo y agitarlo mediante movimientos de abajo hacia arriba,
describiendo un arco de 30 cm aproximadamente, deben ser 20 movimientos en
7 segundos
20. Trasferir 1 ml al tubo de la siguiente dilución con una pipeta estéril, agitar el tubo.
Desechar la pipeta en la solución de hipoclorito de sodio
21. Repetir el procedimiento anterior hasta la dilución 10-6
Método de vaciado en placa:
1. Preparar el medio de cultivo y esterilizarlo, después del tiempo de esterilización
el agar debe mantenerse a 50°C
2. De las diluciones 10-4 a 10-6 verter 1 mL en la caja Petri estéril correspondiente,
2 cajas por cada dilución
3. En condiciones de asepsia, añadir a cada una de las cajas 15 a 20 mL de agar
cuenta estándar
4. Colocar la caja en la superficie de la mesa y moverlas suavemente de la
siguiente forma:
a. En el sentido de las manecillas del reloj
b. Al contrario de las manecillas del reloj
c. De forma vertical
d. De forma lateral
Los movimientos circulares deben describir un diámetro de 15 cm y los lineales
deben recorrer 15 cm sobre la superficie
5. Dejar solidificar el medio, invertir la caja e incubar a 30°C durante 24 horas

19
 6. Después del tiempo de incubación observar el efecto de la dilución, seleccionar
las placas que se encuentren entre 30 y 300 UFC
7. Realizar el conteo marcando cada colonia contada con un plumón
8. Realizar los cálculos correspondientes y reportar las UFC/mL
Método de Miles-Misra
9. Dividir las cajas en tres partes iguales y marcarlos como 10-4 a 10-6
10. Con la micropipeta tomar 20 μL de la dilución correspondiente y verterla sobre el
agar a forma de dejar una gota, en total se colocaran 3 gotas de cada dilución en
el área marcada correspondiente
11. Dejar que la muestra se absorba en el medio, invertir la caja e incubar
12. Contar las gotas que tengan entre 20 y 50 colonias desarrolladas y calcular el
número de UFC por mL de muestra

PREGUNTAS:
1. ¿Para qué sirve realizar una cuenta bacteriana total?
2. ¿Qué indicaría un elevado número de BMA en un producto X?
3. ¿Cuáles son los cuidados necesarios en la preparación de las diluciones?

BIBLIOGRAFIA:
Madigan Michael T., Martinko John M., Parker Jack, traducción Gacto Fernandez M., y
otros, 2003. Biología de los Microorganismos, 10ma edición, editorial Pearson,
España.
Becker Jeffrey M., Caldwell Guy A., Zachgo Eve Ann., 1996. Biotechnology: A
Laboratory Course, 2da edición, editorial Academic Press, UK.

20
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QUERETARO
FACULTAD DE QUÍMICA

LABORATORIO DE CLAVE
MICROBIOLOGÍA

LICENCIATURA DE
BIOTECNOLOGÍA

Nombre de la practica:
RECUENTO DE CÉLULAS VIABLES Practica: Paginas:
POR EL METODO DE NUMERO MÁS 7
PROBABLE (NMP)
Realizó: Autorizó:
QA. Rodrigo Jiménez Pichardo Dra. Blanca García Almendárez
Fecha de realización: Fecha de entrega:

INTRODUCCIÓN:
El método de numero más probable (NMP) es una estrategia eficiente de estimación de
densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células
individuales no es factible. La técnica se basa en la determinación de presencia o
ausencia en réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de
microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un
requisito importante de este método es la necesidad de poder reconocer un atributo
particular de la población(es) en el medio de crecimiento utilizado.
Algunas de las ventajas del NMP son: a) la capacidad de estimar tamaños
poblacionales basados en atributos específicos de un grupo de microorganismos
(selectividad); b) determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente, c) suele
ser más rápido e igual de confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en
platos de cultivo, d) facilidad de interpretación, entre otros.
Para esta práctica se utilizara la capacidad de los organismos coliformes de
fermentar la lactosa del medio y producir gas. Los organismos coliformes son aquellos
que tienen ciertas características bioquímicas en común y son de mucha importancia
como indicadores de contaminación del agua y de los alimentos, se pueden diferenciar
entre organismos coliformes totales y coliformes fecales. Estos microorganismos son
por lo general bacilos cortos que se han definido como bacterias aerobias o anaerobias
facultativas que fermentan la lactosa con producción de gas. Las principales especies

21
de bacterias coliformes son Escherichia coli y Enterobacter aerogenes; no obstante, las
especies que es posible que se ajusten a estos criterios, son más de veinte,
encontrados entre las mismas especies de otros géneros de la familia
Enterobacteriaceae. Los coliformes fecales son los provenientes de los intestinos de
animales de sangre caliente y que son capaces de crecer a temperatura elevada (44.5
o 45°C).

OBJETIVOS:
• Determinar la cantidad de microorganismos coliformes totales y fecales en una
muestra, mediante la el método de Numero Más Probable (NMP)

MATERIALES:
Mechero
Gradilla
Pipetas 10 y 1 mL
Tubos de vidrio con tapa de
rosca de16X150 mm
9 Campanas de Durham
Plato caliente con
agitación
Jeringa o propipeta
Solución salina al 0.85%
Caldo bilis verde brillante
(BVB)
Vaso de precipitado de 250 mL
Hipoclorito de sodio al 5%
Leche bronca
Tablas de NMP para series de
tres tubos al 95% de confianza

METODOLOGÍA:
Preparación de las diluciones:
22. Colocar 9 mL de solución salina en cada tubo y esterilizarlos
23. Dejar enfriar la solución y rotular los tubos como 10-1 hasta 10-6
24. Agitar el tubo con cultivo para homogenizaron, esta es la dilución 100
25. Con una pipeta de 1 mL estéril tomar 1 mL de de la dilución 100 y pasarlo al tubo
marcado como dilución 10-1, introducir la pipeta en la solución de hipoclorito de
sodio al 5%
26. Tapar el tubo y agitarlo mediante movimientos de abajo hacia arriba,
describiendo un arco de 30 cm aproximadamente, deben ser 20 movimientos en
7 segundos
27. Trasferir 1 ml al tubo de la siguiente dilución con una pipeta estéril, agitar el tubo.
Desechar la pipeta en la solución de hipoclorito de sodio
28. Repetir el procedimiento anterior hasta la dilución 10-6

Método del NMP:

1. Preparar el caldo bilis verde brillante (BVB), verter 10 mL en 9 tubos, colocar la
cámara de Durham dentro de los tubos de precipitados con tapa, cuidando que
quede totalmente llena, y esterilizarlos
2. Colocar los tubos con el caldo BVB en una gradilla e identificarlos con las
diluciones correspondientes
3. Verter 1 mL de la dilución correspondiente a cada tubo de la serie de tres tubos
con caldo BVB
4. Incubar los tubos a 35°C durante 24 horas para los coliformes totales o 44°C
para los coliformes fecales
5. Después de la incubación observar los tubos y determinar si el medio se
enturbio y si se atrapo gas dentro de las cámaras de Durham

22
 6. En base a los tubos positivos de la serie identificar el NMP en la tabla, con esto
se obtiene la cantidad de microorganismos inoculados en la dilución intermedia
7. Realizar los cálculos necesarios para determinar el NMP de microorganismos
por mililitro de muestra

PREGUNTAS:
• ¿Qué indica la presencia de microorganismos coliformes en una muestra?
• ¿Cómo se diferencian los coliformes totales de los coliformes fecales?
• ¿Cuál es la función de las sales biliares en el caldo BVB?
• Según tu opinión ¿cuáles serían los problemas en la realización de este método
de cuantificación de células viables?

BIBLIOGRAFÍA:
Tortora Gerard J., Funke Berdell R., Case Christrine L., traducción Rondinone Silvia y
otros, 2007. Introducción a la Microbiología, 9na edición, editorial Panamericana,
Argentina
Madigan Michael T., Martinko John M., Parker Jack, traducción Gacto Fernandez M., y
otros, 2003. Biología de los Microorganismos, 10ma edición, editorial Pearson,
España.
Fernández, E. 2000. Microbiología e Inocuidad de los Alimentos. Universidad Autónoma de
Querétaro, México

23
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QUERETARO
FACULTAD DE QUÍMICA

LABORATORIO DE CLAVE
MICROBIOLOGÍA

LICENCIATURA DE
BIOTECNOLOGÍA

Nombre de la practica:
Practica: Paginas:
METABOLISMO Y NUTRICIÓN
8
MICROBIANA
Realizó: Autorizó:
QA. Rodrigo Jiménez Pichardo Dra. Blanca García Almendárez
Fecha de realización: Fecha de entrega:

INTRODUCCIÓN:
Las características genéticas, las propiedades fisiológicas y la capacidad para utilizar y
trasformar los diferentes compuestos químicos, es lo que determina la supervivencia de
un organismo. Los factores ambientales también tendrán influencia sobre los
requerimientos nutricionales, es decir los requerimientos nutricionales reflejan el
ambiente natural en que se desarrollan, por lo que este conocimiento y el uso de
medios de cultivo con composición química definida, son de primordial importancia en
el estudio de la nutrición microbiana.
Algunos nutrientes constituyen los bloques estructurales a partir de los cuales la
célula elabora macromoléculas estructurales o funcionales, mientras que otros sirven
como donadores de electrones (fuente de energía) y algunos más como aceptores
finales de electrones, a veces un mismo nutriente desempeña todas las funciones lo
que dependerá del tipo de microorganismo. Algunos microorganismos producen una
batería reducida de sistemas enzimáticos, en tanto que otros son capaces de sintetizar
una variedad amplia, de este modo, cuanto mayor sea la diversidad de enzimas que
posee un microorganismo mayor es el espectro de materias primas o de mayor
complejidad, que éste puede utilizar.
Para identificar las características especificas de un grupo de bacterias u
organismos individuales, se han desarrollado diferentes ensayos basados en la
capacidad para utilizar ciertos sustratos, sus características fermentativas y/o
oxidativas, su capacidad para producir metabolitos específicos, entre otras. Estos
ensayos son llamados pruebas bioquímicas.
24
 Las características metabólicas que se aprovechan son: la hidrólisis de
polisacáridos, proteínas y/o lípidos; utilización de disacáridos; la capacidad de oxidar
y/o fermentar azucares; utilización de ácidos orgánicos, compuestos nitrogenados o
azufrados; entre otras. Para realizar estas pruebas bioquímicas es necesario una gran
cantidad de material de laboratorio, además de medios de cultivo y reactivos químicos
para identificar algunos metabolitos, por esto se han desarrollado microtécnicas. Estas
microtécnicas constan de microtubos que contienen los medios de cultivo
deshidratados, los cuales se inoculan y se incuban, después del tempo requerido se
interpretan los resultados con los instructivos o tablas proporcionadas por el fabricante.

OBJETIVOS:
• Relacionar la actividad metabólica de los microorganismos con los cambios
producidos en los medios de cultivo y la aparición de diferentes metabolitos
• Interpretar adecuadamente pruebas especificas y relacionarlas con las
características metabólicas de los microorganismos
• Aplica los conocimientos adquiridos para la caracterización de un
microorganismo problema

MATERIALES Y EQUIPO:
Matraz Erlenmeyer de
250mL
Pipeta graduada de 10 mL
Tubos de ensaye de
16X150mm con tapa rosca
Mechero Bunsen con
manguera
Cubre u portaobjetos
Asa bacteriológica
Agar soya tripticaseina
Gradilla
Caldo soya tripticaseina
Cajas Petri
Micropipeta de 10 a 100 μL
Kit para tinción de Gram
y puntas

METODOLOGÍA:
1. Estriar una caja Petri con el cultivo proporcionado para verificar la pureza
2. Incubar a 30°C durante 24 horas
3. Verificar que el desarrollo microbiano solo presente una morfología, si hay más
de una aislar cada colonia diferente en una caja Petri. Si solo se presenta una
morfología tomar una colonia y realizar una tinción de Gram
4. Colocar una colonia en un portaobjetos y colocar una gota de agua oxigenada
sobre ella, observar si hay formación de burbujas
5. Tomar otra colonia e inocular un tubo con 10 mL de caldo soya tripticaseina,
incubar a 30°C durante 24 horas
6. Después del tiempo de incubación transferir 1 mL a dos microtubos, uno en cada
tubo, y centrifugarlo a 400 rpm durante 4 minutos
7. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en la ampolla API STAPH
8. Agitar la ampolla y llenar las capsulitas de la tira API, sin sobrepasar el nivel del
tubo
9. Cerrar la cámara de incubación e incubar a 35-37°C durante 24 horas
10. Después del tiempo de incubación colocar 1 gota de la solución de NaOH y otra
de α-naftol en la capsula de VP

25
 11. Leer todas las reacciones conforme a la tabla de lectura y anotar los resultados
en la hoja

PREGUNTAS:
1. Las pruebas bioquímicas que componen la placa API son:
Metabolismo de di y monosacáridos, reducción de nitratos, presencia de fosfatasa
alcalina, Voges-Proskauer, metabolismo de azucares complejos (rafinosa, xilosa,
sacarosa, α-metil-D-glucosa, N-acetil-glucosa), metabolismo de arginina y urea. ¿Cuál
es el fundamento de estas pruebas bioquímicas?
2. ¿Por qué es necesario crear un ambiente de anaerobiosis en algunas pruebas?
3. ¿Qué otras pruebas se utilizan para identificar microorganismos?

BIBLIOGRAFIA:
Tortora Gerard J., Funke Berdell R., Case Christrine L., traducción Rondinone Silvia y
otros, 2007. Introducción a la Microbiología, 9na edición, editorial Panamericana,
Argentina
Madigan Michael T., Martinko John M., Parker Jack, traducción Gacto Fernandez M., y
otros, 2003. Biología de los Microorganismos, 10ma edición, editorial Pearson,
España.

26
 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE
QUERETARO
FACULTAD DE QUÍMICA

LABORATORIO DE CLAVE
MICROBIOLOGÍA

LICENCIATURA DE
BIOTECNOLOGÍA

Nombre de la practica:
INFLUENCIA DE LOS FACTORES Practica: Paginas:
FÍSICOS SOBRE EL DESARROLLO 9
DE LOS MICROORGANISMOS
Realizó: Autorizó:
QA. Rodrigo Jiménez Pichardo Dra. Blanca García Almendárez
Fecha de realización: Fecha de entrega:

INTRODUCCIÓN:
Los factores ambientales como el pH, la temperatura, la presión osmótica, la humedad,
las radiaciones, la naturaleza y concentración de las sustancias químicas presentes y la
competencia de los demás seres vivos, tiene efectos intensos y determinantes en las
actividades de los microorganismos. Conocer cómo afecta estos factores a la
supervivencia, multiplicación y actividad bioquímica de las bacterias, ofrece una ayuda
para describir su comportamiento en la naturaleza, además de que nos permite
favorecer su desarrollo, limitar su actividad o eliminarlos.
En el laboratorio es relativamente fácil controlar los factores ambientales para el
cultivo de los microorganismos, el uso de medios de cultivo con componentes
definidos, un pH específico, y una temperatura controlada favorecen o inhiben el
crecimiento. En la naturaleza el desarrollo está condicionado a la adaptación del
microorganismo al medio ambiente. El efecto estimulatorio, inhibitorio o destructivo de
los factores físicos está condicionado por el tipo, edad, cantidad y estado fisiológico de
los microorganismos; la cantidad y concentración del agente externo; el tiempo de
exposición; y la interacción con otros factores ambientales.
Las bacterias se ven afectadas por los agentes de diversas formas, algunas de
las cuales tienen que ver con un daño a la pared celular o en la membrana plasmática,
a algunas alteración en la organización celular o a la permeabilidad de la membrana,

27
así como una interferencia en los procesos de producción y utilización de energía o
interrupción de rutas metabólicas.
La temperatura es uno de los factores más importantes, ya que afecta tanto el
índice de crecimiento como la supervivencia, debido a que influye directamente en las
reacciones químicas y en la configuración de las proteínas. Cada grupo microbiano
crece dentro de un rango de temperatura limitado, según este rango de temperatura de
crecimiento los microorganismos se dividen en tres grupos: psicrófilos, mesófilos y
termófilos.
Otro factor importante es el pH, ya que la concentración de iones hidrógeno
afecta a la estabilidad de las proteínas al interaccionar con los grupos funcionales. El
intervalo de pH que soportan los microorganismos es amplio, pero en general hay un
valor óptimo para su crecimiento. Según el pH al que crecen estos organismos se
pueden denominar como neutrófilos, acidófilos o alcalófilos.

OBJETIVOS:
• Evaluar y comprobar prácticamente el efecto de la temperatura y el pH sobre el
desarrollo de los microorganismos
• Relacionar el efecto de la temperatura y el pH con algunas características de los
microorganismos

MATERIALES Y EQUIPO:
Tubos de precipitado
16X150 mm con tapa de Mechero Solución salina
rosca
Vaso de pp de 250ml Pipetas de 1ml Agar y caldo nutritivo
Soporte universal, anillo
Gradilla metálico y tela de Termómetro
asbesto
Asa bacteriológica Cajas petri Potenciómetro
Plato caliente

METODOLOGÍA:
Punto térmico mortal:
1. Colocar un Baño maría a 50, 60 70, 80 y a ebullición
2. Identificar los tubos con las temperaturas y con el microorganismo
3. Dividir una caja Petri en 6 partes y marcarlos con cada temperatura
4. Inocular con 0.1 mL de cada microorganismo 5 tubos con 7 mL de solución
salina y agitar
5. Colocar un tubo de cada microorganismo en cada baño microorganismo y un
tubo con agua de la llave, en el cual se coloca el termómetro, cuando este tubo
alcance la temperatura comenzar a contar el tiempo, manteniendo la
temperatura correspondiente y dejarlo 10 minutos, después retirarlo del baño
6. Dejar enfriar el tubo y tomar una asada e inocular el segmento de la caja de Petri
correspondiente haciendo
7. Incubar las cajas en posición invertida a 37°C durante 48 horas

28
 8. Registrar si hubo crecimiento

Periodo térmico mortal:

1. Colocar un Baño María a 60 y otro a ebullición
2. Identificar cada tubo por el tiempo de exposición (0, 5, 10, 20 y 30 min) a cada
temperatura y para cada microorganismo
3. Dividir una caja Petri en 5 partes, para cada microorganismo
4. En 2 tubos con 7 mL de solución salina, verter 0.1 mL del cultivo y agitar, realizar
lo mismo con el otro cultivo
5. Introducir en el Baño María a 60° un tubo de cada microorganismo y un tubo con
agua de la llave, en el cual se coloca el termómetro, cuando este tubo alcance la
temperatura comenzar a contar el tiempo, manteniendo la temperatura
6. A los 5 minutos tomar una muestra con el asa y estriar el segmento
correspondiente, esto se hace para cada microorganismo
7. Regresar rápidamente el tubo al baño y mantener el calentamiento
8. Repetir el paso 6 a los 10, 20 y 30 minutos
9. Con los tubos restantes repetir el procedimiento en el baño a ebullición
10. Incubar las cajas a 30°C
11. Registrar las observaciones

Temperatura óptima:
1. Colocar en una gradilla los tubos con 7 mL de caldo nutritivo y etiquetarlos con el
microorganismo a trabajar y la temperatura a la que se incubará
2. Inocular con 0.1 mL, con la pipeta estéril y en condiciones de asepsia, un tubo
por cada microorganismo
3. Incubar los tubos a las diferentes temperaturas de 8, 28, 37 y 45°C, por 24 o 48
horas según el microorganismo
4. Comparar la turbiedad de los tubos y registrar las observaciones

Efecto del pH:

1. Preparar el caldo nutritivo y ajustar el pH a 3.0, 5.0, 7.0 y 9.0, colocar 7 mL en
cada tubo, etiquetarlos y esterilizar los tubos como normalmente se hace
2. Colocar en la gradilla los tubos y etiquetarlos con el microorganismo a trabajar
3. Inocular con una pipeta estéril y en condiciones de asepsia, cada tubo con 0.1
mL de la suspensión del microorganismo indicado
4. Incubar los tubos a 28 o 37°C dependiendo del microorganismo durante 48
horas
5. Agitas los tubos y registrar el grado de turbiedad que presenta cada tubo

PREGUNTAS:
1. Indicar el mecanismo por el cual afecta a las proteínas y a la membrana el factor
temperatura
2. Indicar el rango de temperatura para cada una de las divisiones
3. ¿A qué se refiere el término termotolerante?
4. Indicar el mecanismo por el cual afecta el pH a las proteínas o a las membranas
celulares

29
 5. Indicar el rango de pH para cada división de microorganismos
6. ¿A qué se refieren los términos ácido tolerante y alcalino tolerante?

BIBLIOGRAFÍA:
Tortora Gerard J., Funke Berdell R., Case Christrine L., traducción Rondinone Silvia y
otros, 2007. Introducción a la Microbiología, 9na edición, editorial Panamericana,
Argentina
Madigan Michael T., Martinko John M., Parker Jack, traducción Gacto Fernandez M., y
otros, 2003. Biología de los Microorganismos, 10ma edición, editorial Pearson,
España.

30
 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE
QUERETARO
FACULTAD DE QUÍMICA

LABORATORIO DE CLAVE
MICROBIOLOGÍA

LICENCIATURA DE
BIOTECNOLOGÍA

Nombre de la practica:
INFLUENCIA DE LOS FACTORES Practica: Paginas:
QUÍMICOS SOBRE EL DESARROLLO 10
DE LOS MICROORGANISMOS
Realizó: Autorizó:
QA. Rodrigo Jiménez Pichardo Dra. Blanca García Almendárez
Fecha de realización: Fecha de entrega:

INTRODUCCIÓN:
Cuando se coloca una célula en un medio, se ejerce una presión osmótica a través de
la membrana semipermeable, esta presión depende de la concentración de sustancias
disueltas en la solución. Por lo general un microorganismo crece mejor en un ambiente
que contenga una concentración osmótica ligeramente inferior a la interna. Esta
diferencia de presión hace que el agua fluya al interior, arrastrando a los nutrientes y
para mantener una presión hacia afuera.
La pared celular de bacterias y otros microorganismos los hace resistentes a los
cambios de presión osmótica, pero su cambio exagerado en esta presión da como
resultado la muerte. Los microorganismos capaces de soportar grandes
concentraciones de solutos, se les conoce como osmotolerantes, por el contrario si
necesitan una concentración alta de solutos se denominan osmófilos. Si el soluto
presente es el cloruro de sodio se utiliza el término halófilo y se pueden clasificar en
moderados y extremos.
Al igual que los solutos presentes que tienen alguna actividad nutrimental
existen sustancias que tienen una acción inhibitoria o destructiva, a estos compuestos
químicos se llaman antimicrobianos. Estos compuestos antimicrobianos comprenden
un grupo heterogéneo de sustancias que varían en su composición química,

31
concentración a la que actúan, grado de toxicidad, mecanismo de acción, lugar de la
célula sobre el que actúan, entre otras características.
La toxicidad selectiva que poseen muchos agentes antimicrobianos indica, que
un agente es más efectivo contra cierto tipo de microorganismos, por lo que se
denominan según el grupo microbiano sobre el que actúan (bactericida, fungicida,
algicida, viricida, etc.).
La técnica llamada “difusión en agar” es una de las más empleadas para evaluar
la sensibilidad de los microorganismos a los diferentes agentes químicos; esta es una
técnica rápida, sensible, económica y de fácil interpretación. La interpretación se realiza
midiendo el diámetro del halo de inhibición de desarrollo celular, si no se observa un
halo de inhibición o es muy pequeño se considera que el microorganismo no es
afectado por el agente químico, por el contrario si el halo es grande se considera que
este agente tienen poder antimicrobiano.

OBJETIVOS:
• Evaluar y comprobar prácticamente el efecto de algunos compuestos químicos
sobre el desarrollo de los microorganismos
• Relacionar el efecto de los agentes químicos probados con algunas
características de los microorganismos

MATERIALES Y EQUIPO:
Tubos de precipitado
16X150 mm con tapa de Mechero NaCl y Sacarosa
rosca
Vasos de pp de 250ml Pipetas de 1ml Regla
Gradilla Alcohol al 70% Papel filtro
Asa bacteriológica Cajas petri Perforadora
Varilla de vidrio doblada
Plato caliente Agar y caldo nutritivo
en “L”

METODOLOGÍA:
Presión osmótica:
1. Preparar 42 mL de caldo nutritivo y separarlos en 6 tubos, suplementar cada
tubo con NaCl en concentraciones de 0.0, 0.85, 3.5, 7, 10 y 15%
2. Preparar 42 mL de caldo nutritivo y separarlos en 6 tubos, suplementar cada
tubo con sacarosa en concentraciones de 0.0, 1.0, 3.0, 7.5, 15 y 30%
3. Esterilizar los tubos y colocarlos en una gradilla en orden creciente de
concentración, rotularlos con el microorganismo a trabajar
4. Con una pipeta estéril y en condiciones de asepsia, transferir 0.1 mL del cultivo a
cada tubo y homogeneizar
5. Incubar a 30°C durante 24 horas
6. Homogeneizar los tubos, observar la turbidez que se presenta en cada tubo y
registrar las observaciones

Efecto de agentes antimicrobianos:

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 1. Con ayuda de la perforadora obtener discos de papel filtro y esterilizarlos
2. Preparar agar nutritivo suficiente para 5 cajas petri, esterilizarlo, vaciarlo en las
cajas y esperar a que solidifique
3. En condiciones de asepsia inocular cada caja con 0.1 mL del cultivo
proporcionado
4. Sumergir la varilla de vidrio en el alcohol y pasarla por la flama del mechero,
esperar a que se enfríe y esparcir el inoculo por toda la superficie de la caja.
5. En vasos de 250 mL preparar soluciones acuosas de diferentes agentes
antimicrobianos
6. Esterilizar las pinzas con alcohol y a la flama del mechero
7. En condiciones de asepsia tomar un disco de papel filtro e impregnarlo con el
agente químico a probar, eliminar el exceso de solución por escurrimiento y
depositar el disco sobre la superficie de la caja en el segmento correspondiente
8. Con las pinzas presionar ligeramente el disco sobre la superficie
9. Repetir los pasos 6, 7 y 8 para cada agente químico a evaluar
10. Invertir las cajas e incubar a 30°C durante 24 horas
11. Medir el halo de inhibición y registrar las observaciones
Los agentes a probar son: detergente para trastes, alcohol al 70% y 96%, hipoclorito de
sodio al 6 y 10%, merthiolate, nitrato de plata o solución de yodo (gotas para
desinfectar verduras), agentes de limpieza (Pinol, Fabuloso, etc.), jabón de tocador,
ácido acético, sosa para estufa, destapa caños (drano, etc.), penicilina, cefalosporina,
nicina, cloranfenicol, etc.

PREGUNTAS:
1. ¿Qué es una solución isotónica, hipotónica e hipertónica?
2. ¿Qué le pasa a la célula en cada una de estas soluciones?
3. ¿A qué se refieren los términos biocida y biostático?
4. Menciona el mecanismo de acción de algún agente antimicrobiano
5. ¿Por qué el NaCl o la sacarosa pueden inhibir el desarrollo de los
microorganismos?

BIBLIOGRAFIA:
Tortora Gerard J., Funke Berdell R., Case Christrine L., traducción Rondinone Silvia y
otros, 2007. Introducción a la Microbiología, 9na edición, editorial Panamericana,
Argentina
Madigan Michael T., Martinko John M., Parker Jack, traducción Gacto Fernandez M., y
otros, 2003. Biología de los Microorganismos, 10ma edición, editorial Pearson,
España.

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