FACULTAD DE CIENCIAS DE INGENIERIA ZOOTECNIA

PRACTICA N° 6 : IDENTIFICACIÓN DE MICRORGANISMOS

CÀTEDRA : Microbiología
CATEDRÀTICO : Dr. Elmer Rene Chavez Araujo

CICLO : “IV”

ALUMNO : Joseth Sthif, Rivera Centeno

HUANCAVELICA - 2018
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I. INTRODUCCIÓN

Gracias a las reacciones fisiológicas y químicas de los microorganismos, es

posible llevar a cabo su estudio bioquímico como complemento de otros estudios
bacteriológicos, puede ser un apoyo a la hora de diagnosticar infecciones por
bacterias. Este conjunto de medios de cultivo son muy usados para la
identificación de las bacterias y su siembra debe realizarse a partir de colonias
aisladas, son enriquecidos con productos útiles para el metabolismo celular y que
contienen un indicador que hace virar el color al efectuar los microorganismos sus
funciones.

Los microorganismos en general difieren en su capacidad metabólica, que un

microorganismo puede crecer y reproducirse, es decir sea capaz de llevar acabo
su proceso de biosíntesis, debe disponer de sus nutrientes necesarios. Entre estos
nutrientes tenemos: elementos energéticos, constituyentes, elementos específicos
que son variables en cada microorganismo, y condiciones fisicoquímicas
adecuadas.

Todas estas condiciones son propias de un microorganismo y de acuerdo a ello

podemos aislarlo usando el medio apropiado e identificarlos tomando en cuenta
sus requerimientos nutricionales. En el comercio se encuentran disponibles una
variedad de medios bioquímicos para identificar la bacteria.

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II. MARCO TEORICO :

2.1 MÉTODOS FENOTÍPICOS

Actualmente, la identificación bacteriana se realiza por medio de métodos
convencionales basados en las características fenotípicas, puesto que su
realización y coste los hace más asequibles.
En el proceso de identificación bacteriana tradicional, la experiencia del
microbiólogo es fundamental para la elección de una prueba o una batería de
pruebas de forma secuencial en función de la fiabilidad de las mismas, del género
o de la especie bacteriana que se pretende identificar, del origen del aislado
bacteriano, así como del coste de las mismas. Los laboratorios deben elaborar y
realizar un proceso de identificación normalizado en su actividad diaria, que
utilice de forma secuencial o simultánea un conjunto de pruebas cuyo propósito
final sea la identificación del microorganismo a nivel de género y especie, y que
incluya la mayoría de las bacterias desde el punto de vista infeccioso.

2.2. PRUEBAS BIOQUÍMICAS, DIFERENCIANDO

1) Pruebas que se utilizan en la identificación preliminar y con lectura inmediata
como la catalasa y oxidasa; 2) otras pruebas rápidas, con lectura en menos de 6h
tal y como la hidrólisis del hipurato, la β-galactosidasa (ONPG), las
aminopeptidasas, la uresa y el indol; 3) pruebas lentas, con lectura de 18 a 48h
que incluirían la óxido-fermentación, reducción de nitratos, rojo de metilo, Voges-
Proskauer, Agar hierro de Kligler, fermentación de azúcares, hidrólisis de la
esculina, coagulasa, fenilalanina-desaminasa, DNasa, hidrólisis de la gelatina,
decarboxilasas, lipasa, lecitinasa, utilización de citratos, utilización de malonato,
y prueba de CAMP entre las más frecuentes, y 4) pruebas basadas en caracteres
de resistencia a ciertas sustancias tal y como optoquina, bacitracina, solubilidad
en bilis, y crecimiento en caldo hipersalino.
Destacar que existen en el mercado numerosos sistemas o equipos multipruebas
con el fin de conseguir una mayor rapidez en la identificación de algunas
bacterias. Todos exigen unas condiciones muy precisas de concentración del

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inóculo, de inoculación, de incubación y de lectura, que si no se observan pueden

dar lugar a importantes errores. Estos sistemas pueden ser manuales y
automatizados. Entre ellos:

2.3. SISTEMAS COMERCIALES MANUALES O GALERÍAS

MULTIPRUEBAS

Se trata de celdillas aisladas con sustrato liofilizado que se inoculan

individualmente y que permiten realizar simultáneamente entre 10 y 50 pruebas
bioquímicas. Los resultados de las pruebas se expresan de forma numérica (los
resultados de las pruebas se agrupan de tres en tres, de manera que el resultado de
cada trío de pruebas queda reducido a un dígito). Cada especie está definida por
un código numérico, resultado de la codificación de las reacciones a las pruebas
que se hubieran utilizado. Para codificar el dígito de un trío de pruebas se establece
el siguiente sistema:

 Si una prueba cualquiera es negativa, se le asigna un valor de 0 (cero) a la

prueba.
 Si la primera prueba es positiva, se asigna un valor de 1.
 Si la segunda prueba es positiva, se asigna un valor de 2.
 Si la tercera prueba es positiva, se asigna un valor de 4

2.4. SISTEMAS COMERCIALES AUTOMATIZADOS

Hay en el mercado galerías multipruebas, como las descritas en el apartado

anterior pero cuya inoculación, incubación y lectura se efectúan de modo
automatizado. También hay paneles en los que además de encontrarse los sustratos
para el desarrollo de pruebas bioquímicas, se encuentran diversos antimicrobianos
a distintas concentraciones, con lo que se realiza simultáneamente la
identificación y antibiograma del microorganismo objeto de estudio. Existen

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distintos paneles para distintos grupos de microorganismos. La inoculación y la

lectura de estos paneles se suele hacer de forma automática, incorporándose los
datos obtenidos en un ordenador, el cual proporciona con un índice alto de
fiabilidad la identificación del microorganismo.

Estos son algunos de los sistemas en paneles comerciales más extendidos

disponibles en el mercado: MicroScan, Vitek, ATB, Pasco, Wider, Phoenix, etc.

III. OBJETIVO:
1.1. OBJETIVO GENERAL
 Aprender las técnicas de la identificación del microorganismo

 1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Utilizar los medios apropiados para la identificación y aislamiento
bacteriológico.

IV. MATERIALES Y METODOS:

4.1. MATERIALES:
 Muestra de agua de albañal
 Muestra de heces de animales
 Muestras de alimentos
 Placas de Petri
 Tubos de ensayo
 Asa bacteriológica.
 Probeta de 100 ml.
 2 Mechero de ron.
 Estufa
 Matraz 250 ml.
 Papel craf
 Pavilo

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4.2.EQUIPOS DE LABORATORIO:
 Autoclave
 Balanza analítica
 Incubadora bacteriológica

4.3. AGARES

 Agar Nutritivo
 Agar Mc. Conkey
 Agar SS
 Medio TSI
 Medio LIA
 Medio citrato

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4.3. METODO.

4.1. PROCEDIMIENTO:

4.1.1. Preparación de Medio SIM.

 Pesamos 7.24gr. en la balanza analítica, medimos 200ml de agua destilada
en la probeta para poder mesclar el Medio SIM.
 Echamos en agua destilada 200ml y el Medio SIM 7.24gr. al matraz.

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 Luego hacemos calentar en la estufa eléctrica hasta el punto de ebullición

realizando movimientos de vaivén par a poder homogenizar la muestra.

4.1.2. Preparación de Medio Citrato.

 Pesamos 4.34gr. en la balanza analítica, medimos 200ml de agua destilada

en la probeta para poder mesclar el Medio Citrato.
 Echamos en agua destilada 200ml y el Medio citrato 4.32 gr. al matraz,
 Luego hacemos calentar en la estufa eléctrica hasta el punto de ebullición
realizando movimientos de vaivén para poder homogenizar la muestra.

4.1.3. Preparación del Medio LIA.

 Pesamos 6.912gr. en la balanza analítica, medimos 200ml de agua

destilada en la probeta para poder mesclar el Medio LIA.
 Echamos en agua destilada 200ml y el Medio LIA 6.912 gr. al matraz,
 Luego hacemos calentar en la estufa eléctrica hasta el punto de ebullición
realizando movimientos de vaivén para poder homogenizar la muestra.

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4.1.4. Preparación del Agar TSI.

 Pesamos 12.92gr. en la balanza analítica, medimos 200ml de agua

destilada en la probeta para poder mesclar el Agar TSI.
 Echamos en agua destilada 200ml y el Agar TSI 12.92gr. al matraz,
 Luego hacemos calentar en la estufa eléctrica hasta el punto de ebullición
realizando movimientos de vaivén para poder homogenizar la muestra.

4.2.1 AISLAMIENTO DE ESCHERICHIA COLI

 Lavamos los frascos de penicilina y tubos de ensayo con detergente y

alcohol y secamos.

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 Echamos 2.5ml aprox. el Medio Sim con una pipeta en los frascos de vidrio
y con el mechero esterilizamos, tapamos con algodón en forma de corchos
la boca del frasco.

 En una lata ponemos los frascos con el medio SIM, forramos con papel
craf, pavilo y rotulamos para poder llevarlo al autoclave a 121 ºC por 10
min, así nuestro medio este esterilizados y tener buenos resultados en
nuestra siembra.

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 Una vez terminado la esterilización en el autoclave procedemos a retirar la

lata con contenido de frascos del Medio SIM, Agar TSI, Medio Citrato y
Medio LIA.

 Los 3 tubos que vamos a sembrar con la asa bacteriológica pinchamos hasta
el medio luego al retirar en la superficie sembramos por el método de estria
y en el frasco solo pinchamos.

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 Esterilizamos el lugar de trabajo (mesa) con alcohol y algodón.

 Sacamos con la asa bacteriológica de la placa Petri que tiene el Agar Mc.
Conkey que tiene Escherichia coli (bacterias),

 Primer tubo, tenemos el Agar TSI de color rojo, esterilizamos la asa

bacteriológica al rojo vivo con ayuda del mechero y sacamos de una colonia
de la placa Petri y sembramos en el primer tubo que tiene el agar TSI,
pinchamos hasta el medio y al retirar en la superficie sembramos por el
método de siembra estria.

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 Segundo tubo, tenemos el Medio Citrato de color verde , esterilizamos la

asa bacteriológica al rojo vivo con ayuda del mechero y sacamos de la
misma colonia que sacamos para el primer tubo de la placa Petri y
sembramos en el Medio Citrato, pinchamos hasta el medio y al retirar en
la superfici e sembramos por el método de siembra estria.

 Tercer tubo, tenemos el Medio LIA de color morado, esterilizamos la asa

bacteriológica al rojo vivo con ayuda del mechero y sacamos de la misma
colonia que sacamos para el primer tubo de la placa Petri y sembramos en
el Medio LIA, pinchamos hasta el medio y al retirar en la superficie s
embramos por el método de siembra estria.

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 En el frasco , tenemos el Medio SIM de color amarillo, esterilizamos la

asa bacteriológica al rojo vivo con ayuda del mechero y sacamos de la
misma colonia que sacamos para el primer tubo de la placa Petri y
sembramos en el Medio SIM, pinchamos ha sta el medio

 Llevamos a la incubadora bacteriológica por 37 ºC por 24 horas

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III. RESULTADOS:

Medio TSI:
el color rojo en la superficie y
fondo indica alcalinidad y que no
hubo fermentación , fue negativo

Medio Citrato.
Se observa un cambio de color a
azul tenue en la superficie, sin
embargo, al ser una parte color
verde se considera negativo la
presencia de citrato permeasa

Medio LIA.

La superficie y el fondo violeta

indican que es positivo en
descarboxilación de lisina;
negativo en desaminación de
lisina y en producción de ácido
sulfhídrico.

Medio SIM.
No hay movilidad, el color indica
que no hay producción de H2S,
Agregamos 2 gotas de reactivo de
covar no hay producción de indol.

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IV. DISCUSIÓN O COMENTARIOS:

Sería de gran importancia tener en el laboratorio, un equipamiento

imprescindible es contar con un espectrómetro de masas MALDI-TOF o
MALDI-Biotyper, que permite la identificación rápida de microorganismos
mediante la comparación del espectro proteico de los microorganismos frente
a una amplia base de datos.

También se hace necesario dominar las técnicas de secuenciación de ADN y

de identificación molecular, así como de caracterización y tipificación a nivel
de cepa, utilizando técnicas como la REP-PCR. (CUBILLOS, D. (2009).

V. CONCLUSIÓN:
Al concluir la práctica se concluyó en lo siguiente: Las pruebas bioquímicas
realizadas a los microorganismos que tenía escherichia coli nos ayudaron a
identificar sus diferentes características fisiológicas, pudiendo determinar así
su identidad

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VI. BIBLIOGRAFÍA:
 COWAL ST, Cowal y Steels 1974. Manual de identification bacteriana,
2da Edicion. Editorial press, Cambridge , Inglaterra.
 CUBILLOS, D. (2009). Aislamiento, identificación y serotipicación de
enterobacterias,1ra Edicion, Editorial E.B.T.R., Villavicencio Colombia.
 GRASSINI, Luis. 1967. Microbiología Agraria. UCV-Facultad de
Agronomía. Caracas-Venezuela.
 Ingraham, J. (1998). Introduccion a la microbiologia. Editorial Reverte
Barcelona, España.
 Evangeline Olivas E, Manual de practica de Microbiología 1ª edición,
Editorial D.R. Ciuda de Juarez, Mexico.

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VII. ACTIVIDAD:
Averiguar sobre las pruebas utilizadas para la identificación de
microorganismos (TSI, LIA, SIM y otros)

PRUEBAS BIOQUÍMICAS • Citrato • Ureasa • Voges-Proskauer • Rojo de

metilo • Sulfuro Indol Movilidad (SIM) • Movilida, Indol, Ornitina (MIO) •
Triple azúcar Herro (TSI) • Agar Lisina Hierro (LIA)

COLOR: VERDE INDICADOR: AZUL DE BROMOCRESOL

SUSTRATO PRINCIPAL: CITRATO DE SODIO

PRINCIPIO
Es una sal del ácido cítrico. Algunas bacterias pueden obtener energía de
fuentes distintas de la fermentación de los hidratos de carbono, con el citrato
como única fuente de carbono.
La medición de esta característica es importante para identificar muchos
miembros de la familia Enterobacteriaceae. Cualquier medio usado para
detectar la utilización del citrato por las bacterias que se van a probar debe
carecer de proteínas e hidratos de carbono como fuente de carbono.

La utilización del citrato por la bacteria que se va a probar se detecta en el

medio de citrato por la producción de subproductos alcalinos.
El medio contiene citrato de sodio, que es un anión, como única fuente de
carbono, y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias
que pueden utilizar el citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de
amonio, con producción de amoniaco (NH+), lo que produce la
alcalinización del medio por conversión del NH a hidróxido de amonio
(NH4OH).

El indicador es el azul de bromotimol, que es amarillo por debajo de pH 6 y

azul por encima de pH 7,6.

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MEDIO DE CULTIVO
El medio para citrato utilizado con mayor frecuencia es la fórmula de
Simmons. El medio se coloca en tubos inclinados (agar en pico de flauta).
La fórmula del medio de citrato de Simmons es la siguiente: • Fosfato de
amonio dihidrogenado 1 g • Fosfato dipotasico 1 g • Cloruro de sodio 5 g •
Citrato de sodio 2 g • Sulfato de magnesio 0 ,20 g • Agar 15 g • Azul de
bromotimol 0 ,08 g • Agua destilada 1 L • pH final = 6,9

PROCEDIMIENTO
Se toma una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento
primario y se siembra en forma de estría única en el pico de flauta (agar
inclinado) del tubo de agar citrato. El tubo se incuba a 35 °C durante 24 a 48
horas.
RESULTADOS
La prueba positiva está representada por la producción de color azul oscuro
en el término de 24 a 48 horas, que indica que el microorganismo en prueba
ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con formación de
productos alcalinos.
• La prueba también puede considerarse positiva sin que haya color azul, si
hay desarrollo visible en la estría de siembra. Esto es valido porque para que
el desarrollo sea visible, el microorganismo debió haber ingresado en la fase
logarítmica de crecimiento, lo que solo es posible si ha asimilado carbono y
nitrógeno.
Microorganismos Positivos • Salmonella • Arizona • Citrobacter •
Enterobacter • Klebsiella • Serratia licuefaciensis • Pseudomonas cepacia
Microorganismos Negativos • Edwarsiella • Yersinia enterocolítica •
Escherichia coli • Shigella • Yersinia pseudotuberculosis • Otras especies de
Moraxella • Proteus morganii Ureasa
COLOR: ROSADO INDICADOR: ROJO FENOL SUSTRATO
PRINCIPAL: UREA
PRINCIPIO
Es una diamida del acido carbónico Todas las amidas se hidrolizan
fácilmente, con liberación de amoniaco y dióxido de carbono. El amoniaco

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reacciona en solución para formar carbonato de amonio, lo que produce

alcalinización y aumento de pH del medio.
MEDIOS DE CULTIVO
Los dos medios utilizados con mayor frecuencia son el caldo urea de Stuart
y el agar urea de Christensen
CALDO UREA DE STUART AGAR UREA DE CHRISTENSEN Extracto
de levadura 0,1 g Peptona 1 9 Fosfato monopotasico 9,1 g Glucosa 1 g
Fosfato disodico 9,5 g Cloruro de sodio 5 g Urea 20 g Fosfato monopotasico
2 g Rojo fenol 0,01 g Urea 20 g Agua destilada 1 L Rojo fenol 0 ,012 g Agar
15 g Agua destilada 1 L pH final = 6,8 pH final = 6,8
PROCEDIMIENTO
El medio liquido se siembra con un ansa de cultivo puro del microorganismo
por probar. La superficie inclinada del agar (pico de flauta) se siembra en
estría con el microorganismo por probar. Ambos medios se incuban a 35 °C
durante 18 a 24 horas.
RESULTADOS
Los microorganismos que hidrolizan la urea rápidamente pueden producir
reacciones positivas en l o 2 horas; las especies menos activas pueden
requerir 3 días o mas. Las reacciones son las siguientes:

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