Science - Abb3634 SM

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Materiales complementarios para
Una bacteria de un centímetro de largo con ADN contenido en orgánulos unidos

a la membrana metabólicamente activos
Jean-Marie Volland et al.
Autores para correspondencia: Jean-Marie Volland, jvolland@lbl.gov; Olivier Gros, Olivier.Gros@univ-antilles.fr; Tanja Woyke,
twoyke@lbl.gov; Shailesh V. Fecha, shailesh.date@lrc.systems
Ciencia 376, 1453 (2022)

DOI: 10.1126/ciencia.abb3634
El archivo PDF incluye:
Materiales y métodos Texto

complementario Figs. S1 a
S20 Tablas S1 a S7
Referencias
Otro material complementario para este manuscrito incluye lo siguiente:
Mesas S8 a S11
Películas S1 a S6
Lista de verificación de reproducibilidad de MDAR
Materiales y métodos
Muestreo
Se recolectaron muestras de bacterias grandes del azufre (LSB) de un ambiente de manglares marinos (temperatura ambiente
28°C) en “La manche à eau” en Guadalupe, Antillas Menores, en un sitio (16°16'40”N, 61°33 28"W) (47). Se tomaron muestras
a mano de hojas hundidas de Rhizophora mangle que contenían LSB de la capa superficial del sedimento (aprox. 1 m de
profundidad). Las muestras vivas de LSB se procesaron dentro de 1 h después de la recolección bajo un microscopio de
disección. Luego, las muestras se lavaron con agua de mar filtrada a 0,22 ÿm antes de usarlas para experimentos moleculares.
Las bacterias individuales se fijaron a 4 °C durante 4 horas en paraformaldehído al 4 % en agua de mar estéril o en glutaraldehído
al 2,5 % en tampón de cacodilato 0,1 M (pH 7,2), que se hizo isoosmótico (900 mOsmoles) con agua de mar mediante la adición
de de cloruro de sodio y cloruro de calcio. Las muestras se almacenaron a 4°C hasta su análisis.
microscopía de luz
Las muestras se observaron vivas o fijadas bajo microscopios estereoscópicos estándar. Si corresponde, se fusionó una serie
de imágenes capturadas a diferentes distancias de enfoque utilizando el software de apilamiento de enfoque Helicon Focus® (Fig.
S1). Las muestras fijadas también se observaron utilizando un microscopio óptico Axio Observer.D1 (Carl Zeiss, Jena, Alemania)
equipado con una cámara de alta resolución en blanco y negro (AxioCam MRm, Carl Zeiss, Jena, Alemania).
Análisis ultraestructural
Para el análisis SEM convencional, las muestras se enjuagaron brevemente en el tampón de cacodilato y luego se deshidrataron
a través de una serie de acetona graduada antes de secarse bajo CO2 utilizando una máquina secadora de punto crítico (EM
CPD300, Leica). A continuación, las muestras se recubrieron con oro (Sputter Coater SC500, BioRad) antes de observarlas a 20
kV con un microscopio electrónico de barrido FEI Quanta 250.
Para el análisis de microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM), los filamentos bacterianos prefijados se lavaron
dos veces en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M para eliminar los aldehídos antes de la fijación en tetróxido de osmio al 1%
durante 45 min a temperatura ambiente. Luego, las muestras se enjuagaron con agua destilada y se fijaron posteriormente con
acetato de uranilo acuoso al 2 % durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados con agua destilada, cada
muestra se deshidrató mediante una serie graduada de acetona y se incrustó en Epon-Araldite según Glauert (1975).
(48). Las secciones delgadas (60 nm de espesor) se tiñeron para el contraste durante 30 min en acetato de uranilo acuoso al
2% antes del examen con un Quanta 250 (FEI - Modo STEM).
Para las observaciones de microscopía electrónica de transmisión (TEM), las muestras fijadas con glutaraldehído se lavaron en
un tampón de cacodilato y se fijaron posteriormente con tetróxido de osmio como se describe anteriormente. Luego se
crioinmovilizaron utilizando un congelador de alta presión BAL-TEC HPM 010 y luego se colocaron en un congelador de sustitución.
medio hecho de tetróxido de osmio al 1 %, acetato de uranilo al 0,1 % y 5 % de ddH2O en acetona. Las muestras se sustituyeron
por congelación siguiendo el procedimiento súper rápido descrito en McDonald (2011) (49). El medio de sustitución se lavó con
acetona pura y las muestras se infiltraron e incluyeron planamente en resina Epon Araldite como se describe en Müller-Reichert
et al. (2003) (50). Se montaron secciones finas de 70 nm en rejillas de ranuras recubiertas de formvar y se tiñeron durante 4 min
en acetato de uranilo al 2 % seguido de 4 min en citrato de plomo de Reynolds. Las rejillas de las ranuras se observaron con un
FEI Tecnai 12 o un Jeol 1400FLASH TEM. Los montajes se adquirieron de forma manual o automática mediante el software
SerialEM. Las imágenes de mosaico se ensamblaron manualmente usando GIMP, o con el programa Etomo de la suite Imod
(51), o con el software Image Composite Editor (Microsoft), o con el paquete FIJI en ImageJ (52). Las medidas morfométricas se
realizaron utilizando FIJI. El grosor medio del citoplasma se obtuvo a partir de 118 medidas realizadas en
secciones de tres celdas diferentes (celda 1: n = 51; celda 2: n = 17; celda 3: n = 50). El diámetro promedio de los gránulos de azufre
elemental se obtuvo a partir de 338 mediciones realizadas en secciones de tres celdas diferentes (celda 1: n = 103; celda 2: n = 31; celda
3: n = 204). El diámetro promedio de los pepinos se obtuvo a partir de 92 mediciones realizadas en secciones de cinco celdas diferentes
(celda 1: n = 8; celda 2: n = 29; celda 3: n = 20; celda 4: n = 5; celda 5: n = 30).
Análisis elemental
La composición elemental de las muestras completamente hidratadas se analizó utilizando un microscopio electrónico de barrido
ambiental (ESEM). El paso de deshidratación se evitó porque el azufre elemental S8 es soluble en alcohol y acetona. Las muestras
se fijaron en glutaraldehído al 2,5% en agua de mar y se mantuvieron en la misma solución hasta su examen. Las muestras
simplemente se lavaron rápidamente en agua destilada para eliminar las sales y luego se introdujeron en un ESEM (FEI Quanta
FEG) bajo una presión de 650 Pa. Los estudios de ESEM se llevaron a cabo utilizando varios voltajes de aceleración para revelar la
presencia de azufre en las muestras, así como como su morfología. Usamos 1) 15 kV para imágenes de electrones retrodispersados
(contraste Z) y espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (análisis y mapeo elemental) y 2) 3 kV para imágenes de electrones
secundarios (morfología de la muestra).
Microscopía de escaneo láser confocal (CLSM)
Ca fijado en paraformaldehído. Las células de T. magnifica (n = 8) se lavaron tres veces en agua de mar estéril, se deshidrataron mediante
una serie ascendente de etanol (para disolver los gránulos de azufre elemental) y se rehidrataron mediante una serie descendente de
etanol. Las células individuales se transfirieron a portaobjetos de vidrio equipados con Gene Frame (Thermofisher) para evitar aplastar las
células con los cubreobjetos. El marcaje de la membrana de las células se llevó a cabo utilizando el tinte lipofílico FM 1-43x (Molecular
Probes, Eugene, OR, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN se marcó con DAPI (diclorhidrato de 4',6-diamidino-2-
fenilindol; Millipore Sigma) siguiendo el protocolo del fabricante. Tomamos imágenes de 8 células en un microscopio Zeiss LSM 710
mediante la adquisición de múltiples imágenes de pila Z superpuestas (mosaicos) con el software Zen (Zeiss). De estas 8 celdas, se
tomaron imágenes de 6 en toda su longitud (celdas F a K, consulte la Tabla S2) y se usaron para confirmar la naturaleza de una sola
celda de los filamentos, medir parámetros morfométricos precisos (longitud, diámetros mínimo y máximo) y evaluar nivel de poliploidía
para uno de ellos. Se tomaron imágenes de las 2 celdas restantes solo parcialmente (celdas L y M, consulte la Tabla S2) y se usaron
exclusivamente para evaluar el nivel de poliploidía mediante el conteo de grupos de señales DAPI. Como controles positivos, seguimos el
mismo protocolo y preparamos filamentos multicelulares de la cianobacteria Microcoleus vaginatus de un cultivo puro, filamentos similares
a Beggiatoa recolectados en un manglar de Guadalupe y filamentos similares a Marithrix recolectados en el respiradero hidrotermal de
White Point Beach (53, 54). ) (Fig. S4; Película S4). Todos los conjuntos de datos 3D se importaron al software ORS Dragonfly para la
unión, la representación 3D y los análisis morfométricos y/o análisis de poliploidía. Tres celdas observadas en su totalidad con alta
resolución lateral (celdas F, G y H) se segmentaron utilizando la herramienta de aprendizaje profundo ORS Dragonfly y herramientas de
segmentación manual. Se midieron volúmenes precisos de la vacuola central y el citoplasma (ver Tabla S2).
Tomografía computarizada de rayos x duros
Utilizamos tomografía computarizada de rayos X duros para visualizar seis células en tres dimensiones con resolución isotrópica. Se
observaron cuatro células en su totalidad y dos solo parcialmente (ver Tabla S2).
California. Células de T. magnifica fijadas con glutaraldehído y posfijadas con tetróxido de osmio, como se describió anteriormente, se
lavaron tres veces en agua de mar estéril, se deshidrataron mediante series ascendentes de etanol y se almacenaron en etanol al 70 % a
4 °C. Antes del análisis, las células se volvieron a hidratado e inmovilizado dentro de capilares de plástico con 1 % de agarosa de bajo
punto de fusión. Después de sellar los capilares en ambos extremos, los pegamos en la cabeza de un alfiler de costura y los fotografiamos
en un microscopio de rayos X Zeiss Xradia 520 Versa. Los detalles técnicos de cada escaneo se proporcionan en la Tabla S1. Las
tomografías computarizadas fueron reconstruidas utilizando el software Zeiss y más
importado en el software ORS Dragonfly para unir los mosaicos, segmentación y análisis. Se observaron cuatro celdas
en su totalidad (celdas A, B, D y E), tres de las cuales se segmentaron utilizando la herramienta de aprendizaje
profundo ORS Dragonfly y las herramientas de segmentación manual. Se midieron volúmenes totales precisos de las
células y para una de ellas (celda D) también se midieron los volúmenes del citoplasma y la vacuola central (ver Tabla
S2).
Hibridación fluorescente in situ (FISH) y correlación TEM
Las células fijadas con paraformaldehído (n = 4) se lavaron en agua de mar antes de la deshidratación a través de una
serie ascendente de etanol. Luego infiltramos las células con resina LR-White de grado medio. Las células incrustadas
de LR-White se polimerizaron a 40 °C en condiciones anaeróbicas durante tres días. Analizamos con FISH un total de
84 secciones semidelgadas (500 nm), provenientes de 7 áreas diferentes analizadas por triplicado dentro de cada una
de las cuatro celdas. Las secciones se montaron en portaobjetos de vidrio para microscopio recubiertos con PTFE
(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) y se analizaron con FISH. Se prepararon algunas secciones delgadas
consecutivas (70 nm) para TEM correlativo como se describe en la sección de análisis ultraestructural. La solución de
hibridación FISH (0,9 mol L-1 NaCl, 20 mmol L-1 Tris/HCl pH 8,0, 0,01 % SDS, 10 % formamida) se aplicó a la sección
en una gota de 20 µL que contenía 0,5 µM de cada sonda de oligonucleótidos. La hibridación se realizó en cámara
húmeda a 46°C durante 3 h. El lavado se realizó en condiciones estrictas a 48 °C durante 15 min (55). Usamos una
combinación de una mezcla de sonda eubacteriana (EUB338 Alexa Fluorÿ 488 con una sola etiqueta) (56), una sonda
de gammaproteobacteria general (Gam42a Cy3 con doble etiqueta) (55), una sonda competidora sin etiqueta (BET42a)
(55) y un género -Sonda de Thiomargarita específica (Thm482, Cy5 doblemente marcada) (57). También se aplicaron
sondas sin sentido (Non-EUB) (58) marcadas en Cy3 y Cy5 a todos los portaobjetos para controlar las señales
positivas falsas debido a la autofluorescencia o la unión de sonda no específica, pero no se observaron señales en estos controles.
Montamos los portaobjetos FISH con solución antidecoloración CitiFluor AF1 Plus DAPI (Electron Microscopy Sciences,
Hatfield, PA). Las micrografías se tomaron con un objetivo de inmersión en aceite de 63x en un microscopio de
epifluorescencia invertido (Axio Observer.D1, Carl Zeiss, Jena, Alemania) equipado con una cámara de alta resolución
en blanco y negro (AxioCam MRm, Carl Zeiss, Jena, Alemania) . Las imágenes FISH se superpusieron con sus
correspondientes observaciones TEM en el software GIMP.
inmunohistoquímica
Se usaron células fijadas con paraformaldehído (n = 4) incrustadas en resina LR-White como se describió anteriormente
para FISH para el inmunomarcaje de ATP sintasa. Secciones semidelgadas (500 nm) se sumergieron en una solución
de bloqueo (PBS1X, albúmina de suero bovino al 3 %) antes de la incubación con el anticuerpo primario (anti-ATP
sintasa subunidad ÿ, clon IgG1 de ratón 3D5, dilución 1:10, Invitrogen) a 37ºC. ºC durante 2 horas. Después del
procedimiento de lavado, las secciones se incubaron con anticuerpo secundario marcado con Cy5 (IgG anti-ratón de
cabra, dilución 1:20, Invitrogen) durante 2 h a 37 °C y se contrastaron con DAPI (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA).
Los controles negativos se realizaron omitiendo el anticuerpo primario y no mostraron señal. Se realizaron tres
experimentos independientes para los cuales se muestran imágenes representativas en las Figs. 2K-M y S20.
Marcado de aminoácidos bioortogonales no canónicos (BONCAT)
Las células vivas se recogieron recientemente de manglares y se aislaron de su sustrato de hojas muertas. Luego se
transfirieron a viales de vidrio cerrados y se incubaron durante 24 horas en agua de mar sulfurosa (100 µM de H2S en
0,2 µm de agua de mar natural filtrada) suplementada con 50 µM de l-homopropargilglicina (HPG), un análogo
seleccionable de la l-metionina. Los controles negativos se incubaron de la misma manera pero omitiendo el HPG. La
incubación se detuvo mediante tres lavados en agua de mar estéril. La mezcla de reacción clic se preparó fresca cada
vez mezclando 18,23 µl de la premezcla de tinte (CuSo4 100 µM, tris-hidroxipropiltriazolilmetilamina 500 µM, AZDye
488 Azide 5 µM) con 980 µl del tampón de reacción (ascorbato de sodio 5 mM, aminoguanidina HCl 5 mM en PBS
2,5X). Todos los reactivos se adquirieron de Click Chemistry Tools (Click
Herramientas químicas, Scottsdale, AZ, EE. UU.). Las células se incubaron en la mezcla de reacción click durante 1 hora y se lavaron
(3x5 min) en PBS 2,5X antes de observarlas con un microscopio LSM TCS SPE Leica. Se observaron un total de 12 células de tres
experimentos diferentes luego de tres muestreos, mostrando patrones fluorescentes consistentes. Se incluyeron controles negativos para
cada experimento y no mostraron ningún etiquetado.
Mediciones de sulfuro
Las hojas hundidas con células alargadas adheridas se llevaron al laboratorio y se colocaron en un mesocosmo montado el día anterior
a la medición para simular su entorno de manglar. Las muestras se tomaron del campo el día de la medición. Las mediciones de sulfuro
se realizaron utilizando microsensores H2S100 (Unisense®) conectados a un micromanipulador (tipo MD4 Rechts, Märzhäuser®). Un
microsensor se colocó en la columna de agua 5 cm por encima de las células bacterianas y el otro se colocó en el medio del "ramo" de
LSB adherido a una hoja sumergida de Rhizophora mangle. Las mediciones se registraron cada 30 s utilizando el software SensorBasic®.
Las calibraciones se realizaron de acuerdo con las instrucciones de Unisense®. El pH se midió con una sonda autónoma (NKE), similar
a la descrita por Le Bris et al., (2001) (59), fijada al micromanipulador. Concentraciones totales de sulfuro (S2- tot= H2S+HS-
+S2- ), teniendo en cuenta el pH y la salinidad medidos utilizando un pK de 6,51 (60).
Secuenciación, ensamblaje, agrupamiento y anotación del genoma
Procesamos cinco Ca. Filamentos de T. magnifica para secuenciación genómica unicelular. Una hora después del muestreo,
diseccionamos células individuales de la hoja en descomposición y las lavamos tres veces en agua de mar estéril antes de almacenarlas
a -80°C. Descongelamos cada filamento individual e inmediatamente amplificamos el ADN genómico mediante amplificación de
desplazamiento múltiple utilizando el kit REPLI-g (Qiagen). Las bibliotecas de ADN se crearon a partir de 200 pg de ADN de cada uno de
los productos amplificados utilizando el kit de creación de bibliotecas de ADN Nextera XT (Illumina). Secuenciamos las bibliotecas de
ADN en una plataforma Illumina Nextseq High Output. Luego importamos lecturas de pares (2x150 pb) a la plataforma KBase
(www.kbase.us) (61). En KBase, usamos SPAdes (v3.13.0) para ensamblar lecturas en contigs de al menos 500 pb (usando kmers de
33, 67, 99, 125 pb). Luego, agrupamos contigs de más de 2000 pb usando MetaBAT2, lo que resultó en 2 a 6 contenedores por filamento
(consulte la Tabla complementaria 3). Solo un contenedor por filamento fue identificado taxonómicamente como Thiomargarita por la
aplicación de clasificación GTDB-Tk (v0.1.4). Para cada uno de los cinco ensamblajes, extrajimos los contigs del contenedor de
Thiomargarita y los tratamos como ensamblajes de genoma para análisis posteriores (denominados: genoma del filamento 1, genoma
del filamento 2, genoma del filamento 3, genoma del filamento 4 y genoma del filamento 5). Evaluamos las cualidades del genoma con
CheckM (v1.0.18) (Tabla S4).
Análisis del genoma
Identidades promedio de nucleótidos y dentro de la evaluación de la clonalidad del filamento
Elegimos el filamento n. ° 5 como genoma de referencia en función de sus estadísticas de ensamblaje. Calculamos las identidades de
nucleótidos promedio (ANI) por pares con FastANI. Evaluamos dentro de la clonalidad del filamento mapeando las lecturas del filamento
n.° 1, n.° 2, n.° 3 y n.° 4 en el genoma del filamento n.° 5 usando BBMap (v38.79) (https://sourceforge.net/projects/bbmap/) con el flags
minid=0.95 minaveragequality=30, y denominadas variantes (o polimorfismos de un solo nucleótido, SNP), con los scripts de BBTools
pileup.sh y callvariants.sh y las flags minreads=2 minquality=30 minscore=30 minavgmapq=20 minellelefraction=0.1.
filogenómica
Se utilizó un conjunto de 56 proteínas marcadoras universales de una sola copia (62, 63) para construir un árbol filogenético de los
ensamblajes de filamentos y genomas gammaproteobacterianos relacionados disponibles en la base de datos IMG/M (64).
Las proteínas marcadoras se identificaron con hmmsearch (versión 3.1b2, hmmer.org) utilizando un HMM específico para
cada uno de los marcadores. Para cada proteína marcadora, se construyeron alineaciones con MAFFT (v7.294b) (65) y
posteriormente se recortaron con BMGE (66) usando BLOSUM30. A continuación, se concatenaron los alineamientos de
proteínas individuales y se infirieron las filogenias de máxima verosimilitud con iq-tree v2.0.3 (67) utilizando el modelo
LG4X+F. El árbol se visualizó en itol (68).
Metabolismo secundario
Los genomas bacterianos se analizaron en busca de grupos de genes biosintéticos (BGC) de metabolitos secundarios
con antiSMASH v5.1.2 (69). Los datos de BGC de hongos para el sistema modelo de hongos Aspergillus nidulans se
recuperaron de antismash-db. El %BGC se calculó sumando la longitud de la secuencia de nucleótidos de cada región
BGC antiSMASH y dividiendo por el tamaño total del genoma.
Anotación del genoma y análisis funcional
California. Los genomas de T. magnifica se anotaron utilizando una tubería de anotación de genoma estructural y
funcional procariota JGI (https://img.jgi.doe.gov/docs/pipelineV5/) y cargado en la base de datos IMG/MER (64).
Se usaron asignaciones de proteínas a familias de proteínas, como Pfam v.30 (70) y KEGG v.77.1 (71) junto con las
herramientas proporcionadas por la interfaz de usuario de IMG para inferir capacidades funcionales codificadas por los
genomas y visualizar vecindarios cromosómicos de genes de interés. Las secuencias de proteínas de interés se
exportaron desde IMG/MER y las alineaciones se construyeron con MAFFT (v7.294b) (65).
Texto complementario
Evidencia de tiotrofia en Ca. T magnifica
Los manglares acumulan sedimentos finos con alto contenido orgánico. En condiciones anóxicas, las bacterias reductoras
de sulfato degradan la materia orgánica produciendo grandes cantidades de sulfuro y sustentando comunidades microbianas
quimioautotróficas (tiotróficas) que oxidan el azufre. En los manglares de Guadalupe, el sulfuro producido por el sedimento
reducido varía de 0,19 mM a 2,40 mM (9). Se difunde pasivamente al agua superpuesta donde se oxida rápidamente por el
oxígeno creando un fuerte gradiente redox en la interfaz sedimento/agua. Con el fin de caracterizar el microambiente de Ca.
T. magnifica, llevamos al laboratorio filamentos aún adheridos a hojas hundidas y sumergimos las hojas en una configuración
similar a un mesocosmo sobre sedimento de mangle reducido. Usando microsensores, medimos concentraciones altas y
relativamente estables de especies de azufre reducidas en el microambiente de los filamentos con concentraciones que
fluctúan entre 1,20 y 1,79 mM (Fig. S13), mientras que no se detectó sulfuro en el agua superpuesta.
Los experimentos de genómica y actividad de oxidorreductasa han demostrado que otras especies de Thiomargarita spp.
pueden usar especies de azufre reducido como donantes de electrones (29, 30, 72). Se sabe que las gammaproteobacterias
tiotróficas de entornos sulfurosos almacenan azufre elemental en vesículas unidas a la membrana (73, 74). Para determinar
si Ca. Los filamentos de T. magnifica muestran un metabolismo tiotrófico activo, colocamos células completamente hidratadas
ligeramente fijadas en un microscopio electrónico de barrido ambiental e interrogamos la presencia de gránulos de azufre
internos utilizando espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDXS). Las imágenes recopiladas por los detectores
de electrones secundarios y retrodispersados mostraron claramente la presencia de áreas brillantes de forma redonda de un
promedio de 2,33 ± 0,46 µm de diámetro (Fig. S13B y C). El microanálisis EDXS (Fig. S13A) y el mapeo de azufre (Fig. S13F)
muestran claramente que estas áreas son ricas en azufre y, por lo tanto, corresponden a glóbulos de azufre (también visibles
en el TEM como numerosas vesículas transparentes de electrones de 2,40 ± 1,03 µm de diámetro).
Estimación del número de copias del genoma
Analizamos en 3D tres conjuntos de datos provenientes de tres células diferentes después de que el ADN se marcara con
fluorescencia con DAPI. Visualizamos una celda completa de 2,39 mm de largo (celda H, Tabla S2), así como dos porciones
de celda de 195 µm (celda L, Tabla S2) y 660 µm (celda M, Tabla S2). Después de la segmentación de los grupos de ADN
marcados con DAPI, utilizamos la herramienta de análisis ORS Dragonfly© multi-ROI y contamos 7647, 1518 y 3910 objetos
individuales para las tres células respectivamente. El volumen de grupos de ADN individuales osciló entre 0,48 y 3511 µm3 .
Asumimos que los grupos de ADN teñidos con DAPI más pequeños, con un volumen de 0,48 µm3 , representaban una sola
copia del genoma y observamos que los grupos más grandes representaban múltiples cromosomas demasiado cerca uno del
otro para ser segmentados como objetos individuales. Por lo tanto, dividimos los grupos de ADN más grandes por el volumen
de los más pequeños (0,48 µm3 ) y estimamos el número total de copias del genoma para cada conjunto de datos. Luego
dividimos el número total de copias del genoma por la longitud de la célula analizada, lo que nos permite expresar el nivel de
poliploidía por milímetro de filamento y extrapolarlo a una célula de 20 mm de largo completamente desarrollada (ver Tabla
S2). Estimamos que Ca. Las células de T. magnifica presentan en promedio 36.880 ± 7.956 copias del genoma por milímetro
de filamento y, extrapoladas, las células de 20 mm completamente desarrolladas presentarían, por lo tanto, 737.598 ± 159.115
copias del genoma.
Investigaciones FISH
La especificidad de la sonda FISH Thm482 fue confirmada por la herramienta TestProbe de la base de datos SILVA.
Además, extrajimos todas las secuencias del gen 16S rRNA del Thiomargarita publicado
metagenoma, así como de nuestros cinco Ca. Ensambles de una sola célula de T. magnifica y confirmaron además que la sonda
Thm482 solo coincidía con la secuencia de ARNr de Thiomargarita 16S.
Las investigaciones FISH se realizaron en 4 celdas diferentes. De cada celda, secciones por triplicado de 7 ubicaciones diferentes
mostraron consistentemente los mismos resultados, ejemplos representativos de los cuales se muestran en las Figs. 2 y S7 a S9.
Descripción ampliada de Ca. Metabolismo de T. magnifica basado en el análisis del genoma
Los grandes genomas de Ca. Los filamentos de T. magnifica codificaron una amplia gama de capacidades metabólicas, algunas
únicas y otras compartidas con otras grandes bacterias oxidantes de azufre. Estaba presente una vía de glucólisis completa, que
incluía un gen para la glucosa-6-fosfato isomerasa; se informó que este gen estaba ausente en células individuales de Ca
secuenciadas previamente. T. nelsonii (Tabla S9) (30). El ciclo del ácido tricarboxílico también está completo y puede funcionar
parcialmente en ambas direcciones debido a la presencia del complejo 2-oxoglutarato deshidrogenasa y 2-oxoglutarato-ferredoxina
oxidorreductasa, así como succinato deshidrogenasa y fumarato reductasa. También se codifican múltiples enzimas anapleróticas
(Tabla S9). California. Los genomas de T. magnifica codificaron RuBisCO forma I (Fig. S15) y otras enzimas para la fijación de
carbono a través del ciclo de Calvin-Benson-Bassham (CBB). Similar a Ca. Faltaban T. nelsonii, sedoheptulosa-1,7-bisfosfatasa y
fructosa-1,6-bisfosfatasa y es posible que hayan sido reemplazadas por una 6-fosfofructoquinasa dependiente de polifosfato (30).
Mientras Ca. Se descubrió que T. nelsonii realiza la desnitrificación o la reducción disimilatoria y asimilatoria de nitrato a amoníaco, las
únicas enzimas que se encuentran en Ca. Los genomas de T. magnifica eran nitrato reductasas disimilatorias/respiratorias, Nar y Nap.
Aunque había genes que codificaban proteínas similares a NorD y NorQ, proteínas accesorias de la óxido nítrico reductasa, faltaban
sus subunidades catalíticas NorCB, y también genes que codificaban nitrato reductasa asimilatoria, ambos tipos de nitrito reductasa
(NirBD y NirS) y óxido nitroso reductasa . En cambio, estaba presente un conjunto completo de subunidades de ureasa (Tabla S9).
Esto sugiere que Ca.
T. magnifica probablemente obtiene amoníaco para el crecimiento de fuentes orgánicas, mientras que el nitrato se usa exclusivamente
como aceptor de electrones.
Al igual que otras grandes bacterias oxidantes de azufre, Ca. Los genomas de T. magnifica codificaron un conjunto de genes para la
oxidación de azufre e hidrógeno. Se encontraron genes que codifican dos hidrogenasas de Ni-Fe con un complemento de proteínas
accesorias. Tanto la sulfuro-quinona-oxidorreductasa Sqr como la flavocitocromo c sulfuro deshidrogenasa FccAB estaban presentes,
la vía disimilatoria inversa de la sulfito reductasa, así como los genes sox oxidantes del tiosulfato. Como en Ca. T. nelsonii, se insertó
un intrón catalítico del grupo I en el Ca. Gen dsrA de T. magnifica que codifica la subunidad alfa de la sulfito reductasa disimilatoria
(29). California. Los genomas de T. magnifica codificaron una cadena de transporte de electrones respiratoria ramificada, que incluía
NADH deshidrogenasa, succinato deshidrogenasa, ubiquinol-citocromo c reductasa, citocromo c oxidasa de tipo cbb3 y citocromo d
ubiquinol oxidasa, así como heterodisulfuro reductasa y complejo Rnf transportador de sodio . Los genomas también codificaron
ATPasas de tipo F y tipo V.
Además de los sistemas de secreción bacterianos comunes, un sistema de secreción tipo VI (T6SS) estaba presente en todas las
Ca. Los genomas de T. magnifica (Tabla S10) y algunos de sus componentes se encontraron en Ca. T. nelsonii.
A menudo se encuentra en patógenos bacterianos, este sistema de secreción es análogo a las colas contráctiles
de los bacteriófagos y se sabe que media en la muerte dependiente del contacto de las células vecinas a través de la entrega
intracelular de efectores tóxicos (75). T6SS consta de un tubo interno compuesto de proteína Hcp cubierta con VgrG y proteínas
que contienen repeticiones de prolina-alanina-alanina-arginina (PAAR) rodeadas por una vaina hecha de heterodímeros TssB/TssC
(también conocido como ImpB/ImpC o VipB/VipC) . Otros componentes de T6SS incluyen un complejo transmembrana compuesto
por tres subunidades, TssJ/TssL/TssM (también conocido como ImpJ/ImpK/ImpL) y una placa base, que está conectada al complejo
transmembrana y sirve como un
plataforma para la polimerización de tubos interiores y fundas. El proceso de inyección presumiblemente comienza
con la reorganización de los componentes de la placa base que conduce a la contracción de la vaina, la apertura de la
placa base y la liberación del tubo interior y su carga útil en la celda objetivo. Los efectores T6SS conocidos incluyen peptidoglicano
hidrolasas, fosfolipasas, nucleasas, ADP-ribosiltransferasas y proteínas formadoras de poros (76); sin embargo, la gran mayoría
de los efectores T6SS siguen siendo desconocidos. Algunos de ellos se pueden identificar en función de la presencia del dominio
VgrG o PAAR en su extremo N, mientras que otros se caracterizan por la presencia de otros motivos característicos, como puntos
críticos de reordenamiento (RHS), repeticiones YD, motivos MIX y motivos FIX ( 77). Ninguno de los efectores T6SS conocidos
fue inmediatamente reconocible en Ca. genomas de T. magnifica; sin embargo, estos genomas codificaron entre 8 y 22 proteínas
repetidas RHS/YD (Tabla S11), en comparación con 0 a 5 en genomas estrechamente relacionados. Tres genes que codifican
proteínas RHS se ubicaron cerca del componente vgrG de T6SS. La gran variabilidad del recuento de proteínas RHS en Ca. T.
magnifica puede representar una variación natural en la población o, alternativamente, ser un artefacto de ensamblaje debido a
la longitud y la naturaleza repetitiva de estas proteínas. Es probable que T6SS encontrado en Ca. Los genomas de Thiomargarita
confieren una ventaja competitiva en el curso del conflicto interespecífico e intraespecífico.
Entre las familias de proteínas, que han experimentado una importante expansión en Ca. T. magnifica, hubo múltiples
familias asociadas con reordenamientos del genoma, incluidos elementos genéticos móviles, intrones y recombinasas específicas
del sitio. California. Las células individuales de T. nelsonii poseen las mismas características genómicas (29, 30). Además, ca.
Los genomas de T. magnifica estaban plagados de una miríada de sistemas de toxina/antitoxina (Tabla S11).
Si bien algunos de estos sistemas pueden estar involucrados en el mantenimiento del material genético, como los elementos
genéticos móviles, otros pueden desempeñar funciones reguladoras en la respuesta al estrés, la adaptación y contribuir al
complejo estilo de vida (78).
La expansión de otras familias de proteínas también se ha atribuido a cambios morfológicos y de estilo de vida complejos:
además de las metacaspasas (PF00656) descritas por Flood et al., 2016 (29), estas incluyen múltiples copias del dominio
de proteína quinasa (PF00069) y otra familia de peptidasas y derivados inactivados denominados CHAT (PF12770) (79).
Curiosamente, casi un tercio de los dominios de caspasa están asociados con otro dominio altamente representado en
exceso, llamado FGE-sulfatasa (PF03781). De manera similar, casi un tercio de los dominios de proteína quinasa están asociados
con FGE-sulfatasa. Se sabe que este dominio genera formilglicina, que es el residuo catalítico de las sulfatasas, y la inactivación
de una enzima humana generadora de formilglicina SUMF1 conduce a una deficiencia múltiple de sulfatasa (80). En bacterias
caracterizadas, los representantes de esta familia son las oxidorreductasas EgtB y OvoA dependientes de hierro (II) que catalizan
la formación de enlaces CS en la biosíntesis de ergotioneína y ovotioles (81). Una de las proteínas de la familia FGE-sulfatasa en
Ca. T. magnifica es probablemente una proteína OvoA bifuncional con sulfóxido de 5-histidilcisteína
actividades sintasa y mercaptohistidina metiltransferasa. Sin embargo, la función de más de cien copias de un gen que
codifica FGE-sulfatasa en estos genomas no está clara. Algunas copias de un gen que codifica una sulfatasa predicha
(PF00884) estaban presentes en Ca. Los genomas de Thiomargarita, pero su abundancia no fue suficiente para explicar la
expansión de la familia FGE-sulfatasa. Dada su asociación con otros dominios implicados en el ciclo de vida complejo y la
morfología celular, planteamos la hipótesis de que la familia de sulfatasas FGE en Ca. Thiomargarita también está involucrada
en estos procesos.
Otra característica notable de Ca. T. magnifica fue un reordenamiento significativo de los genes centrales involucrados
en la división celular y la morfogénesis. Mientras que estaban presentes todos los genes necesarios para la biosíntesis y
exportación de monómeros de peptidoglicanos unidos a lípidos (Tabla S8), faltaban muchas proteínas de división celular centrales
involucradas en el ensamblaje y la regulación del anillo Z. De los principales componentes del anillo Z, solo se encontró una
proteína citoesquelética FtsZ; la proteína FtsA, que une FtsZ a la membrana, y la proteína ZipA que interactúa con FtsZ y las
peptidoglucano sintasas de división esencial estaban ausentes. FtsZ es parte del operón dcw ("división y pared celular") bien
conservado, que en la mayoría de las otras bacterias oxidantes de azufre grandes también incluye FtsA y una proteína divisómica
tardía clave FtsQ junto con las enzimas de síntesis de monómero de peptidoglicano MurC, MurG y Ddl. La estructura general del
operón dcw se conservó en Ca. T. magnifica y Ca. T. nelsonii Bud S10, pero notoriamente faltaban FtsA y FtsQ (Fig. 3B).
consistente con la ausencia
de FtsA, un complejo ampliamente conservado FtsE-FtsX, que desempeña muchas funciones en la promoción del ensamblaje
del anillo Z, incluida la regulación de la dinámica de FtsA, también faltaba en Ca. Genomas de Thiomargarita. Por el contrario,
estaban presentes las proteínas ZapA y ZapD, que interactúan con FtsZ para promover el ensamblaje y la estabilidad del anillo
Z, al igual que la proteína ZapB que interactúa con ZapA.
Aún más notable, ninguna de las proteínas divisómicas tardías se encontró en Ca. Genomas de Thiomargarita.
Estos incluyen la glicosiltransferasa polimerizadora de peptidoglucanos FtsW, la transpeptidasa de peptidoglucanos FtsI
(proteína de unión a péptidos 3), un complejo de divisomas clave FtsQLB, que recluta y regula las actividades de síntesis de
peptidoglucanos, y la proteína FtsK, que une el anillo Z con los componentes del divisoma tardío (34). No podemos excluir la
posibilidad de que la falta de estas proteínas se deba a las lagunas de ensamblaje, pero el hecho de que no se haya encontrado
ni una sola de ellas en ninguno de Ca. T. magnifica o Ca. Los genomas de T. nelsonii sugieren que realmente faltan y no son
simplemente un artefacto de secuencias incompletas.
Mientras que el complemento de proteínas divisómicas codificadas por Ca. Los genomas de T. magnifica se redujeron
considerablemente, los componentes del complejo de elongación celular se duplicaron, lo que probablemente sucedió en el
antepasado de Thiomargarita spp. (Figura S16-18). Los componentes del elongasoma, que incluyen la proteína citoesquelética
MreB requerida para el mantenimiento de la forma de la célula cilíndrica, sus socios interactivos MreC, MreD y el regulador de
la polimerización RodZ (Fig. S16), así como la polimerización de peptidoglicanos glicosiltransferasa RodA y la peptidoglicano
transpeptidasa MrdA (proteína de unión a peptidoglicanos 2 ), se organizaron en Ca.
Thiomargarita en 2 grupos cromosómicos. El primero incluía proteínas MreBCD, RodA y MrdA, así como mureína
transglicosilasa lítica unida a la membrana MltB y lipoproteína A rara (Fig. 3B). El segundo incluía RodZ y genes no relacionados
con elongasoma, como 4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato sintasa ispG (Fig. 3B). Comparación de las regiones mre y rodZ de Ca.
Thiomargarita a las de otras grandes bacterias oxidantes de azufre reveló duplicaciones de rodZ, mreD y mrdA, con ambas copias
adyacentes en el cromosoma. Si bien el efecto fisiológico de este aumento de la dosis de genes no está claro, es probable que
esté relacionado con la morfología compleja y el ciclo de vida de Ca. T. magnifica. Alternativamente, pueden compensar la falta de
componentes de síntesis de peptidoglicanos del divisoma.
Ciclo de desarrollo de Ca. T magnifica
Debido a que observamos filamentos completamente desarrollados liberando su segmento más apical en vivo en el
laboratorio, planteamos la hipótesis de que los segmentos terminales liberados representan una etapa dispersiva del ciclo de
desarrollo (Fig. 1C, S1). Para probar esta hipótesis, cuantificamos el biovolumen de las yemas apicales y lo comparamos con el
biovolumen de un pequeño filamento (ya que la bacteria no se cultiva). El filamento más pequeño analizado se observó con
tomografía de rayos X duros y tenía un volumen de 2,37x10-13 m3 que corresponde casi exactamente al volumen de las yemas
terminales del polo apical del filamento completamente desarrollado (2,1 y 2,4x10-13
m3 ). Es probable que el segmento terminal en forma de varilla de los filamentos represente células hijas dispersivas que se
liberan al medio ambiente y eventualmente se unen y crecen en un nuevo sustrato. Aparentemente, la célula hija recién
adherida primero se transforma en una célula filamentosa delgada mientras conserva el mismo volumen. Luego, los
filamentos jóvenes crecen en dirección vertical y el polo apical comienza a contraerse para formar nuevos brotes (Fig. 1C, S1).
Basado en observaciones de campo (por O. Gros, coautor), el Ca. El ciclo de desarrollo de T. magnifica puede ser algo
análogo al de Zoothamnium niveum, un ciliado colonial gigante que a veces coexiste en el mismo sustrato. como Ca. T.
magnifica, colonias alargadas de Z. niveum crecen hasta 1,5 cm de altura, emergiendo por encima de la biopelícula competitiva
para proporcionar un acceso óptimo al sulfuro de hidrógeno y al oxígeno a su simbionte gammaproteobacteriano oxidante de
azufre (38). como Ca. T. magnifica, las células especializadas eventualmente se separan de la colonia, se dispersan, se asientan
en ambientes favorables y crecen en colonias. Observamos que co-ocurre Ca. Células de T. magnifica y Z. niveum, a veces en la
misma hoja en descomposición. El gigantismo y el ciclo de vida de Ca. Por lo tanto, T. magnifica puede permitirles explotar un
nicho que hasta ahora se sabe que está ocupado
sólo por eucariotas como Z. niveum. Al igual que los ectosimbiontes oxidantes de azufre escapan de la
competencia del biofilm al crecer verticalmente a través de su asociación con el ciliado, Ca. T. magnifica crece
por encima de la biopelícula donde todavía está expuesta a altas concentraciones de sulfuro (Fig. S14).
Figura S1. Micrografías de luz de Ca. Thiomargarita magnifica adherida a hojas hundidas de Rhizophora mangle. A.
Cientos de filamentos se desarrollan en hojas muertas hundidas parcialmente enterradas en el sedimento sulfuroso del
manglar. Ocasionalmente se observaron parches similares creciendo sobre restos de plástico y conchas de ostras
parcialmente enterrados. Las células aparecían de color blanco brillante debido a sus reservas intracelulares de azufre elemental. BD.
Detalle de células en gemación que muestran una constricción gradual en el ápice del filamento. Tenga en cuenta que
la manipulación de estas células frágiles a veces doblaba los filamentos, dejando una marca como se ve en la mitad de la
celda en B. El segmento terminal (flecha) todavía está unido a la célula madre en D y acaba de ser liberado en la columna
de agua para su dispersión. en AO Área de una hoja hundida con segmentos terminales recién liberados (flechas) y
filamentos recién asentados de varios tamaños. Tenga en cuenta que estos filamentos jóvenes (< 3 mm) aún no muestran
constricciones apicales. Las áreas de los dos rectángulos se muestran con mayor aumento en F y G.
Figura S2. Observación por microscopía electrónica de barrido de un Ca individual. Thiomargarita magnifica. UNA.
Detalle de los últimos 2 mm del ápice celular caracterizado por las típicas células hijas en gemación múltiple. B.
Mayor aumento que muestra la superficie lisa de la pared celular y la ausencia de bacterias epibióticas o biopelícula.
Figura S3. Longitudes de 135 Ca. Células en gemación de Thiomargarita magnifica medidas bajo un microscopio estereoscópico.
El filamento más pequeño observado aquí con un segmento terminal fue de 4,73 mm y los filamentos más grandes fueron de 20
mm. La longitud del segmento más apical se muestra en rojo.
Figura S4. Observaciones de microscopía de barrido láser confocal de tres bacterias filamentosas grandes
multicelulares después del etiquetado fluorescente de membranas usando colorante FM 1-43x. A. Las separaciones entre
las células (puntas de flecha blancas) de Cyanobacterium Microcoleus vaginatus son claramente visibles después de la tinción
con FM 1-43x. B. El tabique de la membrana que separa las células vacuoladas de un filamento tipo Beggiatoa está claramente
teñido por el colorante de la membrana. C. El tabique de la membrana que separa las células grandes vacuoladas de los
filamentos bacterianos similares a Marithrix está claramente teñido por el colorante de la membrana.
Figura S5. Observación por microscopía electrónica de transmisión de Ca. T. magnifica. A. Fotomontaje de la sección
transversal de una celda. El citoplasma está organizado en la periferia de la célula alrededor de una gran vacuola central. B.
La envoltura celular está representada por una gruesa capa externa que cubre la membrana citoplasmática (flecha blanca
curva). Las vesículas electrolúcidas corresponden a gránulos de azufre elemental (estrellas) disueltos en etanol durante la
deshidratación de la muestra. Las pepinas se encuentran adyacentes a la vacuola central (flechas negras). C. Vista
detallada de la membrana citoplasmática (flecha grande) cubierta por una pared celular (estrellas). El citoplasma está lleno
de orgánulos, cada uno delimitado por una membrana (pequeñas flechas), que a veces contienen múltiples vesículas
electrolúcidas (asteriscos). D. Fotomontaje (764 imágenes tomadas con un aumento de 3000x) de una sección longitudinal
celular de 850,6 µm de largo. La sección corresponde a la parte media del filamento. No se observó tabique y el citoplasma,
la membrana celular y la vacuola central aparecen continuos en toda la sección. E. Fotomontaje (349 imágenes tomadas
con un aumento de 1400x) de una sección longitudinal celular de 374 µm de largo. El montaje muestra la continuidad de la
célula y la ausencia de cualquier tabique de membrana, incluso en los sitios de constricción.
Fig. S6: Visualización de membrana y ADN en secciones transversales de un Ca. Célula de Thiomargarita magnifica
y detalle TEM de las pepinas. A, descripción general de la sección transversal de una célula que muestra la membrana
en naranja después de la tinción con FM 1-43x. B, visualización del ADN en azul en la misma sección después de la
tinción con DAPI. C, Superposición de A y B. DF, mayor aumento del área del rectángulo de A, B y C. GK, Observaciones
de microscopía electrónica de la misma célula que muestran pepinas rodeadas por una membrana (puntas de flecha). V,
vacuola.
Figura S7. Hibridación fluorescente in situ (FISH) con sondas generales, específicas y sin sentido y tinción de ADN
con DAPI en secciones de Ca incrustadas en resina. Células de Thiomargarita magnifica. A. Las pepinas están
marcadas con la sonda bacteriana general (verde), una sonda específica de gammaproteobacteria (amarilla), la
sonda específica de Thiomargarita (roja) o con DAPI (azul). El detalle de las dos pepinas en el rectángulo blanco de
la imagen DAPI se muestra con mayor aumento a la derecha. B. Los perfiles de intensidad de una línea que cruza
las dos pepinas del inserto muestran picos en los cuatro canales. C. FISH realizado en secciones de la misma
célula colocadas en el mismo portaobjetos no muestra hibridación de la sonda sin sentido. D. Los perfiles de
intensidad de la línea que cruza las dos pepinas del inserto en B muestran un pico para la señal DAPI pero ninguna
señal en ninguno de los colores de la sonda.
Figura S8. Hibridación fluorescente in situ (FISH) con sondas de gammaproteobacteria (A) y Thiomargarita (B) y
tinción de ADN con DAPI (C) en una sección transversal del área del tallo de un Ca. Célula de Thiomargarita
magnifica. Las pepinas están marcadas con sondas gammaproteobacteria y Thiomargarita -
Thiomargarita es un género dentro de las gammaproteobacterias, así como por DAPI, como se muestra en la
superposición de las tres imágenes (D). A la derecha de cada imagen se proporciona una mayor ampliación del
área en el rectángulo blanco. Muestra que mientras las señales FISH y DAPI se colocalizan en los pepins, no
muestran el mismo patrón. En la pepina más grande, por ejemplo, los ARN de los ribosomas marcados en amarillo
y rojo se concentran en el centro del orgánulo, mientras que el ADN marcado en azul muestra una señal más alta
en los lados. V, vacuola.
Figura S9. Hibridación fluorescente in situ (FISH) con sondas dirigidas a bacterias generales (A, sonda EUB
marcada con Cy5); gammaproteobacteria (B, sonda Gam42a marcada con Cy3); y Thiomargarita, un género dentro
de gammaproteobacteria (C, sonda Thm482 marcada con FITC); y tinción de ADN con DAPI (D); en una sección
longitudinal del extremo apical de un Ca. Célula de Thiomargarita magnifica. En esta sección longitudinal, las
pepinas están presentes en el citoplasma del segmento terminal, así como en el tallo antes de la constricción.
Nótese que el segmento terminal, como el resto de la célula, presenta una gran vacuola central que ocupa la mayor
parte del volumen celular. Las pepinas marcadas con las tres sondas y DAPI se muestran mediante la superposición
(E). El detalle de los tres pepins en el rectángulo blanco se da en el inserto superior derecho. Tenga en cuenta que
no se detectan bacterias epibióticas con FISH. V, vacuola.
Figura S10: Visualización de la actividad de traducción en un Ca completo. Célula de Thiomargarita magnifica

usando etiquetado bioortogonal de aminoácidos no canónicos (BONCAT). Las proteínas sintetizadas durante las 24
h de incubación con un análogo de metionina en el que se puede hacer clic se revelan mediante fluorescencia verde. A.
Fotomontaje de un filamento completo que muestra que la actividad de traducción se detecta en toda la célula. Sin
embargo, la actividad no está homogéneamente distribuida, siendo más frecuente el marcador en los sitios de constricción
(flechas) hacia el polo apical de la célula. En B, C y D, respectivamente, se muestra un mayor aumento de la parte
superior, media y basal de la celda. Las proteínas recién sintetizadas se localizan principalmente en pequeñas áreas
redondas similares a las pepinas en forma, tamaño y localización. Obsérvese la presencia de numerosas bacterias
BONCAT positivas (puntas de flecha), fuera del Ca. Célula de T. magnifica, en la biopelícula que cubre el sustrato de
hojas muertas en D. Se analizó un total de 12 células después de tres experimentos de incubación diferentes luego de
tres muestreos diferentes y mostraron patrones de etiquetado consistentes.
Figura S11. Número total de secuencias de codificación (CDS) en comparación con el tamaño total del genoma para todos los
genomas recuperados de IMG/M. California. El genoma de Thiomargarita magnifica se encuentra entre los genomas bacterianos
más grandes con uno de los números más altos de secuencias codificantes.
Fig. S12: Representación esquemática de los metabolismos del carbono (azul), nitrógeno (verde) y azufre
(rojo), así como la cadena de transporte de electrones (naranja) basada en el Ca. Proyecto de genomas de
Thiomargarita magnifica. TCA, ácido tricarboxílico; CBB, Calvin–Benson–Bassham; ABC, transportador ABC;
Cyo - citocromo c oxidasa de tipo cbb3; H2ase, Ni-Fe hidrogenasa; Apr, adenililsulfato reductasa; Atp, ATP
sintasa de tipo F; Cyd, citocromo d ubiquinol oxidasa; Cyo, citocromo c oxidasa de tipo cbb3; Dsr, sulfito
reductasa; H2ase, Ni Fe hidrogenasa; Fcc, sulfuro deshidrogenasa; Nap, nitrato reductasa periplásmica; Nar,
nitrato reductasa; Ntp, ATP sintasa de tipo V; Nuo, NADH-quinona oxidorreductasa; Pet, ubiquinol-citocromo c
reductasa; Rnf, proteína del complejo de transporte de electrones Rnf; Sat, sulfato adenililtransferasa; Sox,
proteína oxidante de azufre Sox; Sqr, sulfuro:quinona oxidorreductasa.
Figura S13. Imágenes y análisis de microscopía electrónica de barrido ambiental registrados en Ca ligeramente fijado.
Thiomargarita magnifica bajo una atmósfera de vapor de agua de 650 mPa. A: espectro EDXS adquirido en el área
correspondiente a la Figura S13B. El azufre está claramente identificado. B: Imagen recogida con detector de electrones
secundarios con tensión de aceleración de 15 kV. La imagen está dominada por electrones retrodispersados debido al
alto poder de penetración de los electrones incidentes en la muestra. El contraste resultante del número atómico (Z) revela
gránulos de alto número Z (azufre) como áreas brillantes incrustadas en la matriz de luz (C, N, O, H) en negro. El contraste
secundario está presente pero solo es visible en la periferia de la célula. C: Imágenes de retrodispersión de electrones
obtenidas a 15 kV que resaltan los gránulos de azufre como en B. Cada gránulo vacío aparece blanco en una imagen de
retrodispersión de electrones debido a la intensidad de la señal BSE que está fuertemente relacionada con el número
atómico del elemento químico . DF: mapas de rayos X que caracterizan las distribuciones de carbono (D), oxígeno (E) y
azufre (F) en la muestra. El mapa de azufre (F) confirma claramente que las áreas brillantes que aparecen en las
imágenes de BSE corresponden a ubicaciones de azufre.
Figura S14. Variación de la concentración de sulfuros totales medida en medio de un “ramo” de Ca.
Thiomargarita magnifica adherida a hojas hundidas de Rhizophora mangle durante 5 horas.
Figura S15. Árbol filogenético de las proteínas de la subunidad grande RuBisCo codificadas por Ca. T. magnifica
y secuencias representativas de otros genomas. California. Las secuencias de rbcL de T. magnifica se agrupan dentro del
clado tipo I, por separado del tipo II RuBisCO codificado por Ca. Genoma de brote S10 de T. nelsonii.
Figura S16. Árbol filogenético de las proteínas RodZ codificadas por Ca. Proyecto de genomas de T. magnifica y
secuencias de referencia seleccionadas. Dos copias de rodZ encontradas una al lado de la otra en Ca. T. magnifica y
Ca. T. nelsonii bud S10 son más similares entre sí que con cualquier otra secuencia, lo que sugiere una duplicación en
un ancestro común de Ca. Thiomargarita spp.
Figura S17. Árbol filogenético de proteínas MreD codificadas por Ca. Proyecto de genomas de T. magnifica y
secuencias de referencia seleccionadas. Dos copias del gen mreD encontradas cerca una de la otra en Ca. T. magnifica
son más similares entre sí que con cualquier otra secuencia, lo que sugiere una duplicación en Ca. T. magnifica.
Figura S18. Árbol filogenético de las proteínas MrdA codificadas por Ca. Proyecto de genomas de T. magnifica y
secuencias de referencia seleccionadas. Dos copias del gen mrdA encontradas cerca una de la otra en Ca. T. magnifica
son más similares entre sí que con cualquier otra secuencia, lo que sugiere una duplicación en Ca. T. magnifica.
Figura S19. Detalle de la vecindad de los genes ddl, mreB y rodZ para los cinco Ca. Proyecto de genomas de
T. magnifica (ver también Fig. 3B).
Figura S20: Localización de membranas bioenergéticas en Ca. Thiomargarita magnifica con inmunohistoquímica
ATP sintasa. A. Fluorescencia infrarroja del anticuerpo secundario marcado con Cy5 (rojo). La señal positiva de
ATP sintasa es visible en todo el citoplasma de la célula que está restringida en la periferia de la vacuola central
(V). B. Marcaje fluorescente de pepinas que contienen ADN utilizando DAPI (azul). C. Superposición de los
canales rojo y azul. El detalle del área del rectángulo se proporciona debajo de cada imagen (DF). Las
membranas de pepina son positivas para la detección de ATP sintasa, lo que sugiere el papel del orgánulo en
la producción de membrana bioenergética. La compleja red de membranas citoplasmáticas fuera de las pepinas
también está marcada, pero la membrana más externa, que delimita la célula, es negativa para la ATP sintasa.
celdas A, B,
celda D
C, E y N
fecha de escaneo 30/8/2019 27/8/2019
número total de células en la muestra 5 1
número de celdas enteras en el escaneo 3 1
ancho del conjunto de datos (µm) 1755 984
altura del conjunto de datos (µm) 1843 1008
profundidad del conjunto de datos (µm) 4668 6270
número de fichas 3 8
tamaño de píxel 1.00 1.00
(µm) número de proyecciones por 1601 801
1
agrupación de cámara de mosaico 2
filtro de origen aire aire
ajuste de fuente (kV) 40 40
ajuste de fuente (µA) 74 74
distancia fuente-RA (mm) -9.2 0.0
aumento óptico tiempo de 4.0 4.0
exposición (s) 15 10
Tabla S1. Resumen de los parámetros de las tomografías computarizadas de rayos X duros.
Tabla S2. Resumen de la Ca. Observaciones de T. magnifica con tomografía de rayos X duros (HXT) y microscopía de
barrido láser confocal (CLSM). Se analizaron un total de 14 células en 3D, diez de las cuales se analizaron en toda su
longitud. La tabla proporciona el detalle de la longitud de la celda observada. Cuando corresponda, la tabla también muestra los
diámetros mínimo y máximo de la célula, su volumen total, el volumen del citoplasma y el volumen de la vacuola central, así como
el porcentaje de volumen de la vacuola en relación con la célula completa.
Para tres células, se estimó el número de copias del genoma. Esta estimación también se proporciona como un número de
copias del genoma por milímetro de célula y como una extrapolación para una célula de 2 cm completamente desarrollada.
Finalmente, se proporciona la resolución lateral de la imagen, así como la resolución z y el número de mosaicos ensamblados en
el conjunto de datos.
filamento 1 filamento 2 filamento 3 filamento 4 filamento 5

ID de taxón IMG 2893903249 2893884007 2956128196 2893867023 2926625205
ID de ejecución de SRA SRR18723970 SRR18723883 SRR18723969 SRR18725150 SRR18724479
Biblioteca total bases (Mb) 816.5 1007.5 1659.2 1644.6 3057.3

Leer recuentos (x106 ) 5.5 6.7 11.1 11.0 20.4
Tamaño del conjunto (Mb) 18.87 16.88 22.48 16.26 16.48
Número de cóntigos 6613 4720 2713 2383 2196

Número de contenedores 3 2 6 2 2
Tabla S3. Números de acceso, lecturas, ensamblaje y estadísticas de agrupación para los cinco genomas amplificados
individuales de Ca. Thiomargarita magnifica. Un solo contenedor de genoma por cada filamento se identificó como Ca.
Thiomargarita magnifica y se utilizó para análisis genómicos posteriores.
California. Papelera T. magnifica de: California. T nelsonii
filamento 1 filamento 2 filamento 3 filamento 4 filamento 5 tio36 Brote S10
ID de taxón IMG 2955952073 2956002012 2955989171 2955976453 2955963837 2236661048 2600255314
bases (Mb) 11.5 11.6 12.1 12.2 12 5.3 6.2
contigs 787 795 709 647 534 3613 439
recuento de genes 11196 11401 11068 11788 11742 7596 7525
codificación % 78.3 78.2 77.7 77.6 77.4 72 82
longitud máxima de contig 183 KB 201 kb 167 KB 150 KB 202 kb 14 KB 190 KB
GC % 42,37 42.34 42.31 42.41 42.39 42 41.3
prot. de función conocida 5706 5804 5824 5925 5887 3486 4310
integridad del genoma % 91,01 92.15 93.03 92.86 93.74 70 89.8
contaminación % 7.47 8.31 9.54 9.17 8.83 - -
5.56 6.67 7.26 8.77 9.09 - -

cepa heterogeneidad %
Winkel et al. Inundación y otros

Referencia este estudio este estudio este estudio este estudio este estudio
2016 2016
Tabla S4. Estadísticas de los cinco borradores de genomas de células individuales de Ca. Thiomargarita magnifica y los dos
borradores de genomas publicados de Ca. T. nelsonii.
California. t California. t California. t California. t California. t California. t California. t
magnifica 1 magnifica 2 magnifica 3 magnifica 4 magnifica 5 nelsonii nelsonii

tio36 Brote S10
California. T. magnifica 99.63 99.84 99.85 99.84 85.23 85.33

1 Ca. T. magnifica 2 99.57 99.68 99.68 99.63 85.30 85.35
Ca. T. magnifica 3 99.78 99.57 99.87 99.83 85.17 85.32
Ca. T. magnifica 4 99.81 99.64 99.86 99.86 85.22 85.33
Ca. T. magnifica 5 99.77 99.64 99.85 99.90 85.39 85.46
Ca. T. nelsonii Thio36 85.55 85.50 85.88 85.66 85.80 87.07
California. T. nelsonii Brote S10 85.55 85.54 85.69 85.61 85.63 86.39
Tabla S5. Identidad de nucleótidos promedio por pares (ANI) entre todos los genomas de Thiomargarita disponibles.
Los valores de ANI están coloreados de verde (ANI más altos) a rojo (ANI más bajos).
filamento 1 filamento 2 filamento 3 filamento 4 filamento 5

SNP totales 153 154 137 116 140
sustituciones 119 116 93 79 86
Eliminaciones 32 35 42 35 53
inserciones 2 3 2 2 1
Asamblea
10.913.008 11.052.258 11,830,191 11,817,984 11,769,126
Tamaño
SNP/100Kb 1.40 1.39 1.16 0.98 1.19
Tabla S6. Resumen del análisis de llamadas variantes. Información detallada sobre los SNP en genomas
amplificados individuales de cinco filamentos ordenados (número total de SNP y SNP/100kb) y el desglose de los SNP
por tipo (sustituciones, eliminaciones, inserciones).
tamaño del
BGC longitud
grandes
genoma total de porcentaje
identificación del genoma especies bacterias de azufre contar
BGC de BGC (%)
(Mbps)
(Mbps)
California. Thiomargarita
IMG2955963837 magnifica fil. 5 + 12.01 143 3.11 25.86
Thioploca ingrica Lago
IMG2619619276 Okotanpe Ca. + 4.81 50 1.01 21.04
Thiomargarita nelsonii capullo S10
IMG2600255314 + 7.71 85 1.41 18.33
Salinispora tropical CNB-440 Ca. - 5.18 dieciséis 0.90 17.30

NC_009380.1IMG2772190729
Marithrix sp. Cañón 246 + 3.22 30 0.54 16.70
IMG2788500497 Cycloclasticus sp. SP43 - 2.35 28 0.35 15.04
NC_017765.1 Streptomyces hygroscopicus - 10.15 38 1.53 15.04

IMG2786546773 Thioflexothrix psekupsii D-3 + 3.97 22 0.59 14.87
Thiothrix eikelboomii ATCC 49788
IMG2585428147 + 4.16 40 0.51 12.23
IMG2506520049 Thiothrix nivea JP2, DSM 5205 + 4.69 45 0.57 12.13
NZ_CP042324.1 Streptomyces coelicolor A3(2) - 8.67 27 0.98 11.35

Thiolinea disciforme DSM
IMG2515154021 14473 + 3.92 24 0.35 9.05
GCF_000149205.2 Aspergillus nidulans FGSC A4 Thiothrix - 30.28 53 2.43 8.03

caldifontis DSM 21228
IMG2599185268 + 3.94 24 0.30 7.71
IMG2619618925 Thiothrix sp. EBPR_Bin_364 - 3.75 27 0.28 7.45
IMG2802428810 Cocleimonas flava DSM 24830 - 4.49 18 0.28 6.34
IMG2740892603 Methylophaga sp. SM14 - 2.89 19 0.16 5.69
IMG2517093012 Leucothrix mucor DSM 2157 + 5.19 30 0.29 5.53
Beggiatoa sp. Naranja
IMG2502790011 Guaymas Thiothrix + 4.77 26 0.26 5.38
IMG2556921650 lacustris DSM 21227 Beggiatoa + 3.72 29 0.20 5.28
leptomitoformis D 401
IMG2788500402 + 4.27 18 0.18 4.17
IMG2515154111 Thiofilum flexible DSM 14609 + 3.79 23 0.16 4.15
IMG2508501047 Beggiatoa alba B18LD + 4.27 dieciséis 0.15 3.60
IMG2684622566 Achromatium sp. WMS3 + 3.61 10 0.11 3.17
aprox . Thiomargarita nelsonii
IMG2236661048 Thio36 + 5.26 31 0.11 2.10
IMG640963011 Beggiatoa sp. PD + 6.06 13 0.07 1.12
Tabla S7. Análisis de grupos de genes biosintéticos (BGC) en especies de Thiomargarita , otras bacterias (incluidas las
grandes bacterias del azufre) y un sistema modelo de hongo (Aspergillus nidulans) famosamente rico en metabolismo
secundario. Solo se incluyeron las MAG bacterianas con estimaciones de contaminación basadas en CheckM que no
superaban el 10 %.
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Science - Abb3634 SM

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Materiales complementarios para

Una bacteria de un centímetro de largo con ADN contenido en orgánulos unidos

Jean-Marie Volland et al.

Ciencia 376, 1453 (2022)

El archivo PDF incluye:

Materiales y métodos Texto

Otro material complementario para este manuscrito incluye lo siguiente:

Microscopía de escaneo láser confocal (CLSM)

Tomografía computarizada de rayos x duros

Hibridación fluorescente in situ (FISH) y correlación TEM

Marcado de aminoácidos bioortogonales no canónicos (BONCAT)

+S2- ), teniendo en cuenta el pH y la salinidad medidos utilizando un pK de 6,51 (60).

Secuenciación, ensamblaje, agrupamiento y anotación del genoma

Análisis del genoma

Identidades promedio de nucleótidos y dentro de la evaluación de la clonalidad del filamento

Anotación del genoma y análisis funcional

Evidencia de tiotrofia en Ca. T magnifica

Estimación del número de copias del genoma

Descripción ampliada de Ca. Metabolismo de T. magnifica basado en el análisis del genoma

Ciclo de desarrollo de Ca. T magnifica

Figura S10: Visualización de la actividad de traducción en un Ca completo. Célula de Thiomargarita magnifica

fecha de escaneo 30/8/2019 27/8/2019

número total de células en la muestra 5 1

número de celdas enteras en el escaneo 3 1

ancho del conjunto de datos (µm) 1755 984

altura del conjunto de datos (µm) 1843 1008

profundidad del conjunto de datos (µm) 4668 6270

tamaño de píxel 1.00 1.00

(µm) número de proyecciones por 1601 801

filtro de origen aire aire

ajuste de fuente (kV) 40 40

ajuste de fuente (µA) 74 74

distancia fuente-RA (mm) -9.2 0.0

aumento óptico tiempo de 4.0 4.0

filamento 1 filamento 2 filamento 3 filamento 4 filamento 5

ID de ejecución de SRA SRR18723970 SRR18723883 SRR18723969 SRR18725150 SRR18724479

Biblioteca total bases (Mb) 816.5 1007.5 1659.2 1644.6 3057.3

Tamaño del conjunto (Mb) 18.87 16.88 22.48 16.26 16.48

Número de cóntigos 6613 4720 2713 2383 2196

California. Papelera T. magnifica de: California. T nelsonii

filamento 1 filamento 2 filamento 3 filamento 4 filamento 5 tio36 Brote S10

ID de taxón IMG 2955952073 2956002012 2955989171 2955976453 2955963837 2236661048 2600255314

bases (Mb) 11.5 11.6 12.1 12.2 12 5.3 6.2

contigs 787 795 709 647 534 3613 439

recuento de genes 11196 11401 11068 11788 11742 7596 7525

codificación % 78.3 78.2 77.7 77.6 77.4 72 82

longitud máxima de contig 183 KB 201 kb 167 KB 150 KB 202 kb 14 KB 190 KB

GC % 42,37 42.34 42.31 42.41 42.39 42 41.3

integridad del genoma % 91,01 92.15 93.03 92.86 93.74 70 89.8

contaminación % 7.47 8.31 9.54 9.17 8.83 - -

5.56 6.67 7.26 8.77 9.09 - -

Winkel et al. Inundación y otros

California. t California. t California. t California. t California. t California. t California. t

magnifica 1 magnifica 2 magnifica 3 magnifica 4 magnifica 5 nelsonii nelsonii

California. T. magnifica 99.63 99.84 99.85 99.84 85.23 85.33

filamento 1 filamento 2 filamento 3 filamento 4 filamento 5

SNP/100Kb 1.40 1.39 1.16 0.98 1.19

Salinispora tropical CNB-440 Ca. - 5.18 dieciséis 0.90 17.30

NC_017765.1 Streptomyces hygroscopicus - 10.15 38 1.53 15.04

NZ_CP042324.1 Streptomyces coelicolor A3(2) - 8.67 27 0.98 11.35

GCF_000149205.2 Aspergillus nidulans FGSC A4 Thiothrix - 30.28 53 2.43 8.03

<jrn>1. AD Steen, A. Crits-Christoph, P. Carini, KM DeAngelis, N. Fierer, KG Lloyd, J.