UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Universidad del Perú, Decana de América

Facultad de Ciencias Biológicas

Escuela Académico Profesional de Genética y Biotecnología

CITOGENÉTICA GENERAL

INTRODUCCIÓN

El número de cromosomas de cada serie recibe el nombre de número haploide o n y

ha sido heredado de uno de los progenitores. El número total de cromosomas es el número

diploide o 2n. Así, por ejemplo, en el ratón n=20 y 2n=40. En los mamíferos los cariotipos

del macho y de la hembra son diferentes. La hembra tiene dos cromosomas X (XX-

homogamética) y el macho tiene un cromosoma X y otro Y (heterogamético– XY). Estos

cromosomas que determinan el sexo se llaman, sexuales. El resto de los cromosomas se

denominan autosomas. En las aves es, al contrario, el macho es homogamético (ZZ) y la

hembra heterogamética (ZW). Todos los análisis citogenéticos de rutina se realizan sobre

preparaciones cromosómicas que se han tratado y teñido para producir un patrón de bandas
específico de cada cromosoma. Esto permite la detección de cambios sutiles en la estructura

de los cromosomas.

La presente práctica tuvo como objetivo conocer los fundamentos del proceso de elaboración

de cromosomas animales. Complementando el análisis, se utilizó el programa Ideokar, para

analizar el cariotipo de Catopuma temminckii (2n=38), elaborando cariograma, ideograma,

tablas de medición. Para ello se utilizó el artículo “Cytogenetic Studies of Fishing Cat,

Prionailurus viverrinus (Bennett 1833) and Asiatic Golden Cat, Catopuma temminckii

(Vigors and Horsfield 1827) by Conventional Staining, G-banding and High-resolution

Techniques” (URL:

https://pdfs.semanticscholar.org/f6f2/2ada233b70ff94cdab277c3adde90e80f38a.pdf). En

cuanto al procedimiento utilizado se utilizó el siguiente artículo que hacía referencia en el

paper principal: “Techniques in Karyology: The Bone Marrow Extraction Method” (URL:

https://www.ableweb.org/biologylabs/wp-content/uploads/volumes/vol-12/4-tolliver.pdf)

METODOLOGÍA

El protocolo se basó en los trabajos de Tolliver, D., & Robbins, L. (1991). Techniques in
karyology: The bone marrow extraction method. Association for biology laboratory,
Missouri. https://www.ableweb.org/biologylabs/wp-content/uploads/volumes/vol-12/4-
tolliver.pdf

A) Materiales

Tabla 1. Materiales usados para la observación de cromosomas de Mus musculus.

Reactivos Material de laboratorio

 - Solución de levadura (3g de levadura -Portaobjeto (2 a 4)
para hornear, 2g de dextrosa, 12 ml de
- Cubreobjeto (2 a 4)
H2O destilada) 0.5ml

- Jeringa de 3 cc con aguja de 1

-Carnoy (3 :1, metanol absoluto: ácido
pulgada y calibre 23
acético glacial)

- Tijera afilada
-Colchicina 0.1 ml (0.01%, uso agua
destilada) - Toallas de papel

- Giemsa al 2%, aproximadamente 45 - Pipetas pasteur

ml (1ml giemsa, 0,4% p/v, y 98ml de
tampón PO ). - Frasco de Coplin
4

- KCl a 0.075 M - Cerillo

Material biológico Equipos

- Mus musculus (femur y tibia) -Microscopio óptico

-Centrífuga

- Incubadora

B) Procedimiento

Previo a la extracción de médula ósea.

El material biológico, Mus musculus, tuvo que ser preparado dos días antes,

inyectándole 0,5ml de solución de levadura vía subcutánea. Dos horas antes de la

experiencia, vía intraperitoneal, se le inyectó 0,1ml de colchicina al 0,01%.

Extracción de médula ósea

Se sacrificó el ratón mediante una dislocación cervical. Con las tijeras se abrió el

abdomen, evitando cortar las vísceras, posteriormente se extrajo el fémur y la tibia, limpiando

restos de grasa y músculo. Con una jeringa de 3cc conteniendo KCl 0,075 M se lavó la

médula ósea en un tubo de centrífuga. Con la pipeta pasteur se aspiró para obtener una

suspensión celular. Se incubó durante 15 minutos a 37°C, luego de centrifugó durante 2

minutos a 1500rpm y se quitó el sobrenadante. Con la ayuda de la pipeta pasteur se añadó el

fijador Carnoy frío y fresco, dejando fluir por los bordes del frasco, se dejó reposar por 30

segundos y se aspiró; se centrifugó como antes y se retiró el sobrenadante, luego s0,5e

repitieron 2 veces más el procedimiento con el carnoy, Se resuspendió la muestra con 1,0 ml

de fijador y se aspiró. Luego se colocaron de 2 a 4 gotas de la muestra en el portaobjeto,

inmediatamente se calentó con una cerilla, luego se retiró el exceso de líquido con papel

toalla y se dejó secar al aire libre. Finalmente, los portaobjetos fueron añadidos en un frasco

de Coplin para que fuesen teñidos con Giemsa al 2% durante 10 minutos, se enjuago con

agua destilada, se dejó secar al aire y se examinó en el microscopio.

A continuación, se presenta un flujograma del procedimiento utilizado.

Figura 1. Flujograma del procedimiento para la observación de cromosomas de Mus

musculus

3.- Fundamentación de los reactivos utilizados en el procedimiento.

A) Preparación de la muestra

La solución de levadura (S. cerevisiae, dextrosa y agua) va a provocar una infección

generalizada, permitiendo la producción de células del sistema inmunitario para combatirlas,

estas serán producidas en la médula ósea (Goebel, C., De Mattos Oliveira, F., & Severo, L.,

2013; Tolliver, D., & Robbins, L., 1991).

La colchicina al 0,01%, va a interferir con la formación del uso mitótico, evitando la

división de las células (Zaragüeta, O.,2017)

B) Elección del tejido

 La médula ósea del fémur y la tibia fueron lavados con KCl 0,075 M para crear

condiciones hipotónicas, permitiendo la entrada de agua a las células y, por lo tanto, una

mayor dispersión de las estructuras celulares (Molleda, P., et al, 2009).

C) Fijación

El fijador Carnoy frío y fresco fue utilizado para la conservación de ácidos nucleicos,

debido a que es un fijador ácido; sin embargo, es capaz de producir lisis en algunos orgánulos

de las células estudiadas (Atlas de Histología Vegetal y Animal. s.f).

D) Coloración

Se utilizó el colorante Giemsa debido a su alta asociación a la cromatina, creando una

coloración rojiza, especialmente en el núcleo de las células sanguíneas y de médula ósea; esto

se debería, porque el azur I (componente estructural de Giemsa, se uniría a los grupos

fosfatos del ADN y la eosina (otro componente de Giemsa) ayudaría en el acoplamiento;

además de servir como colorante en pruebas de inmunofluorescencia directa (Perea-Sasiaín,

J. 2003; Ramírez, I., et al, 1994).

Tabla 2. ´Par de cromosomas homólogos. Longitud de brazo corto: p, brazo largo: q y
tamaño del cromosoma: C.
 Figura 2: Cariotipo de Catopuma temminckii o gato dorado asiático hembra, 2n=38.

Catopuma temminckii o gato dorado asiático hembra tiene un número cromosómico diploide

2n = 38, de los cuales hay 6 tipos de autosomas: el tipo A tiene 4 grandes y 2 medianos

submetacéntricos, el tipo B tiene 6 grandes y 2 medianos acrocéntricos, el tipo C tiene 4

grandes metacéntricos, El tipo D tiene 8 pequeños submetacéntricos, el tipo E tiene 6

pequeños metacéntricos y el tipo F tiene 4 pequeños cromosomas telocéntricos.

CÁLCULO DE LA SIMETRÍA-ASIMETRÍA DEL CARIOTIPO

Tabla 3: Par de cromosomas homólogos Promedio de brazos q () y brazos p () para cada par
de homólogos, media de la longitud cromosómica de cada par (X) y desviación estándar (S).

ASIMETRÍA INTRACROMOSÓMICA
ASIMETRÍA INTERCROMOSÓMICA

IDEOGRAMA

Se observa en la figura 2 el ideograma elaborado con el software IdeoKar. Tras emparejar

cada cromosoma de la placa metafásica, los cromosomas se encuentran alineados a la altura

de su centrómero y ordenados de forma descendente por su tamaño. Además, en el n°15 se

tiene al cromosoma X.

Figura 4. Ideograma de los cromosomas de Catopuma temminckii hembra, elaborado con el

programa IdeoKar.

REFERENCIAS
Tolliver, D. K. and L. W. Robbins. 1991. Techniques in karyology: The bone marrow

extraction method. Pages 69-74, in Tested studies for laboratory teaching. Volume 12.

(C. A. Goldman, Editor). Proceedings of the 12th Workshop/Conference of the

Association for Biology Laboratory Education (ABLE), 218 pages.

Tanomtong, A., Kaewmad, P., Khunsook, S., & Kaewsri, S. (2009). Cytogenetic Studies of

Fishing Cat, Prionailurus viverrinus (Bennett 1833) and Asiatic Golden Cat,

Catopuma temminckii (Vigors and Horsfield 1827) by Conventional Staining, G-

banding and High-resolution Techniques. Cytologia, 74, 3-15.

Atlas de Histología Vegetal y Animal. (s.f). Fijador Carnoy. Recuperado el 28 de Ag de

2020. Disponible en: https://mmegias.webs.uvigo.es/inicio.html

Goebel, C., De Mattos Oliveira, F., & Severo, L. (2013). Infección por Saccharomyces

cerevisiae. Revista Iberoamericana de Micología, 30(3), 205-208.

Molleda, P. et al. (2009). Determinación del Número de Cromosomas de Polymesoda Solida

(Bivalvia: Corbiculidae) Utilizando dos Métodos Citogenéticas. Ciencia, 7(1).

Motedayen, M. H., Teimorzadeh, S., & Shafaei, K. D. (2011). Karyotype of NIH, C57BL/6

and Razi strains of laboratory mice (Mus musculus). Iranian Journal of Veterinary

Medicine, 5(2), 80-83.

Perea-Sasiaín, J. (2003). Cien años del colorante de Giemsa. Biomédica, 23(1), 5-18.

Ramírez, I., et al. (1994). Validez de las tinciones de Giemsa y Lendrum en frotis

conjuntivales para la identificación de Chlamydia trachomatis. Boletín de la Oficina

Sanitaria Panamericana (OSP); 116 (3), mar. 1994.

Tolliver, D., & Robbins, L. (1991). Techniques in karyology: The bone marrow extraction

method. Association for biology laboratory, Missouri.

Zaragüeta, O. (2017). La estructura del dominio de Colchicina como base para el diseño y

síntesis de compuestos con propiedades antimitóticas y antivasculares (Doctoral

dissertation, Universidad Complutense de Madrid).