Virus

IgM Capture DxSelectTM

(En Español)
ELISA IgM por Captura para Virus
del Dengue
REF EL1500M
Rev. T
ELISA para la Detección Cualitativa de Anticuerpos
Humanos Clase IgM contra el virus del Dengue
Este prospecto es sólo para exportación y no para
su distribución en Estados Unidos.
Fuera de los Estados Unidos:
Para uso diagnóstico in vitro
PROPOSITO DE LA PRUEBA
El ELISA IgM por Captura para Dengue de Focus Diagnostics es una prueba cualitativo para la detección de anticuerpos séricos humanos IgM contra las
infecciones del virus del Dengue (DV) y para ser usado en apoyo del diagnóstico de infección por virus del dengue en humanos.
RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBA
El Dengue (DF) es una enfermedad viral aguda, auto limitada, que está caracterizada por fiebre, cefalea, dolores del cuerpo, exantema, linfadenopatía y
postración. En su forma más severa, el Dengue hemorrágico (DHF), los pacientes infectados experimentarán fiebre severa y falla renal que los lleva muy a
menudo al síndrome fatal de shock del Dengue (DSS)1. Se estima que aproximadamente dos mil millones de personas están en riesgo de Dengue en todo el
mundo, y sobre un millón de personas son infectadas por año2. Esto, combinado con los cientos de miles de casos de DSS, hacen del Dengue la infección por
Arbovirus más importante en el mundo2.
El virus del Dengue (DV) es un flavivirus y está muy relacionado a los virus de la fiebre amarilla, Encefalitis Japonesa y otros arbovirus del grupo B. Miembros
de este grupo poseen ARN de una cadena que está rodeado por una nucleocápside icosaédrica cubierta con una envoltura lípida de 10 nm de ancho3. Hay cuatro
cepas del virus del dengue, cada una serológicamente distinta. La infección con una cepa no proteje el huésped de la infección por las otras. De hecho, un reporte
sugiere que DHF y DSS ocurre más frecuentemente en individuos que han sido infectados previamente por otra cepa4. La presencia de anticuerpo contra DV
circulante, no neutralizante, capaz de reactividad cruzada puede actuar como un factor de aumento en la reacción inmune. Sin embargo anticuerpos no
neutralizantes capaces de reactividad cruzada contra otros flavivirus no-DV no están asociados con aumento en la reacción inmune4.
Epidemias de Dengue han sido reportadas regularmente a lo largo de todo el mundo. La mayor epidemia ocurrió en los Estados del Sur de los Estados Unidos
(1922, afectando sobre un millón de personas), Australia (1925 y 1942), Grecia (1927) y Japón (1942-45)2. Oficiales del Perú y del CDC han reportado una gran
epidemia de DF ocurrida entre Marzo a Julio de 19905. Esta epidemia ubicada alrededor de Iquitos, Perú, envolvió los DV tipos 1 y 4, es la primera confirmación
por laboratorio de transmisión natural de dengue en el Peru5.
El Dengue puede ser transmitido donde quiera que los mosquitos vectores, Aedes aegypti y Aedes albopictus, se encuentren. A. aegypti está localizado
primariamente en la América tropical y subtropical y es nativo de la parte del sur de los Estados Unidos2. El vector primario de DF en Asia es A. albopictus. Este
mosquito se ha establecido recientemente por sí mismo en los Estados Unidos tan lejos al norte como en el centro de Illinois; sin embargo, la transmisión de DV
no ha sido asociado con el hasta la fecha2.
En la mayoría de pacientes, los casos sospechosos de DF son más rápidamente diagnosticados usando métodos serológicos. Tradicionalmente han sido usados la
inhibición de la hemaglutinación y la reducción de la neutralización en placa3. Sin embargo, la prueba enzimo-inmune (ELISA) IgM de captura se ha vuelto el
método de elección. En la mayoría de individuos la respuesta de IgM contra DF es cepa específica y persiste hasta por noventa dias6.
El anticuerpo IgG contra el virus del dengue ha sido detectado en pacientes hasta después de sesenta años de la infección7. Por la tanto, una determinación de
anticuerpos única no debe ser considerada conclusiva. Sin embargo, el ELISA IgG es útil como una herramienta epidemiológica cuando es usado para establecer
la seroprevalencia. Esta información puede también ser valiosa en estudios diseñados para determinar el papel que juega el aumento inmune en DSS. Como con
la mayoría de flavivirus, el IgG es altamente capaz de reacciones cruzadas entre la mayoría de miembros del grupo flavivirus.
El ELISA IgM por Captura para virus del Dengue de Focus Diagnostics fué creado para la detección de anticuerpos séricos humanos contra los tipos 1–4 de DV.
Esta prueba es específico para IgM y usa un grupo monoclonal de flavivirus conjugado con peroxidasa de rábano de caballo y con TMB como sustrato. Cada
celda de captura es cubierta con IgM anti-humana. La solución de antígeno contiene proporciones iguales de DV Tipos 1–4 inactivados. Las siguientes cepas de
virus fueron usadas: Tipo 1: TH-Sman; Tipo 2: TH-36, Tipo 3:H87; y Tipo 4: H241.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
En la prueba ELISA IgM por Captura para virus del Dengue de Focus Diagnostics, las microceldas de poliestireno son cubiertas con anticuerpo anti-humano
específico para IgM (cadena µ). Las muestras séricas diluídas y los controles son incubados en las celdas, y el IgM presente en la muestra se liga al anticuerpo
anti-humano (IgM específico) en las celdas. Reactantes inespecíficos son removidos por lavado. El antígeno del virus del Dengue (DV) es entonces añadido a las
celdas e incubado; y, sí anti-DV IgM está presente en la muestra, el antígeno de DV se liga al anti-DV en la celda. El antígeno DV no ligado es entonces
removido por lavado de la celda. Anti-DV de ratón conjugado con peroxidasa de rábano de caballo es luego añadido a las celdas e incubado: y sí el antígeno de
DV ha sido retenido en la celda por el anti-DV en la muestra, el anti-DV:HRPO de ratón se liga al antígeno de DV en las celdas. El exceso de conjugado es
removido por lavado. Se añade sustrato enzimático y cromógeno y se permite que se desarrolle el color. Después de añadir el reactivo de paro, el cambio de color
resultante es cuantificado por una lectura espectrofotométrica de densidad óptica (OD) la cual es directamente proporcional a la cantidad de IgM antígeno
específico presente en la muestra. Las lecturas de densidad óptica de la muestra son comparadas con lecturas límites de referencia de OD para determinar los
resultados.
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PROCEDIMIENTO DE SUSTRACCIÓN DEL FONDO

El kit Dengue Virus IgM Capture DxSelect™ de Focus Diagnostic emplea pocillos de captura recubiertos con IgM anti humano. La IgM capturada con actividad
de anticuerpo heterófilo puede unirse directamente al reactivo indicador. Una forma de atenuar estas reacciones falsas es mediante el uso de un procedimiento de
sustracción de ruido o de fondo. Los datos publicados han demostrado que se pueden obtener mejores resultados en las muestras que tienen un bajo nivel de
reactividad mediante la implementación de la sustracción de ruido; sin embargo, cada laboratorio debe definir de forma individual sus propios algoritmos de
confirmación para los analitos medidos con un ELISA de captura µ.11

MATERIALES INCLUIDOS
El paquete ELISA IgM por Captura para virus del Dengue de Focus Diagnostics contiene suficientes materiales para 96 determinaciones. Permita que los
reactivos incluídos alcanzen la temperatura ambiente antes de usar. Todos los materiales no abiertos son estables entre 2 y 8°C hasta la fecha de expiración
marcada en la etiqueta del reactivo.
Antígeno, Liofilizado REF EL1522 Ag
Antigen, Lyophilized
Dos frascos conteniendo antígeno del virus del Dengue inactivado y liofilizado (iguales porciones de DV Tipos 1–4). Cada 6 mL del frasco de antígeno servirá
para aproximadamente 60 pruebas.
Para reconstituír el antígeno, añada exactamente 6 mL de la solución de reconstitución incluída. NO USE AGUA DESTILADA U OTRO REACTIVO QUE
EL INCLUIDO PARA RECONSTITUCION. LOS RESULTADOS DE LA PRUEBA SON INVALIDOS SI CUALQUIER OTRO MATERIAL ES
USADO PARA RECONSTITUCION. Permita que el antígeno se rehidrate a temperatura ambiente por una hora antes de usar: el antígeno debe ser
completamente disuelto antes de usar. Almacene el antígeno remanente entre 2 y 8°C hasta por 30 días después de la reconstitución. Si el antígeno remanente no
va a ser usado dentro de 30 días, prepare alíquotas y congele a –70°C o menos. Revuelva una sola vez.
Solución de Reconstitución del Antígeno, 13 mL REF EL1523 SOLV Ag
Antigen Reconstitution Solution, 13 mL
Un frasco conteniendo agua de cultivo celular, surfactante y azida sódica al 0.1%.
Celdas de IgM de Captura, 96 celdas REF EL1521 Ab IgM
IgM Capture Wells, 96 wells
12 bandas con ocho microceldas de poliestireno separables en un marco. Cada celda está cubierta con IgM anti-humano. Cada banda puede ser rota en celdas
individuales para uso costo efectivo. Para evitar la condensación, permita que las bandas de antígeno que alcancen temperatura ambiente antes de abrir los
paquetes sellados.
Conjugado de IgM, 16 mL REF EL1502 CONJ IgM
IgM Conjugate, 16 mL
Un frasco de anti-flavivirus de ratón afinidad-purificado y conjugado con peroxidasa. Contiene proteína, tampón y conservantes.
Control detectable para IgM, 0.30 mL REF EL1515 CONTROL >
IgM Detectable Control, 0.30 mL
Un frasco de suero humano. Contiene azida sódica al 0,1% como conservante. Requiere dilución antes de su uso (ver más abajo Muestra, controles y
preparación del calibrador).
Control no detectable, 0.30 mL REF EL1512 CONTROL <
Non-Detectable Control, 0.30 mL
Un frasco de suero humano para cada nivel de control. Contiene azida sódica al 0.1% como preservativo. Requiere dilución antes de usar (vea Preparación del
Espécimen, Controles y Calibrador, abajo).
Calibrador Límite de IgM, 0.30 mL REF EL1503 CONTROL CAL
IgM Cut-Off Calibrator, 0.30 mL
Un frasco de suero humano. Contiene azida sódica al 0.1% como preservativo. Requiere dilución antes de usar (vea Preparación del Espécimen, Controles y
Calibrador, abajo).
Diluyente de Muestra, 100 mL REF EL1608 DIL SPE
Sample Diluent, 100 mL
Un frasco de proteína, surfactante y conservantes en PBS.
Tampón de Lavado 10X, 100 mL REF EL0405 BUF WASH
10X Wash Buffer, 100 mL
Un frasco de surfactante en PBS con conservantes. Prepare una solución tampón de lavado 1X antes de usar.
Para preparar una solución tampón de lavado 1X, mezcle 100 mL del Tampón de Lavado 10X con 900 mL de agua destilada (o desionizada) y enjuague
cualquier cristal. Use únicamente agua purificada de alto grado para reconstitución del tampón de lavado. Se ha observado que algunas fuentes de agua
desionizada contienen materiales que pueden interferir en la prueba. Revuelva hasta que esté bien mezclado y todos los cristales estén disueltos.
Reactivo del Sustrato, 16 mL REF EL0009 SUBS TMB
Substrate Reagent, 16 mL
Un frasco de tetrametilbenzidina (TMB) y peróxido de rábano en tampón. Un color azul oscuro indica contaminación con peroxidasa; y si esto ocurre, use un
frasco nuevo. Listo para usar.
Reactivo de Paro, 16 mL REF EL0105 SOLN STOP
Stop Reagent, 16 mL
Un frasco de ácido sulfúrico 1 M.
Cinta selladora
Tres láminas de cinta selladora.
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MATERIALES ADICIONALES REQUERIDOS

1. Agua destilada
2. Botella de lavado de 250 o 500 mL
3. Cilindro graduado de 1 L
4. Tubos de ensayo para diluciones de suero
5. Pipeta de 10 µL con puntas desechables
6. 100 µL con puntas desechables (pipeta de ocho canales de 100 µL es recomendada para corridas sobre 48 celdas)
7. Pipeta o dispensador de 1 mL
8. Pipeta de 5 mL
9. Reloj
10. Toallas de papel o papel absorbente
11. Fregadero
12. Mezclador Vortex o equivalente
13. Espectrofotómetro para platos de ELISA, longitud de onda = 450 nm
ESTABILIDAD Y MANIPULACION
1. Los paquetes y los reactivos del paquete son estables hasta el fin del mes indicado en la fecha de expiración de la etiqueta cuando son almacenados entre 2
y 8°C.
2. No use los paquetes de evaluación o reactivos si están vencidos.
3. No exponga los reactivos a luz intensa durante la incubación o almacenaje.
4. Permita que los reactivos alcancen temperatura ambiente antes de usar.
CUIDADOS Y PRECAUCIONES:
1. Este prospecto es sólo para exportación y no para su distribución en Estados Unidos. Fuera de Estados Unidos, este kit es para uso diagnóstico in vitro.
2. Todos los productos sanguíneos deben ser tratados como potencialmente infecciosos. Los materiales de los cuales este producto fué derivado (incluyendo
los controles), han sido evaluados por métodos aprobados por la FDA y se encontraron negativos para antígeno de superficie de Hepatitis B, anticuerpo de
Hepatitis C y anticuerpo para VIH-1/2 (SIDA). Sin embargo como ningún método conocido puede ofrecer seguridad en un 100%, que los productos
derivados de sangre humana no transmitirán estos u otros agentes infecciosos, todos los controles, muestras de suero, y el equipo que está en contacto con
estos especímenes deben ser considerados potencialmente infecciosos y descontaminados o desechados usando precauciones de bioseguridad apropiadas.
9,10

3. El antígeno liofilizado contiene cuatro cepas de DV inactivado; sin embargo, el reactivo debe ser considerado potencialmente infeccioso y manejado
apropiadamente.
4. El reactivo de paro contiene ácido sulfúrico. No permita el contacto con la piel o los ojos. Si se expone, lávese con cantidades copiosas de agua.
5. Azida sódica a una concentración de 0.1% ha sido añadida a algunos reactivos como un agente antibacteriano. Para prevenir la formación de azidas
metálicas explosivas en las tuberias de plomo y cobre, los controles deben ser descartados en un desague únicamente si son diluídos y lavados con grandes
volúmenes de agua. Use sistemas de drenaje libres de cobre y plomo donde sea posible. Ocasionalmente descontamine los drenajes con hidróxido de sodio
al 10% (PRECAUCION: cáustico), permita estar por 10 minutos, luego enjuague con grandes volúmenes de agua.
6. No sustituya o mezcle reactivos de diferentes grupos de paquetes o de otros fabricantes.
7. Use únicamente protocolos descritos en esta publicación. Tiempos de incubación o temperaturas otros que los especificados pueden dar resultados erróneos.
8. Contaminación cruzada de los especímenes de pacientes pueden causar resultados erróneos. Añada los especímenes de pacientes y maneje cuidadosamente
las bandas de las celdas de IgM por captura para evitar mezclar los sueros de celdas adyacentes. Evite la contaminación del reactivo de sustrato con trazas
del conjugado enzimático.
9. La contaminación bacteriana de los especímenes séricos o reactivos puede producir resultados erróneos. Use técnicas asépticas para evitar la contaminación
microbiana.
10. Desarrolle la prueba a temperatura ambiente (rango aproximado de 20 a 25°C).
11. Use técnicas apropiadas de pipeteo, manteniendo el patrón de pipeteo a lo largo del procedimiento para asegurar valores óptimos y reproducibles.
RECOLECCION Y PREPARACION DE ESPECIMENES
El suero es la fuente de espécimen preferida. Ningún intento se ha hecho para evaluar la compatibilidad de la prueba con otros especímenes. Suero
hiperlipidémico, hemolizado, inactivado por el calor o contaminado puede causar resultados erróneos: por lo tanto su uso debe ser evitado.
Recolección y Manipulación de Especímenes
Recolecte las muestras sanguíneas asépticamente usando técnicas de venopunción aprobadas por personal calificado. Permita que las muestras se coagulen a
temperatura ambiente antes de centrifugarlas. Transfiera el suero asépticamente a un recipiente estéril fuertemente sellado para almacenaje entre 2 y 8°C. Si la
evaluación va a ser retardada más de cinco días, la muestra debe ser congelada a –20°C o menos. Descongele y mezcle bien las muestras antes de usar.
Preparación del Espécimen, Controles y Calibrador
Diluya cada espécimen, control y calibrador 1:101 como sigue: etiquete los tubos y dispense 1 mL de Diluyente de Muestra en cada tubo etiquetado. Añada 10
µL de espécimen, control o calibrador a cada tubo correspondiente que contenga el 1mL de diluyente de la muestra y mezcle bien con Vortex.
PROCEDIMIENTO
El IgM ELISA por Captura para Denge de Focus Diagnostics puede ser usado en cualquiera de dos formas. El protocolo clásico del CDC usa un paso de incubación del
antígeno por captura en la noche; o como una alternativa, el paso de incubación del antígeno por captura puede ser acortado 1 hora a temperatura ambiente.
1. Permita que los reactivos alcancen temperatura ambiente antes de usar. Remueva el Paquete de Celdas de IgM por Captura del almacenamiento en frío.
Para evitar condensación, permita que las bandas de microceldas alcancen temperatura ambiente antes de abrir el recubrimiento del paquete. Si se va a usar
menos que el plato completo, regrese las bandas sin usar al paquete recubierto con desecante y reselle completamente. Almacene las celdas de IgM por
Captura no usadas entre 2 y 8°C. (Nota: Al final de la prueba, retenga el marco para usar con las bandas remanentes.)
2. Prepare la solución del Antígeno (asegúrese que el reactivo ha alcanzado temperatura ambiente). Si el paquete es usado por primera vez, reconstituya
suficiente antígeno (vea Materiales Incluídos, arriba).
3. Llene las celdas con Solución Tampón de Lavado 1X (vea Materiales Incluídos, arriba) y permita que se humedezcan por 5 minutos. Decante (o aspire)
las celdas de antígeno y remueva vigorosamente el tampón de lavado. Coloque las celdas vaciadas de antígeno por captura boca abajo en toallas de papel
limpio o papel absorbente para remover el tampón de lavado residual.
4. Dispense 100 µL del Diluyente de Muestra en las celdas de “blanco” y 100 µL de cada espécimen diluído, control o calibrador (vea Preparación del
Espécimen, Controles y Calibrador, arriba) en las celdas apropiadas. (Nota: Para series con más de 48 celdas se recomienda que 250 µL de cada muestra
diluída sea añadida primero a un plato microtítulo vacío en la ubicación correspondiente a aquélla en las celdas de ELISA. Las muestras pueden ser
entonces eficientemente transferidas en las celdas de antígeno con una pipeta de 100 µL con 8- ó 12-canales.)
5. Cubra los platos con cinta de sellado, e incube por 60 ± 1 minutos a temperatura ambiente (20 a 25°C).
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6. Remueva la cinta de sellado, y vacíe el contenido de las celdas en el fregadero o recipiente de desechos.
7. Llene cada celda delicadamente con gotitas de solución Tampón de Lavado 1X y luego vacíe el contenido en el fregadero o recipiente de desechos.
8. Repita el paso de lavado (paso 7) por dos veces adicionales y permita que el último lavado permanezca por cinco minutos antes de decantar o aspirar.
9. Sacuda vigorosamente las celdas de captura para remover el tampón de lavado 1X. Coloque las celdas de captura vaciadas boca abajo en toallas de papel
limpio o papel absorbente para remover el tampón de lavado 1X residual.
10. Añada 100 µL de la Solución preparada (vea, paso 2 arriba) a todas las celdas, usando una pipeta de 100 µL con 8- ó 12-canales.
11. Cubra los platos con cinta de sellado e incube. Incube por 1 hora a temperatura ambiente (20 a 25°C).
12. Repita los pasos de lavado 6 hasta el 9.
13. Añada 100 µL de Conjugado de IgM a todas las celdas, usando una pipeta de 100 µL con 8- ó 12-canales.
14. Cubra los platos con cinta de sellado e incube. Incube por 30 ± 1 minutos a temperatura ambiente (20 a 25°C).
15. Repita los pasos de lavado 6 al 9.
16. Añada 100 µL de Reactivo de Sustrato a todas las celdas, usando una pipeta de 100 µL con 8- ó 12-canales. Comienze a medir el tiempo de incubación
con la adición del reactivo de sustrato a la primera celda. (Nota: Nunca coloque el reactivo de sustrato en el mismo recipiente que fué usado para el
conjugado.)
17. Incube por 10 ± 1 minutos a temperatura ambiente (20 a 25°C).
18. Detenga la reacción añadiendo 100 µL de Reactivo de Paro a todas las celdas usando una pipeta de 100 µL con 8- ó 12-canales. Añada el reactivo de paro
en la misma secuencia y al mismo ritmo que fué añadido el sustrato. En las celdas de anticuerpo positivo, el color debe cambiar de azul a amarillo.
19. Seque gentilmente el fondo exterior de las celdas con una toalla de papel para remover gotas que pudieran interferir con la lectura en el espectrofotómetro.
No friccione con la toalla de papel ya que puede rayar la superficie óptica de la celda. (Nota: Burbujas grandes en la superficie del líquido pueden afectar
las lecturas de OD.)
20. Mida la absorbancia de cada celda dentro de 1 hora de parar la prueba. Ajuste el espectrofotómetro a una longitud de onda de 450 nm. Ajuste el cero del
instrumento con las celdas vacías.
Procedimiento para IgM (versión abreviada)
1. Diluya las muestras 1:101 en el diluyente de muestras. (p. ej., 10 µL + 1000 µL).
2. Remoje los pocillos durante 5 minutos con solución de lavado 1X, decante.
3. 100 µL de muestra e incube por 60 minutos, decante.
Opcional para la sustracción del fondo: Se añaden 100 µL de muestra diluida a cada uno de los dos pocillos siguientes: a un pocillo (el pocillo “Ag”,
donde “Ag” significa antígeno) se le añade antígeno del DV en el paso 5 y al otro pocillo (el pocillo “DM”, donde “DM” significa diluyente de muestras)
se le añade diluyente de muestras en el paso 5. Nota importante: la sustracción del fondo es un método para determinar la presencia de anticuerpos
heterófilos en las muestras con resultados positivos. Por lo tanto, no se debe realizar dicho procedimiento cuando el resultado inicial de la muestra del
paciente no haya sido positivo.
4. Lave 3 veces.
5. 100 µL de antígeno e incube por 60 minutos, decante.
Opcional para la sustracción del fondo: Añada 100 µL de antígeno al pocillo “Ag” y 100 µL de diluyente de muestras al pocillo “DM”; incube durante
60 minutos.
6. Lave 3 veces.
7. 100 µL de conjugado e incube por 30 minutos, decante.
8. Lave 3 veces.
9. 100 µL de reactivo sustrato e incube por 10 minutos.
10. 100 µL de reactivo de parada, lea a λ = 450 nm.

Consulte la sección “PROCEDIMIENTO” para información importante.

CONTROL DE CALIDAD
Cada serie de platos (o bandas o celdas de un plato único) debe incluír el calibrador límite y todos los dos controles. Si se corren múltiples platos, incluya el
calibrador límite y los dos controles en cada plato. Se recomienda que hasta que el usuario se familiarice con el rendimiento del paquete, todos los especímenes,
controles y el calibrador de corte deben ser corridos en duplicado, duplicando una vez más el calibrador límite por un total de cuatro celdas. Si se utilizan celdas
únicas, el calibrador límite debe ser corrido en triplicado. Incluya un mínimo de una celda blanco (que contenga únicamente diluyente de muestra) para
calibración del instrumento.
El calibrador límite ha sido formulado para dar la diferenciación óptima entre los sueros positivos y negativos. Después de sustraer las celdas blanco, la OD del
calibrador límite es aproximadamente 0.250 unidades. Debido a las condiciones diferentes de los laboratorios los valores de absorbancia pueden diferir
significativamente. Un rango de 0.100 a 0.500 unidades de OD es típico. Todos los replicados de ODs del calibrador límite deben estar dentro de 0.100 unidades
de absorbancia del promedio. El rendimiento y la integridad del resultado son una función de los valores índice para los controles, no del solo valor absoluto de
OD del calibrador límite.
Reporte los resultados como Valores Indice relativos al calibrador límite. Para calcular los Valores Indice, divida los valores de densidad óptica (OD) del
espécimen (corregidos por las lecturas del blanco) por el promedio de los valores de absorbancia corregidos del calibrador límite.
1. Los valores índice del Control detectable deben estar entre 1.5 y 3.5.
2. Los valores índice del Control no detectable deben ser menores que 0.8.
Si el calibrador o los controles no están dentro de estos parámetros, los resultados de la prueba del paciente deben ser considerados inválidos y la
prueba debe repetirse.
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Cálculo de los resultados de la sustracción del fondo

Paso 1. Calcule el índice para los controles dividendo la DO de los controles entre la DO del nivel de corte.

Índice para los controles (índice del nivel de corte y los controles) = DO "Ag"/DO NC

Paso 2. Calcule el índice para las muestras del paciente calculando primero la DO neta del paciente (restando la DO “DM” de la DO “Ag”)y dividiendo a
continuación la DO neta del paciente entre la DO del nivel de corte.

DO neta del paciente = DO “Ag” – DO “DM”

Índice para las muestras del paciente = DO neta del paciente/DO NC

Paso 3. Interprete los resultados usando los rangos indicados en la Sección de interpretación (es decir, negativo < 1,00 y positivo> 1,00).

Ejemplo del cálculo de los resultados de la opcional sustracción del fondo

DO* Paso 1 Paso 2 Paso 3
Dividir la DO de los Restar la DO DM de Dividir la DO neta
controles entre la DO la DO Ag entre la DO del nivel
ID del nivel de corte de corte
DO Ag DO DM Interpretación
DO Ag/DO NC DO Ag – DO DM DO neta/DO NC
= índice para los = DO neta para los = índice para los
controles pacientes pacientes
Control no detectable 0,008 0,02
Nivel de corte 0,400 1,00
Control detectable 1,200 3,00
Muestra A 0,860 0,020 0,840 2,10 POS
Muestra B 0,890 0,010 0,880 2,20 POS
Muestra C 0,760 0,720 0,040 0,10 NEG
* La DO del blanco se ha restado previamente de cada uno de los resultados.

Discusión de los ejemplos de cálculo de la sustracción del fondo

Las muestras A y B deberían interpretarse como positivas para IgM debido a que tras la sustracción del fondo el índice sigue siendo mayor que 1,00 (los pocillos
sin antígeno no presentaron reactividad).

La muestra C pone de manifiesto la importancia de la sustracción del fondo. Dicha muestra presentó reactividad también cuando se añadió diluyente de muestras
en lugar de antígeno del virus del Dengue, lo que indica que la muestra contenía anticuerpos que estaban produciendo el enlace entre los anticuerpos de captura
IgM y el conjugado monoclonal. La muestra C debería considerarse negativa para IgM debido a que tras la sustracción del fondo el valor del índice fue de 0,10, y
0,10 es menor que 1,00 (es decir, dentro de la zona de interpretación negativa).

INTERPRETACION DE RESULTADOS
Reporte todos los resultados de pacientes como Valores Indice relativos al calibrador límite: para calcular los valores índice, divida los valores de densidad
óptica (OD) del espécimen (corregido por las lecturas del blanco) por el promedio de los valores de absorbancia corregidos del calibrador límite.
> 1.00 Positivo. Un valor índice de >1.00 es presuntivo de la presencia de anticuerpos IgM contra el virus del Dengue.
< 1.00 Negativo. Un valor índice de <1.00 indica que no fueron detectados anticuerpos IgM contra el virus del Dengue.

LIMITACIONES
1. El virus del Dengue es u flavivirus. Otros miembros de este grupo incluyen los virus Banzi, Bussuquara, Iiheus, de la Encefalitis Japonesa, de la Encefalitis
de San Luis, de la Encefalitis del Valle Murray, Rocio, Kunjin, Spondweni, Sepik, del Oeste del Nilo, de la Fiebre amarilla, Zika, Wesselsbron, del Rio
Bravo, de la Encefalitis de Europa Central, de la primavera-verano de Rusia, de la Enfermedad del bosque Kyasanur, de la Enfermedad Louping, Negishi,
de la fiebre hemorrágica Omsk y Powassan. Mientras que la mayoría de éstos virus raramente causan enfermedad en humanos, o están restringidos a
regiones geográficas pequeñas, las reacciones cruzadas entre miembros de la familia Flaviviridae son comunes. Por lo tanto, se debe tener cuidado en
interpretar los resultados antes que se haga un diagnóstico definitivo de Dengue. Estas pruebas no fueron creados como un sustituto de las impresiones
clínicas del médico internista.
2. Todos los resultados de ésta y otras serologías deben ser correlacionados con la historia clínica, los datos epidemiológicos, y otros datos disponibles al
médico tratante para hacer un diagnóstico de Dengue.
3. Si se reporta un resultado negativo para un paciente en quién se sospecha fuertemente de Dengue por las datos clínicos o epidemiológicos, una segunda
muestra debe ser obtenida 7 a 10 días después de la aparición de la enfermedad y reevaluada para anticuerpos clase IgM.
VALORES ESPERADOS
En un estudio no publicado se observó que a los 7 días después de la aparición más del 90% de los casos confirmados de Dengue tuvo IgM detectables por
ELISA, y a los 10 días después de la aparición, el 93% tuvo IgM detectables por ELISA8. El suero de pacientes sin signos, síntomas o historia previa de Dengue
deben dar un resultado de la prueba negativo con este procedimiento.
CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO
Para clientes fuera de los Estados Unidos, las características de rendimiento del producto son incluídas en una hoja separada.
 ELISA IgM por Captura para Virus del Dengue
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REFERENCIAS
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Inc., New York.
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