ES

DENGUE ELISA IgM CAPTURE

M1018: Prueba para la deteccin de IgM a virus dengue en suero humano.
96 tests.

Conjugado dengue-peroxidasa

INTRODUCCIN:
IgM humana

El dengue (DF) y la fiebre hemorrgica por dengue (DHF) son causados

por uno de los 4 serotipos del virus del gnero Flavivirus que aunque muy
relacionados son antignicamente distintos (DEN-1, DEN-2, DEN-3, y
DEN-4). DF y DHF son enfermedades de reas principalmente tropicales y
subtropicales. Los 4 serotipos de dengue se mantienen en un ciclo que
implica a humanos y al mosquito Aedes. Las infecciones producen un
espectro de enfermedad clnica que va desde sndrome viral inespecfico a
enfermedad hemorrgica severa y fatal. Las manifestaciones clnicas
incluyen erupcin, repentino comienzo de fiebre, escalofrios, dolores de
cabeza severos, nauseas, mialgias y artralgias, leucopenia, trombocitopenia
y manifestaciones hemorrgicas. Ocasionalmente produce shock y
hemorragia causando la muerte. Un importante factor de riesgo para DHF
es la cepa del virus que produzca la infeccin, as como la edad y
especialmente la historia de infecciones previas por dengue del paciente.
La viremia por dengue parece ser universal en pacientes febriles con
dengue; ocurre previo al comienzo de la fiebre y los sntomas y tiene un
pico de 23 das tras el comienzo de la enfermedad. Un diagnstico de
infeccin aguda con el virus dengue puede realizarse aislando el virus o
por deteccin del genoma viral o el antgeno. Serolgicamente, una
infeccin primaria con dengue resulta en niveles detectables de anticuerpos
IgM hacia el tercer da de infeccin sin fiebre. Estos anticuerpos IgM
persisten durante 12 meses tras la infeccin. Los anticuerpos IgG son
detectados aproximadamente 14 das tras el comienzo de la infeccin
primaria. Las infecciones secundarias con el virus dengue, se caracterizan
por un rpido incremento de los niveles de anticuerpos IgG. Debido al
incremento relativamente tardo de los niveles de anticuerpos hasta una
concentracin que pueda ser detectada diagnosticamente, un resultado
negativo de un test de deteccin de anticuerpos temprano en el curso de la
enfermedad no es definitivo. Las muestras deberan ser recogidas al menos
7 das tras el comienzo de los sntomas para excluir la posibilidad de una
infeccin aguda por virus dengue.
La serologa es la tcnica mas ampliamente empleada en diagnstico de
rutina. Tradicionalmente se han usado los test de inhibicin de la
hemaglutinacin y neutralizacin de virus. Los ELISAs para anticuerpos
IgM e IgG son los standards para el anlisis serolgico de las infecciones
del virus dengue, ya que son simples y permiten testar una gran cantidad
de muestras.
FUNDAMENTO DEL MTODO:
Mtodo de ELISA basado en la captura de IgM presente en la muestra por
anticuerpos anti-IgM unidos a la superficie de poliestireno. Las
inmunoglobulinas no unidas son eliminadas en el proceso de lavado. En un
paso posterior el antgeno conjugado con peroxidasa reacciona con las IgM
capturadas y el que no se une es eliminado por los lavados; el antgeno
unido reacciona con el sustrato (TMB), para dar una reaccin coloreada
azul, que cambia a amarillo tras la adicin de la solucin de parada.

Anti-IgM humana

CARACTERSTICAS:
Todos los reactivos a excepcin de la solucin de lavado y el antgeno
vienen listos para su uso.
La solucin de dilucin de muestras est coloreada como ayuda a la
realizacin de la tcnica.
Los pocillos son individuales, por lo que slo se consumen tantos pocillos
como pruebas se van a realizar.
CONTENIDO DEL KIT:
1 VIRCELL IgM CAPTURE PLATE: 1 placa con 96 pocillos recubiertos
con anticuerpo anti-IgM ( especfico).
2 VIRCELL SERUM DILUENT: 25 ml de diluyente para sueros: tampn
fosfatos con estabilizante de protenas, con Proclin y coloreado de azul.
Listo para su uso.
3 VIRCELL IgM POSITIVE CONTROL: 1,5 ml de control positivo con
Proclin. Listo para su uso.
4 VIRCELL IgM CUT OFF CONTROL: 2 viales de1,5 ml de cut off con
Proclin. Listo para su uso.
5 VIRCELL IgM NEGATIVE CONTROL: 1,5 ml de control negativo con
Proclin. Listo para su uso.
6 VIRCELL DENGUE ANTIGEN: 5 viales de antgenos de virus dengue
tipo 1 cepa Hawai, tipo 2 cepa New guinea C, tipo 3 cepa H87 y tipo 4
cepa H241 inactivado, liofilizado, contiene Procln.
7 VIRCELL TMB SUBSTRATE SOLUTION: 15 ml de solucin de
sustrato: tetrametilbenzidina (TMB). Listo para su uso.
8 VIRCELL STOP REAGENT: 15 ml de solucin de parada: cido
sulfrico 0,5 M.
9 VIRCELL WASH BUFFER: 50 ml de solucin de lavado (concentrado
20x): tampn fosfatos con TweenR-20 y con Proclin.
10 VIRCELL DENGUE CONJUGATE SOLUTION: 17 ml de solucin
tamponada para la reconstitucin del conjugado liofilizado, conteniendo un
anticuerpo monoclonal anti-dengue marcado con peroxidasa. Contiene
Procln.
Conservar entre 2 y 8C y comprobar la fecha de caducidad.
Material necesario no contenido en el kit:
Pipeta de precisin para dispensar 5 y 100 l.
Pipeta multicanal de precisin para dispensar 100 l.
Lavador de placas de ELISA.
Incubador/bao termostatizado.
Espectrofotmetro de placas de ELISA con filtro de 450 nm y filtro de
referencia de 620 nm.
Agua destilada.
Alternativamente procesador automtico de ELISA.
CONSERVACIN:
Conservar entre 2 y 8C. No utilizar los componentes del kit despus de la
fecha de caducidad. La caducidad indicada ser vlida siempre que los
componentes se mantengan cerrados y conservados entre 2 y 8C.

PRODUCTO PARA DIAGNSTICO IN VITRO

Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Domnguez Ortiz 1. Polgono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712

http://www.vircell.com

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CONSERVACIN Y ESTABILIDAD DE LOS COMPONENTES

UNA VEZ ABIERTOS:
COMPONENTE
Solucin de lavado diluida
(1x)
Complejo
antgenoconjugado reconstituido
Resto de componentes

ESTABILIDAD
4 meses a 2-8C
2 meses a 2-8C
Fecha indicada en envase a 2-8C

ESTABILIDAD Y USO DE LOS REACTIVOS:

Usar todos los reactivos en condiciones aspticas para evitar
contaminaciones microbianas.
No permitir el secado de la placa entre los lavados y la adicin de los
reactivos.
La solucin de sustrato es fotosensible. Evitar la exposicin directa a la luz
y desechar si presenta coloracin azul. La solucin de sustrato no debe
entrar en contacto con oxidantes como soluciones de hipoclorito ni con
algunos metales. Evitar el contacto con partes metlicas o componentes
metlicos de equipos o instrumentos sin antes haber comprobado su
compatibilidad.
Utilizar slo la cantidad de solucin de lavado, sustrato, diluyente de
sueros y conjugado necesarias para la realizacin de la prueba. No
devolver a los viales el exceso sobrante.
VIRCELL, S.L. no se responsabiliza de la inadecuada utilizacin de los
reactivos contenidos en el kit.
RECOMENDACIONES Y PRECAUCIONES:
1.
2.

3.
4.
5.
6.

7.

Este producto es slo para diagnstico in vitro y est destinado al uso

por personal sanitario cualificado.
Usar slo componentes del kit. No mezclar los componentes de
diferentes kits o fabricantes. Slo las soluciones de lavado, sustrato,
parada y diluyente de sueros son compatibles con los equivalentes en
otras referencias y lotes de ELISA CAPTURA VIRCELL.
Utilizar puntas de pipeta diferentes y limpias para cada fase del
ensayo. Utilizar slo material limpio y preferentemente desechable.
No utilizar en caso de deterioro del envase.
No pipetear con la boca.
El diluyente para sueros, placa, conjugado, solucin de reconstitucin
y controles de este equipo contienen material de origen animal. Los
controles contienen adems material de origen humano. Aunque los
sueros control del equipo son sometidos a controles de ausencia de
HBsAg y anticuerpos frente a VIH y de Hepatitis C, es necesario
manejar los controles y muestras del paciente como potencialmente
patgenos. El complejo antgeno-conjugado reconstituido contiene
antgeno de dengue inactivado, no obstante, debe manejarse con
precaucin. Ningn mtodo actual puede asegurar por completo la
ausencia de stos u otros agentes infecciosos. Todo el material debe
ser manipulado y desechado como potencialmente infeccioso.
Observe la regulacin local en materia de residuos clnicos.
La solucin de sustrato puede ser irritante para piel y mucosas. En
caso de contacto con esta solucin lavar la superficie afectada con
agua y solicitar asistencia mdica. Para ms informacin, solicite la
hoja de seguridad del producto.

TOMA DE MUESTRA:
La sangre debe extraerse en condiciones aspticas mediante tcnicas de
venipuntura por personal experimentado. Se recomienda el uso de tcnicas
estriles o aspticas para evitar la contaminacin de la muestra. Los sueros
deben mantenerse refrigerados entre 2 y 8C si se van a procesar dentro de
los 7 das siguientes a la toma, pero si el procesamiento se va a prolongar
deben congelarse a -20C, evitando las congelaciones y descongelaciones
innecesarias. No utilizar sueros hiperlipmicos, hemolizados o
contaminados. Los sueros que presenten partculas pueden ser clarificados
por centrifugacin. Pueden utilizarse muestras de suero o plasma
indistintamente.

PREPARACIN DE LOS REACTIVOS:

Es necesario preparar con antelacin a la realizacin de la prueba la
solucin de lavado. Para ello completar hasta 1 litro con agua destilada un
vial de 50 ml de solucin de lavado concentrada (20x). Si aparecen
cristales durante la conservacin de la solucin concentrada, calentar a
37C antes de diluirlo. Una vez preparada conservar entre 2 y 8C.
El complejo antgeno-conjugado debe ser preparado al menos una hora
antes de ser usada. Aadir 3 ml de solucin de conjugado 10 a un vial de
antgeno liofilizado 6. Dejar durante un minuto para permitir la
rehidratacin y mezclar vigorosamente mediante vortex. El complejo
antgeno-conjugado reconstituido puede ser usado durante 2 meses si es
almacenado entre 2-8C.
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO:
1.-Ajustar una estufa/bao de agua a 371C.
2.-Sacar todos los reactivos 1 hora antes de la realizacin del test para que
alcancen la temperatura ambiente, evitando sacar la placa del envase.
3.-Agitar todos los componentes.
4.-Sacar el nmero de pocillos 1 necesarios para el nmero de sueros que
se van a procesar, ms otros cuatro pocillos, uno para el control positivo,
uno para el control negativo y dos para el suero cut off. Colocar el resto de
los pocillos en el sobre y volver a cerrarlo.
5.-Realizar en tubos aparte una dilucin 1/20 de los sueros, para ello poner
5 l de suero en 95 l de diluyente de muestras 2, rotularla como dilucin
1/20.
6.-Aadir 80 l de diluyente de muestras 2 a todos los pocillos que se
vayan a emplear, excepto a los de los controles. Aadir 20 l de las
diluciones 1/20 de las muestras, 100 l del control positivo 3, 100 l del
suero cut off 4 (en duplicado) y 100 l del control negativo 5 en los
pocillos correspondientes.
7.-Tapar mediante lmina adhesiva e incubar en estufa/bao durante 60
minutos a 371C.
8.-Preparar el complejo antgeno-conjugado segn se indica en
Preparacin de los reactivos.
9.-Retirar la lmina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y
lavar cada uno de ellos 5 veces con 0,3 ml de solucin de lavado 9,
asegurndose que no quedan restos de solucin de lavado.
10.-Aadir inmediatamente 100 l del complejo antgeno-conjugado
reconstituido a todos los pocillos.
11.-Tapar mediante lmina adhesiva e incubar en estufa/bao durante 60
minutos a 371C.
12.-Retirar la lmina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y
lavar cada uno de ellos 5 veces con 0,3 ml de solucin de lavado 9,
asegurndose que no quedan restos de solucin de lavado.
13.-Aadir inmediatamente 100 l de solucin de sustrato 7 a todos los
pocillos.
14.-Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos, en la oscuridad.
15.-Aadir inmediatamente 50 l de solucin de parada 8 a todos los
pocillos.
16.-Valorar espectrofotomtricamente a 450/620 nm, antes de 1 hora de
acabado el ensayo.
CONTROL DE CALIDAD INTERNO:
Cada lote se somete a control de calidad interno antes de su liberacin
asegurando el cumplimiento del protocolo de validacin por el usuario
mediante especificaciones ms estrictas. Los resultados de control final de
cada lote estn disponibles.
La correlacin del material de control se asegura mediante ensayos
paralelos frente a paneles de sueros de referencia internamente validados.
PROTOCOLO DE VALIDACIN POR EL USUARIO:
Cada ensayo debe utilizar control positivo, negativo y cut off. Su
utilizacin permite la validacin de la prueba y el equipo.
Las densidades pticas (D.O.) de los controles deben estar en los rangos
siguientes. En caso contrario se desechar la prueba.

PRODUCTO PARA DIAGNSTICO IN VITRO

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CONTROL
CONTROL POSITIVO
CONTROL NEGATIVO

PRECISIN INTRAENSAYO:

D.O.
>0,9
<0,5
>0.55
<1.5

CONTROL CUT OFF

Se ensayaron 3 sueros pipeteados individualmente 10 veces cada uno en un

nico ensayo realizado por el mismo operador en condiciones de trabajo
idnticas, obteniendo los resultados:
SUERO
N
% C.V.
CP
10
0,93
CN
10
4,95
CO
10
2,25
C.V. Coeficiente de variacin

INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
Calcular la media de las D.O. del suero cut off.
ndice de anticuerpos=(D.O. de la muestra / media de D.O. del suero cut off) x 10

INDICE
<9
9-11
>11

PRECISIN INTERENSAYO:
Se ensayaron 3 sueros pipeteados individualmente durante 5 das
consecutivos y por 2 operadores diferentes, obteniendo los siguientes
resultados:

INTERPRETACIN
Negativo
Dudoso
Positivo

Las muestras con resultados dudosos deben ser vueltas a analizar y/o
solicitar una nueva muestra para confirmacin de los resultados.
Las muestras con ndices inferiores a 9 se considera que no tienen
anticuerpos especficos frente a dengue de tipo IgM.
Las muestras con ndices superiores a 11 se considerar que tienen
anticuerpos especficos frente a dengue de tipo IgM.
LIMITACIONES DEL MTODO:
1.-Este mtodo est diseado para ser utilizado con suero humano.
2.-El uso de este kit requiere la cuidadosa lectura y comprensin del folleto
de instrucciones. Es necesario seguir estrictamente el protocolo para
obtener resultados fiables, en particular el correcto pipeteo de muestras y
reactivos, lavados y tiempos de incubacin.
3.-Los resultados de las muestras deben ser valorados junto con la
sintomatologa clnica y otros procedimientos diagnsticos. El diagnstico
definitivo debe realizarse mediante tcnicas de aislamiento.
4.-El test no indica el lugar de la infeccin. No pretende sustituir al
aislamiento.
5.-La ausencia de un aumento significativo en el nivel de anticuerpos no
excluye la posibilidad de infeccin.
6.-Una respuesta IgM puede acompaar algunas veces a una reinfeccin.
7.-En ocasiones niveles bajos de IgM podran persistir durante mas de 12
meses post-infeccin .
8.-En pacientes inmunodeprimidos un resultado negativo no excluye la
presencia de infeccin.
9.-La reactivacin de infecciones latentes puede no dar una respuesta de
anticuerpos IgM.

SUERO
N
% C.V.
CP
10
0,52
CN
10
3,16
CO
10
2,94
C.V. Coeficiente de variacin

REACCIN CRUZADA E INTERFERENCIAS:

Se ensayaron 11 muestras caracterizadas positivas frente a otros
microorganismos (citomegalovirus, Coxiella burnetii, Epstein-Barr virus y
Brucella).
Las muestras ensayadas dieron resultados negativos, demostrando la
reaccin especfica del ensayo sin reaccin cruzada o interferencias
ocasionadas por los agentes descritos.
SMBOLOS UTILIZADOS EN EL PRODUCTO:
Producto para el diagnstico in vitro
Fecha de caducidad
8C
Conservar entre 2-8C

2C

Contiene suficiente para <X> pruebas

Lote

Referencia (catlogo)

PRESTACIONES
Consultar instrucciones de uso

SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD:
TEST 1
Se ensayaron 196 muestras de suero con DENGUE ELISA IgM
CAPTURE frente a otro kit ELISA comercial. Se obtuvieron los siguientes
resultados:
IgM

<X> pocillos

Reconstituir en <X> l

N MUESTRAS
SENSIBILIDAD
ESPECIFICIDAD
196
98%
99%
Los valores indeterminados fueron excludos de los clculos finales

TEST 2
Se ensayaron 92 muestras de suero con DENGUE ELISA IgM CAPTURE
frente a otros kit ELISA comerciales. Se obtuvieron los siguientes
resultados frente al consenso:
IgM

N MUESTRAS
SENSIBILIDAD
ESPECIFICIDAD
92
98%
98%
Los valores indeterminados fueron excludos de los calculos finales

PRODUCTO PARA DIAGNSTICO IN VITRO

Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Domnguez Ortiz 1. Polgono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712

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RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO DE TRABAJO

MUESTRAS

20 l de dilucin de
muestras
80 l de diluyente de
muestras 2

CONTROLES

100 l de los controles

3 4 5

60 min a 37C
5 lavados con solucin de lavado 9

100 l de complejo antgeno-conjugado reconstituido

60 min a 37C
5 lavados con solucin de lavado 9

100 l de sustrato 7
20 min a temperatura ambiente en
oscuridad

50 l de solucin de parada 8

Lectura a 450/620 nm

BIBLIOGRAFA:
1. Alcon, S., A. Talarmin, M. Debruyne, A. Falconar, V. Deubel, and M.
Flamand. 2002. Enzyme-linked immunosorbent assay specific to Dengue
virus type 1 nonstructural protein NS1 reveals circulation of the antigen in
the blood during the acute phase of disease in patients experiencing
primary or secondary infections. J Clin Microbiol 40.
2. Falconar, A. K., E. de Plata, and C. M. Romero-Vivas. 2006. Altered
enzyme-linked immunosorbent assay immunoglobulin M (IgM)/IgG
optical density ratios can correctly classify all primary or secondary
dengue virus infections 1 day after the onset of symptoms, when all of the
viruses can be isolated. Clin Vaccine Immunol 13.
3. Matheus, S., X. Deparis, B. Labeau, J. Lelarge, J. Morvan, and P.
Dussart. 2005. Use of four dengue virus antigens for determination of
dengue immune status by enzyme-linked immunosorbent assay of
immunoglobulin G avidity. J Clin Microbiol 43.
4. Wichmann, O., K. Stark, P. Y. Shu, M. Niedrig, C. Frank, J. H. Huang,
and T. Jelinek. 2006. Clinical features and pitfalls in the laboratory
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5. Ocazionez RE, Cortes FM, Villar LA, Gomez SY. Temporal distribution
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incidence. Re-introduction of dengue-3 associated to mild febrile illness
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6. Videa E, Coloma MJ, Dos Santos FB, Balmaseda A, Harris E.
Immunoglobulin M enzyme-linked immunosorbent assay using
recombinant polypeptides for diagnosis of dengue. Clin Diagn Lab
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7. Matheus S, Deparis X, Labeau B, Lelarge J, Morvan J, Dussart P.
Discrimination between primary and secondary dengue virus infection by
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8. Shu PY, Huang JH. Current advances in dengue diagnosis. Clin Diagn
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9. Shu PY, Chen LK, Chang SF, Yueh YY, Chow L, Chien LJ, Chin C,
Lin TH, Huang. JH. Comparison of capture immunoglobulin M (IgM) and
IgG enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and nonstructural
protein NS1 serotype-specific IgG ELISA for differentiation of primary
and secondary dengue virus infections. Clin Diagn Lab Immunol. 2003
Jul;10(4):622-30.
10. Dengue diagnostics: proceedings of a joint TDR/WHO and PDVI
workshop. 46 October 2004 | WHO/TDR | Geneva, Switzerland
11. Dengue Fever and Dengue Hemorrhagic Fever. Infectious Disease
Information by the National Center for Infectious Diseases, CDC.
(http://www.cdc.gov/ncidod/)

Para cualquier aclaracin o consulta, contactar con:

customerservice@vircell.com

REVISADO: Marzo-12

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