Prctica No.

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DETERMINACIN ANTICUERPOS ANTI-V.I.H. (ELISA)
OBJETIVO
Determinacin de anticuerpos anti-VIH por el mtodo de ELISA.
FUNDAMENTO
El procedimiento estndar para la deteccin de anticuerpos anti-VIH es el ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en ingls), que
consiste en serie de pruebas sanguneas a fin de diagnosticar la infeccin por el
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), responsable del sndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
Cabe mencionar, que segn los especialistas la medicin de anticuerpos en
plasma o suero medianteELISA es el mtodo de rutina ms sensible para la
deteccin de anticuerposanti-VIH.
El ELISA se basa e el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima,
de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica
como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo)
marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la
reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente
revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima
producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotmetro o un colormetro. Los diferentes tipos de ELISA son los que se
enumeran a continuacin:
Anticuerpos marcados:
ELISA Directo
ELISA Indirecto
ELISA sndwich
Doble (DAS)
o Heterlogo (HADAS)
o
o
o
o

Antgeno marcado

o ELISA competitivo

GUA DE ESTUDIO

1. Qu es el antgeno VIH I/II?

El VIH es el virus causante del SIDA (sndrome de inmunodeficiencia adquirida).
El antgeno p24 es una protena vrica y sus niveles en sangre estn
caractersticamente elevados al inicio de la infeccin por el VIH.
2. Investiga que mtodos se emplean para esta prueba y cual es la diferencia
entre ellos.
La prueba de ELISA es la primera que se hace porque resulta barata, sencilla y da
resultados confiables. Si la prueba de ELISA sale negativa, no se hacen ms
pruebas. Cuando sale positiva, es preciso practicar la IFA o la Western Blot para
confirmar los resultados.
Se trata del mismo virus, que presenta diferencias genticas que permite
clasificarlos en dos tipos diferentes o serotipos. Sin embargo, sus genomas
tienen, solamente, un 45% de similitud. La diferencia funcional entre los dos virus
es que el nmero de VIH-2 circulantes en el organismo es menor, porque este tipo
de virus evoluciona ms lentamente; por ello, su periodo de incubacin es ms
largo, aunque ambos serotipos, finalmente, acaban causando el Sndrome de
Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA).
Como consecuencia del menor nivel de virus circulantes en el caso del VIH-2, la
enfermedad que origina es menos agresiva y su posibilidad de transmisin es
menor, lo que explica su reducida difusin.
3. En qu casos se realiza esta prueba

Personas que deseen hacerse la prueba.

Personas sexualmente activas.
Personas con ciertas afecciones e infecciones (como el sarcoma de Kaposi,
neumona porPneumocystis jirovecii).
Mujeres embarazadas para ayudar a evitar que le transmitan el virus a su
beb.

4. Cul es la prueba confirmativa de VIH

La confirmacin del diagnstico del VIH se basa en la presencia de anticuerpos
(Ac) frente al virus en el suero sanguneo humano. En primer lugar, se realiza la
prueba ELISA para VIH-1/2. Si con esa prueba se produce una reaccin positiva,
es decir, si se detectan anticuerpos frente al VIH en el suero, es necesario realizar
pruebas de confirmacin, que pueden ser la inmunofluorescencia (IFI), la
inmunotransferencia o el Western Blot.

La prueba de IFI es una prueba utilizada para confirmar la presencia de Ac frente

al VIH en muestras de suero humano. Comenz a usarse en Brasil hace casi 20
aos. Como es una prueba eficiente y se fabrica en Brasil, su costo es menor que
el de la prueba de Western Blot.
El Ministerio de Salud, a travs del Departamento de ITS, Sida y Hepatitis Virales,
cuenta con una red de laboratorios pblicos que realizan pruebas de IFI para el
VIH-1. Se trata de la Red Nacional de Inmunofluorescencia, compuesta por 141
laboratorios que reciben gratuitamente los kits para realizar las pruebas
serolgicas de IFI.

5. En qu casos se considera puede dar prueba positiva y no ser VIH

positivo
Un resultado negativo en el examen es normal. Sin embargo, las personas con
infeccin temprana por VIH (llamada infeccin aguda o infeccin primaria por VIH)
a menudo tienen un resultado negativo en el examen.
Un resultado positivo en la prueba de deteccin ELISA no significa
necesariamente que la persona tenga la infeccin por VIH. Hay ciertas afecciones
que pueden llevar a que se presente un resultado falso positivo, como
la enfermedad de Lyme, la sfilis y el lupus.
Una prueba ELISA positiva siempre va seguida de una inmunotransferencia
(Western blot) que, de ser tambin positiva, confirma una infeccin por VIH. Una
inmunotransferencia negativa significa que la prueba ELISA fue un examen falso
positivo. La inmunotransferencia tambin puede ser poco clara, en cuyo caso, se
hacen pruebas adicionales.

DIAGRAMA DE LA TCNICA

Extraccin
sangunea.

Dejar coagular

Agregar solucin
parado Stop.
Leer la micro placa.

Centrifug
ar

Seleccionar micro pozos

Separar plasma
sanguneo

Incubar.

Mover, incubar.

Agitar y lavar.

Agregar solucin de
antgeno conjugado
con HRP a cada
pocillo VIH.

Agregar TMB sustrato

solucin

Control
positivo,
negativo, muestra.
Espcimen diluyente.

TCNICA
1. Extraer 3 ml de sangre, dejar coagular y centrifugar durante 5 minutos a 3,000
r.p.m.
2. Separar el suero.
3. Seleccionar el nmero de micropozos a utilizar, de acuerdo al nmero de
muestras y controles a probar
Preparacin del Reactivo
1. Mantener los reactivos a temperatura ambiente y mezclar suavemente.

control

2. Prepare la solucin de lavado (1x) mediante la dilucin de 1 parte de la solucin

de lavado 30 x con 29 partes de agua des ionizada o destilada. Mezclar bien antes
de usar.
PROCEDIMIENTO
1. Asegure el nmero de tiras necesarias en el marco de plstico proporcionado. 2.
Dispense 50 ul (una gota) de cada uno de control negativo, control positivo y
muestras de ensayo en los pocillos apropiados.
3. Aadir 50 ul (una gota) de especmenes diluyente en cada pocillo.
4. Mueva suavemente los pozos durante veinte segundos, y luego cubrir los pozos
con una cinta adhesiva. Incubar los pocillos a 37 C durante 45 minutos. Nota:
Deseche la hoja adhesiva o cinta adhesiva y no volver a utilizarlo para evitar la
contaminacin.
5. Agite el lquido de los pocillos. Vaciar los pozos en lo posible por borrar el plato
boca abajo sobre un papel absorbente o toallas de papel.
6. Aadir 50 ul (una gota) de solucin de antgeno conjugado con HRP a cada
pocillo VIH.
7. Incubar los pocillos a 37 C durante 30 minutos
8. Agite el lquido de los pocillos y lave cada pocillo 5 veces con 250 a 300 ul de
tampn de lavado diluido cada vez. Es importante agitar completamente fuera todo
el lquido de los pocillos para cada momento de la etapa de lavado.
9. Agregue 100 ul (dos gotas) de TMB sustrato solucin a cada pocillo e incbelo a
37C por 10 minutos.
10. Aadir 100 ul (dos gotas) de solucin parado Stop a cada pocillo y agite
suavemente para mezclar bien.
11. Lea la micro placa con una lectura de 450 nm y mida la densidad ptica de
cada pocillo. Un filtro de 620 a 690 se puede utilizar como una longitud de onda de
referencia para optimizar el resultado.
Clculo e Interpretacin de los Resultados
El valor de corte = 0,100 + absorbancia media del control negativo. Si la
absorbancia media del control negativo es menor que 0,05, entonces usar 0,05
para el clculo del valor de corte.
Interpretaciones Relacin de la muestra

Negativo <1.00
Positivo >1.00
Un resultado negativo indica la ausencia o la no posibilidad de detectar
anticuerpos anti-VIH I/II en la muestra, Un resultado positivo es evidencia
presuntiva de la presencia de anticuerpos contra el VIH-1 y / o VIH-2 en la
muestra.
OBSERVACIONES
La determinacin anticuerpos ANTI-V.I.H. (ELISA) Se aplic para la deteccin del
virus de inmunodeficiencia humana, este tipo de pruebas se realiza de una
manera rpida para la deteccin de anticuerpos provocados por este virus y as
poder detectar la infeccin en su fase inicial, s la muestra resulta positiva, se debe
proseguir a relizar una prueba de confirmacin que podra ser el wester blot.

Tcnica de ELISA

Tira reactiva

RESULTADO
Negativo
CONCLUSIN
Se realiz la tcnica ELISA para la determinacin de anti-VIH en el cual se obtuvo
un resultado negativo, al aplicar esta tcnica pueden haber falsos positivos, se
recomienda proceder a realizar otras pruebas para verificar resultados.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Fundamentos y tipos de Elisa. Consultado el 20 de noviembre del 1026.
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf