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- Fuente de energía radiante: Su misión es brindar energía radiante en forma de luz que pasa por
un monocromador. Las lámparas de tungsteno son aceptables para mediciones en soluciones
moderadamente diluidas en las que las pequeñas diferencias de concentración producen
variaciones considerables de intensidad de color pero no poseen la energía suficiente para hacer
determinaciones en el rango UV por debajo de 320 nm por lo cual se usan lámparas de deuterio o
de arco de mercurio.
Rendija de entrada: Reduce al mínimo la luz dispersa y evita la penetración de luz difusa al
monocromador.
Monocromador: Aísla una longitud de onda específica mediante el uso de filtros en los
colorímetros y prismas o redes de difracción en los espectrofotómetros Los filtros se colocan de
manera adecuada y el prisma o red de difracción gira de manera adecuada logrando que la luz
monocromática necesaria incida pasando por la rendija de salida sobre la cubeta que contiene de
medición.
Es de vital importancia conocer el concepto de paso de banda (ancho del pico de máxima
absorbancia del equipo en un espectro de absorción) cuya obtención lo más estrecho posible
define la exactitud fotométrica. Hay equipos que logran entre 5 y 10 nm. Los fotómetros de filtro
utilizan filtros de interferencia que sólo logran un paso de banda entre 10 y 20 nm.
Cubetas de medición: Su función es mantener la solución en el equipo mientras se realiza la
lectura fotométrica. Pueden ser de varios materiales: vidrio, cuarzo o plástico, las de vidrio no son
aconsejables para las lecturas en el UV pues pueden absorber parte de esta radiación. Se han
diseñado cubetas plásticas de materiales con absorción casi nula entre 200 y 700 nm que son
baratas y en ciertos casos desechables. Debe tenerse una manipulación extremadamente
cuidadosa con las cubetas para evitar su más mínimo daño físico, ajustarlas correctamente en el
equipo y ajustarle su absorbancia.
En caso de usar cubetas de paredes redondas, deben marcarse para que siempre estén
colocadas en la misma posición, ver ejemplo de los Hb-metros y de los colorímetros ERMA. Si se
utilizan cubetas baratas no compensadas hay que medir con los blancos la tolerancia de cada
cubeta en cada una de las longitudes de onda utilizadas. Es muy importante observar que las
cubetas posean la misma numeración o de lo contrario deben calibrarse las lecturas y no pueden
intercambiarse de posición al leer.
Detector: Realiza la detección de la radiación luminosa que sale de la cubeta y la transforma en
corriente eléctrica que irá a un galvanómetro. Puede ser una celda fotoeléctrica o un tubo
fotomultiplicador, (tubo de electrones capaz de ampliar significativamente la corriente, construidos
con un material sensible a la luz que emite electrones en proporción a la energía radiante que
incida sobre su superficie liberando electrones por una amplificación en cascada). Cuando se
aplica un voltaje en él sin que incida alguna radiación se producirá cierta corriente llamada
corriente oscura que debe minimizarse pues aparecería como ruido de fondo.
Galvanómetro: Es quien mide la corriente recibida del detector y traduce la señal eléctrica
recibida en una cifra de absorbancia de manera que se pueda realizar la lectura por medio de una
aguja que deflecta en una escala adecuada o de forma digital en un display. Los equipos
modernos generalmente están computarizados y están programados para realizar los cálculos
correspondientes entregando directamente el valor de la concentración en la muestra.
Turbidimetría: Su principio consiste en determinar la cantidad de luz bloqueada por las partículas
en suspensión cuando la cubeta es atravesada por una haz de luz monocromática. Puede usarse
un colorímetro corriente o un espectrofotómetro. La cantidad de luz bloqueada por una suspensión
depende de la cantidad, así como del tamaño de las partículas. Puede incurrirse en errores por la
sedimentación de las partículas, por ello, hay que tener en cuenta el tiempo de lectura. Es
necesario que la sustancia a determinar precipite formando partículas lo más finas posibles. La
sensibilidad fotométrica aumenta con la disminución de la longitud de onda, por eso si el medio de
suspensión es incoloro, entonces la luz azul sería la más adecuada para su realización, pero para
la disminución de sustancias interferentes (como la bilirrubina y la Hb) se prefiere en la mayoría de
los casos, usar filtros rojos. Su ventaja radica en la medición de un precipitado sin necesidad de
ser separado de la solución en que se encuentra, por lo que se gana en rapidez. Ejemplo:
Determinación de la proteinuria y proteinorraquia usando ácido sulfosalicílico
Nefelometría: Es similar a la turbidimetría aunque se mide la luz dispersada por las pequeñas
partículas en ángulo recto respecto al haz incidente sobre la cubeta. El grado de dispersión se
relaciona con el número y tamaño de las partículas en el haz luminoso, es importante controlar su
tamaño y forma; y la longitud de onda. Es de mayor precisión que la turbidimetría, a mayor
longitud de onda es mayor el grado de dispersión. Para obtener alta especificidad y alta precisión
se ha combinado una fuente láser con el uso de complejos antígeno-anticuerpo.
Reflectometría. Está íntimamente vinculada a las determinaciones de química seca, de manera
que puede medirse la concentración por la reflexión de la luz en una determinada longitud de
onda de acuerdo con los cambios de coloración en una tira. En la actualidad se encuentran
automatizados los pasos de lectura y procesamiento de los datos de manera que contienen un
microprocesador para la entrega del resultado de la determinación.
El reflectómetro funciona gracias a la esfera de Ulbricht, que contiene una fuente de luz en cierta
, que consiste en una lámpara de arco de Xe o un diodo, de manera que el rayo incida sobre la
tira y refleja la luz. El detector realiza la comparación de la intensidad de luz emitida por el diodo
con la intensidad de la luz reflejada, de manera inversa, o sea, a mayor intensidad de luz reflejada
es menor la concentración del analito. Existen sistemas que permiten hacer determinaciones
enzimáticas.
Las tiras de química seca están diseñadas sobre un soporte de material sintético, poseen un
código magnético en un extremo sobre el cual hay una serie de capas generalmente con fibra de
vidrio que contiene el material separador y los reactivos, todo cubierto por una capa protectora,
este material separador retiene los hematíes de la sangre y hace que difunda el plasma hacia el
material de transporte, desde aquí asciende por capilaridad hacia las capas que están embebidas
con los reactivos. En algunos equipos existen tiras ya preparadas para la calibración con un
material acuoso, estos equipos controlan automáticamente los tiempos necesarios para el proceso
de incubación y reacción. Toda la información requerida para su funcionamiento está contenida en
el código magnético de la tira de manera que se entrega directamente el resultado de la
determinación. Algunos de ellos realizan simultáneamente hasta cinco determinaciones. Ejemplo:
Glucómetros portátiles.
Fotometría De Emisión. Existen diversos analitos que no son detectables por absorción de la luz,
por ello existen algunos métodos en los que se aprovecha la propiedad de la emisión de energía
radiante por elementos (ión o molécula) que estén de una u otra forma en estado de excitación.
La fotometría de emisión se basa en la radiación característica emitida por un ión o molécula
excitado (a) por alguna causa externa y la correlación existente entre la intensidad de dicha
emisión y la concentración del elemento que se investiga.
Niveles energéticos: los electrones de los átomos de un elemento químico cualquiera se
encuentran organizados en su envoltura por su contenido energético en niveles de energía
creciente de manera que en los niveles superiores se encuentran los de mayor contenido de
energía. Los electrones que reciben por alguna causa externa y pasan a niveles superiores ceden
esta energía al regresar a su estado basal emitiendo radiaciones.
Fluorometría.
Fluorescencia: Muchas moléculas tienen la propiedad de volver a emitir cierta porción de la
radiación absorbida en forma de luminiscencia. La radiación incidente, primaria o de excitación,
hace que al incidir sobre la molécula fluorescente (generalmente posee enlaces múltiples en su
estructura) ésta absorba energía y los electrones se exciten, de ellos algunos pierden energía al
regresar a un nivel intermedio antes de volver al estado basal, la energía cedida es menor que la
absorbida, por esto la longitud de onda de excitación (mayor contenido energético) debe ser
menor que la de emisión. Todo este proceso es instantáneo y dura aproximadamente 10 -8seg. Se
necesita que las moléculas posean electrones excitables en su estructura o de lo contrario hay
que hacerlas reaccionar de manera que se conviertan en sustancias fluorescentes para poderlas
medir.
La intensidad de la fluorescencia es proporcional a la concentración de la sustancia. Ley de
Lambert-Beer-Borguer.
F = 2,3 . I0 . a. c. d. , donde:
a; absortividad
c: concentración
d: paso de luz
I0: Intensidad de luz incidente
: Eficiencia cuántica, esto es la proporción de luz total emitida o fluorescente con relación a la luz
total absorbida. Es constante para cada sustancia fluorescente y depende del solvente en que
esta se encuentra.
La proporcionalidad entre la concentración y la fluorescencia está limitada a bajas
concentraciones (la absorbancia a.c.d. es menor que 0,05), a valores mayores se produce una
desviación de la linealidad entre la concentración y la emisión hasta una extinción casi completa
de la fluorescencia, esto ocurre cuando la porción de luz excitante absorbida no sobrepasa el 5%.
La luz emitida necesita ser amplificada considerablemente por un fotomultiplicador y generalmente
se mide en ángulo recto con relación a la excitante.
Componentes de un fluorómetro.
Fuente de luz .Son de alta intensidad como lámparas de arco de mercurio o xenón en las cuales
los electrones descargados del gas causan excitación de loa átomos por colisión y estos átomos
excitados emiten radiaciones a determinadas longitudes de onda.
Monocromador. Al igual que los fotómetros existen fluorómetros que permiten seleccionar
cualquier de un espectro continuo, llamados espectrofluorómetros y otros que poseen filtros de
interferencia y lámparas que producen líneas espectrales denominados fluorómetros simplemente.
La fórmula antes señalada posee poca aplicación práctica por lo que las concentraciones se
calculan a partir de curvas de calibración.
Cubetas de medición: Las cubetas deben ser de cuarzo pues el vidrio ordinario absorbe la luz
ultravioleta. El compartimiento de muestra debe tener un shutter en el lado de la luz incidente de
excitación para evitar alguna fotodescomposición.
Detector. Se requieren fototubos o fotomultiplicadores porque la fluorescencia es una señal de
baja intensidad. La sensibilidad depende de la intensidad de luz incidente por lo cual debe ser
alta, utiliza un detector de alta sensibilidad que permite detectar sustancias en el orden de los
g/L. Para conseguir mayor sensibilidad, especificidad y selectividad debe conocerse el espectro
de excitación y de fluorescencia de la sustancia.
La intensidad de la fluorescencia se afecta por:
- la concentración del material fluorescente que puede interferir con la intensidad de luz
fluorescente.
- las variaciones en la concentración del fluorescente, que pueden producir solvatación,
asociación o disociación
- ser sensible a la naturaleza del solvente, pH, temperatura, presencia de impurezas y de iones; o
sustancias extrañas que puedan absorber tanto luz de excitación como de emisión. Ejemplo:
Cr2O72-
Precauciones más importantes en la fluorometría:
A- Los solventes no pueden ser fluorescentes ni absorber luz en las longitudes de onda de la
determinación.
B- Uso de cubetas de cuarzo pues el vidrio tiene alta fluorescencia, además de no tener
rayaduras, no tocarse con los dedos. Limpiarlas con ácido nítrico caliente de cualquier material
fluorescente.
C- Comprobar la fluorescencia de los blancos.
D- Prevenir las contaminaciones con grasa en las llaves de paso del equipo
E- Los tapones de goma negra polietileno o baquelita pueden aumentar la fluorescencia.
F- Cuidar el pH y la temperatura, ésta última hace que la fluorescencia disminuya con su aumento,
o también puede variar la dispersión de la luz.
G- Eliminar todo tipo de enturbiamiento, burbujas de aire ó sólidos en suspensión.
H- Hacer rápidamente la lectura ya que la exc puede variar y las cantidades de sustancias al ser
muy bajas pueden adsorberse a la superficie de la cubeta, descomponerse con la luz, oxidarse,
etc.
I- Usar patrones internos de manera que puedan detectarse sustancias que puedan variar el color
de la fluorescencia.
La fluorometría puede usarse para determinar iones inorgánicos, aminoácidos, catecolaminas,
histamina, nucleótidos, algunas enzimas, hormonas sexuales, drogas y medicamentos, entre
otros compuestos.
Fotometría De Llama: Se basa en el uso de la energía emitida por los electrones de un átomo
excitados por una llama al pasar del estado excitado inestable a su estado basal de menor
energía. Esta energía disipada en forma de luz puede poseer diferentes longitudes de onda o
líneas del espectro que resultan características de cada elemento. La intensidad de la luz emitida
es proporcional a la concentración del elemento.
Es muy importante conocer las diferencias del uso de la llama en la fotometría de emisión y en la
absorción atómica: en la primera se usa para excitar los átomos y que emitan energía, en la
segunda es para disociar los átomos y que puedan absorber la luz de cierta longitud de onda.