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Objetivo

Preparar y conocer algunos medios de cultivo para la siembra de microorganismos.

Introducción

Un medio de cultivo es el substrato o la solución que contiene los elementos químicos


necesarios para las células que se van a cultivar, deben contener en forma asimilable,
nitrógeno y proteínas (peptonas), lípidos, hidrato de carbono, sales minerales, agua, extractos
de carne o levaduras, agentes solidificantes como el agar y la gelatina (en caso de medios
sólidos). Debe ser estéril, isotónico y poseer propiedades buffer y una viscosidad óptima.

Los medios sirven para uno de dos propósitos principales:


- Fomentar el crecimiento microbiano en forma que puedan comprobarse las
características del cultivo.
- Facilitar algunas reacciones bioquímicas que puedan ser demostrable por observación
directa, o bien indirectamente por subsecuentes reacciones en presencia de algunos
reactivos adicionales.
- Como es natural, todas estas reacciones de cultivo, así como las bioquímicas, dependen
de la composición del medio y de la naturaleza del cultivo que se estudie.

Los medios de cultivo pueden variar en su composición, no sólo en función del


microorganismo para el cual se utilizan, sino también con respecto a su estado físico y
aplicación específica.

Por su composición los medios de cultivo se clasifican en:

• ​Sintéticos o de composición química definida: se adquieren comercialmente y se obtienen


disolviendo en agua destilada mezclas que contienen cantidades concretas de distintas
sustancias químicas puras de origen orgánico e inorgánico. La composición química de un
medio sintético depende de la bacteria que se quiera cultivar, por ejemplo el agar MacConkey
sirve para cultivar Enterobacterias. Los medios sintéticos son costosos y se usan
principalmente en la investigación científica.

• ​Naturales, complejos o de composición químicamente no definida: se elaboran con


ingredientes de composición compleja como extractos de tejidos animales y vegetales,
sueros, hidrolizados de proteínas y otras sustancias similares. Este tipo de medios son
ampliamente utilizados en cultivos y conservación de microorganismos ya que su preparación
resulta más sencilla, son menos costosos y proporcionan los requerimientos nutritivos para un
gran número de microorganismos. Ejemplos: caldo nutritivo y agar nutritivo.

Por su estado físico, los medios de cultivo pueden ser:

• Líquidos o caldos: s​ on especialmente útiles para cepas sometidas a condiciones adversas,


para distribuir el cultivo, hacer diluciones y mezclas.

• ​Semisólidos: ​se utilizan para determinar la movilidad de los microorganismos. Se preparan


agregando a los caldos agar en concentraciones de de 0.4 a 0.8%.

• ​Sólidos: se utilizan para inmovilizar a los microorganismos, lo que permite aislarlos,


contarlos y estudiar su morfología colonial. Los agentes solidificantes que más se utilizan son
agar, albúmina de huevo y grenetina.

Material y equipo

· 25 tubos de ensayo. · Agar eosina y azul de metileno (agar EMB).


· 3 pipetas de 1 mL. · Caldo lactosado.
· 3 matraces Erlenmeyer de 300 mL. · Caldo lactosa bilis verde brillante.
· Autoclave. · Tubos de 20 x18
· Medios de cultivo. · Tubos de 16 x 150
· Agar cuenta estándar. · Campanas de Durham
· Caldo cerebro corazón (BHI).

Procedimientos

Preparacion de medio solido:


Agar cuenta estándar (ACE)
1. Leer la etiqueta de preparación del medio de cultivo, pesar la cantidad a utilizar.
2. Colocar en un matraz y agregar la cantidad de agua requerida.
3. Calentar hasta ebullición para obtener un liquido transparente, agitando constantemente,
con el fin de que no se pegue en le fondo del matraz.
4. Distribuir el medio en 20 tubos en porciones de 12 a 15 mL y taparlos.
5. En otros 5 tubos adicionar 7 mL del medio y taparlos.
6. Colocar todos los tubos llenos dentro de una canastilla de metal o recipiente de plástico.
7. Esterilizar.
8. Solidificar en forma inclinada los tubos que contienen 7 mL de medio.

Agar de eosina azul de metileno (EMB)


1. Seguir los pasos anteriores de 1 al 4.
2. Colocar en el matraz un tapón con algodón y gasa y cubrirlo con papel
3. Esterilizar en autoclave

Preparacion de medio liquido:


Caldo cerebro corazón (BHI)
1. Leer la etiqueta de la preparación del medio de cultivo.
2. Pesar la cantidad utilizada del medio.
3. Colocar en un matraz y agregar la cantidad de agua requerida.
4. Agitar para homogenizar el medio.
5. Si no se disuelve perfectamente, calentar un poco hasta obtener un líquido transparente.
6. Distribuir 5 mL del medio en los tubos y tapar.
7. Colocarlos en una canastilla.
8. Esterilizar.

Caldo lactosado doble concentración y concentración normal.


1. Leer la etiqueta de la preparación del medio de cultivo.
2. Pesar la cantidad utilizada del medio.
3. Colocar en un matraz y agregar la cantidad de agua requerida.
4. Agitar para homogenizar el medio.
5. Si no se disuelve perfectamente, calentar un poco hasta obtener un líquido transparente.
6. Colocar una campana de Durham en cada tubo, adicionar 20 mL del medio a los tubos
grandes y 10 mL en los de 16​×​150 tapar.
7. Colocarlos en una canastilla.
8. Esterilizar.

Observacion y analisis de resultados


Los medios preparados fueron distribuidos en tubos de ensayo según las
especificaciones, como observamos en la práctica anterior, tanto medios de cultivo como
cualquier tipo de solución, se esterilizan a partir de calor húmedo en el autoclave. En lo
referente a su preparación, los agares son medios que solidifican a temperatura ambiente y
por lo tanto requieren de calentamiento para una adecuada dilución, para el caso de los caldos
es preferente su preparación a temperatura ambiente debido a su consistencia líquida.

En base a los procedimientos realizados, clasificamos los medios de cultivo según su


consistencia en medios líquidos y sólidos; los medios líquidos se usan en principalmente en el
incremento de bacterias, en la determinación de sus propiedades fisiológicas, para el
incremento masivo de bacterias y hongos con fines de experimentales (generalmente bajo
agitación) y para estudios de crecimiento de microorganismos. Industrialmente tienen uso en
la preparación de productos accesorios al crecimiento los microorganismos, (ácidos
orgánicos, antibióticos, etc.). Por otra parte, el uso de principal de medios sólidos es para el
aislamiento de hongos y bacterias, y para su mantenimiento. Se prepara en frascos, placas
Petri y tubos de prueba. (French y Herbert, 1980)

Preparación de medios sólidos

​ ara la
Agar cuenta estándar: Suspender 23.5 g por litro de agua destilada. P
preparación de 710 ml de medio de cultivo fueron adicionados 16.68 g. La cantidad anterior
incluye los 425 ml que se pretende guardar para prácticas posteriores y las cantidades a
disponer en los 27 tubos de ensayo.
El medio cuenta estándar contiene Triptona como fuente de nutrientes. La lactosa
proporciona carbohidratos fermentables para el crecimiento de los coliformes. Las sales
biliares son inhibidoras de las bacterias grampositivas, en particular los bacilos y los
estreptococos fecales. El medio tiene un fuerte sistema amortiguador de fosfato de potasio
para controlar el pH en presencia de una acción fermentativa considerable. El cloruro de
sodio mantiene el equilibrio osmótico del medio.

​ ara la
Agar de eosina azul de metileno: ​Suspender 36 g por litro de agua destilada. P
preparación de 100 ml fueron adicionados 3.6 g del medio deshidratado. Cabe mencionar que
los medios sólidos requieren de calentamiento hasta la ebullición; los medios que contienen
agar tienden a hervir repentinamente y salirse del recipiente que lo contiene. Durante la
práctica en cuestión, el medio entró en ebullición y gran parte de su contenido se desbordó
del matraz de modo que fue necesaria la preparación de 100 ml adicionales de agar EMB.

El uso de Eosina y Azul de Metileno permite la diferenciación entre organismos


fermentadores y no fermentadores de lactosa, la Peptona aporta nitrógeno, vitaminas,
minerales y aminoácidos esenciales para el crecimiento. La Sacarosa se añade además de la
lactosa como carbohidrato fermentable, para detectar coliformes que fermentan la sacarosa
más rápidamente que la lactosa. La Eosina Amarillenta y el azul de metileno son inhibidores
parciales de bacterias Gram-positivas e indicadores de pH. Debido a la lactosa y la sacarosa
en el medio se puede diferencia en cultivo primario Salmonella y Shigella las cuales son
lactosa negativo y pueden ser diferenciados de otras lactosa negativos y sacarosa positivos
tales como Proteus vulgaris, Citrobacter y Aeromonas. El Fosfato dipotásico actúa como
buffer del sistema y al Agar bacteriológico es el agente solidificante.

Preparación de medios líquidos

Caldo lactosado: Agregar 13 g del medio deshidratado por cada litro de agua
destilada para una concentración normal, 19.5 g por litro de agua destilada para una doble
concentración (1.5%). ​Se prepararon 100 ml de caldo lactosado doble concentración
adicionando 1.95 g del medio deshidratado y 2.73 g del mismo para preparar 210 ml de caldo
lactosado concentración normal.
Es un medio rico en nutrientes, libre de inhibidores de crecimiento bacteriano.
Contiene extracto de carne y peptona que son la fuente de carbono y nitrógeno del medio,
además contiene lactosa, que como sabemos es un hidrato de carbono que fermenta
produciendo ácido y gas. Lo que fundamenta el uso de las campanas de Durham para
determinar la producción de gases en el medio.

Caldo de infusion cerebro-corazon (BHI): Disolver 37 g del medio deshidratado por


cada litro de agua destilada.​ Se utilizaron 4.44 g del mismo para la preparación de 120 ml de
medio de cultivo.

El medio obtiene los nutrientes de la infusión de cerebro y corazón, la peptona y la


glucosa. Las peptonas y la infusión son fuentes de nitrógeno orgánico, carbono, azufre,
vitaminas y sustancias de traza. La glucosa es la fuente de carbohidratos que los
microorganismos utilizan mediante fermentación. Se utiliza fosfato disódico como tampón en
el medio.

Conclusiones

Durante la práctica en cuestión, llevamos a cabo la preparación de medios de cultivo líquidos


y sólidos, logrando comprender las diferencias entre ambos así como la importancia de una
adecuada higiene durante la práctica y la esterilización de los medios.
Isabel Rincón

Se concluye que es de gran importancia preparar adecuadamente los medios de cultivo,


añadir la cantidad de solución exacta y disolver correctamente para obtener los resultados
esperados; además de que observamos los diferentes tipos de medios que hay tanto como
medios líquidos, Sólidos y Semisólidos.
Hector Ontiveros

Cuestionario

1. En un cuadro sinóptico explique cómo pueden clasificarse los medios de cultivo.


Incluya ejemplos en cada caso.
2. Mencione que agentes solidificantes pueden tener los medios de cultivo, diga de donde
se obtienen y cuáles son sus ventajas y desventajas.

El agar es el agente solidificante más común, es un polisacárido de galactosa y


galactomanano que se obtiene de las algas rojas (​Echema, Gelidium, Gracilaria)​. Contiene un
70% de agarosa y un 30% de agaropectina. Su composición química es indefinida y solidifica
con mayor dificultad a medida que desciende el pH. Es insoluble en agua fría, pero se funde y
solubiliza en agua hirviendo y solidifica a 45°C. Forma geles transparentes muy estables y es
degradado por muy pocas bacterias.

Gel de sílice o​ silicogel,​ silicato de sodio o potasio (usado al 10%). Sus


inconvenientes más importantes son la dificultad para su incorporación a los medios de
cultivo, que solidifica a pH ácido y su costo elevado.

3. Investigue dos medios de cultivo que no se esterilicen de la manera convencional,


explicando cómo se procede en esos casos y el por qué.

En algunos casos en que intervienen compuestos termolábiles en el medio, es


necesario realizar la esterilización por filtración, tal es el caso de las soluciones stock de
vitaminas.

Salmonella Shigella Agar: ​Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de


Salmonella spp. y de algunas especies de ​Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros
materiales en los cuales se sospeche su presencia.

Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, está dada por la sales


biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la
mayoría de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la
fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de
sodio. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar,
acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas o
rojas sobre un fondo rojizo.

Este medio de cultivo no se esteriliza ya que sus componentes son sensibles al calor
excesivo, además son medios de cultivo altamente selectivos, no se esterilizan por filtración
debido a su densidad, con relación a al calor del mechero ningún medio debe disolverse a la
flama directa, esto debe hacerse en baño maría a 100 grados.

Caldo urea: ​Medio de cultivo utilizado para la diferenciación de enterobacterias, así


como para microorganismos de la familia de Brucella, Bacillus, Micrococcus, Mycobacteria
y Proteus. . Se puede utilizar para la identificación de bacterias en base a la utilización de la
urea. Está especialmente recomendado para la diferenciación de ​Proteus de Salmonella y
Shigella​.

Entre sus componentes tenemos el extracto de levadura es una fuente de vitaminas, en


particular del Grupo de B esencial para el crecimiento bacteriano. Los fosfatos de potasio
proporcionan la capacidad de buffer. El Rojo fenol es el indicador de pH. La urea es una
fuente de nitrógeno para aquellos organismos que producen ureasa, es además, un
componente termolábil por lo que el método de esterilización para este medio es por
filtración.

Bibliografía

Becton Dickinson and Company. (2013) ​¨BD EMB Agar (Eosin Methylene Blue Agar),
Modified¨.​ Instrucciones de uso, medio en placas listo para su uso. Consultado el 1ero de
Febrero en: https://www.bd.com/resource.aspx?idx=8765

Becton Dickinson and Company. (2013) ​¨BD Brain Heart Infusion (BHI) Agar¨​.
Instrucciones de uso, medio en placas listo para su uso. Consultado el 1ero de Febrero en:
https://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8800

French, F., Herbert, T. (1980) ​¨Métodos de Investigación Fitopatológica¨​. IICA editorial.


Costa Rica. Pág. 35.

Gutiérrez, S. (2008) ​“Preparación de medios de Cultivo”​. Laboratorio de Microbiología.


Consultado el 2 de Febrero en: www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/cated
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Prescott, L., Harley, J., Klein, D. (2004) ​“Microbiología”​. 5ta ed. McGraw Hill
Interamericana. Madrid, España. Capítulo 5, Págs. 109-115.

Prado, A., Rodríguez, G., Figueroa, I., Shirai, K. (2013) ​“Manual de prácticas de
laboratorio: Microbiología de los alimentos”​. Universidad Autónoma Metropolitana,
División de Ciencias Biológicas y de la Salud. Universidad de Iztapalapa, México. Págs.
53-72.​ ​Consultado el 3 de Febrero en: publicacionescbs.izt.uam.mx/DOCS/microalimen.pdf

Tortora, G., Funke, B., Case, C. (2007) ​“Introduccion a la Microbiologia”​, 9na ed. Editorial
Panamericana. México. Capítulo 6, Págs. 168-173