Mieloperoxidasa

Fundamento
Enzima que en presencia de perxido de hidrgeno oxida el clorhidrato de
bencidina, pasando de su forma incolora a un derivado marrn que se localiza en
el lugar de la enzima. La peroxidasa se localiza en los grnulos ( inespecficos )
azurfilos presentes desde el estado de mieloblasto en todas las formas evolutivas
de la serie mieloide.

Tcnica

REACTIVOS
TAMPN TRIZMAL 6,3 CONCENTRADO, con cloroformo como conservante.
REACTIVO INDICADOR DE PEROXIDASA, p-fenilenediamina diHCl (1 parte) y
catecol (2 partes).
SOLUCIN DE HEMATOXILINA CIDA, Hematoxilina certificada, 1 g/l, pH 3,3 a
25 C
.ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Almacenar el tampn Trizmal 6,3 concentrado y la solucin de hematoxilina
cida a temperatura ambiente (1826 C).El reactivo indicador de peroxidasa debe
almacenarse refrigerado (28 C).La solucin de hematoxilina cida no debe
devolverse al recipiente original despus de suuso en un vaso de Coplin. El
perxido de hidrgeno al 3 % en una solucin salina tamponada con fosfato debe
guardarse en el frigorfico (28 C). Desechar si presenta turbidez. Los reactivos
son estables hasta la fecha de caducidad.
DETERIORO
Desechar el tampn Trizmal 6,3 concentrado si presenta turbidez. Desechar la
solucin de hematoxilina cida cuando el tiempo requerido para obtener la tincin
adecuada supere en ms de 5 minutos el tiempo recomendado en el
procedimiento.
PREPARACIN (REACTIVOS)
El tampn Trizmal 6,3 diluido se prepara mezclando 1 volumen de tampn
TRIZMAL 6,3 concentrado, nmero de catlogo 90-3C, con 9 volmenes de
agua desionizada. Utilizar una sola vez y desecharlo. La solucin fijadora de
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etanol, 95 % (v/v), se prepara mezclando 5 ml de formaldehdo al37 % con 45 ml
de etanol al 95 %. Las preparaciones deben ser del da. Mantenga el envase bien
cerrado.
El perxido de hidrgeno al 3 % en una solucin salina tamponada con fosfato se
prepara aadiendo 1 parte de perxido de hidrgeno, 30 %, a 9 partes de solucin
salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Debe prepararse al momento.

Procedimiento 1 - Recogida de muestras

Para el ensayo deben utilizarse frotis de sangre total o de mdula sea recin
preparados. La sangre puede recogerse en heparina o EDTA. Debe reducirse al
mnimo la exposicin a la luz ya que la peroxidasa leucocitaria es fotosensible. Los
frotis sin fijar son estables durante3 semanas si se guardan en la oscuridad1.
Antes de la fijacin, los frotis deben dejarse al aire durante 10 minutos, protegidos
de la luz.
MATERIAL ESPECIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO
Solucin de formaldehdo, 37 %Etanol, 95 % (v/v) Solucin salina tamponada con
fosfato, pH 7,4, nmero de catlogo P 3813Perxido de hidrgeno, 30 %
NOTAS
A efectos de comprobacin del funcionamiento del sistema, se recomienda
procesar los frotis de sangre procedentes de donantes sanos junto con las
muestras de paciente. Aunque la mieloperoxidasa generalmente se considera un
marcador de clulas de alineacin mielocitica, es obligatorio reconocer que las
clulas monocitoides tambin pueden mostrar actividad leve de peroxidasa. Los
datos obtenidos mediante este procedimiento slo sirven como ayuda en el
diagnstico y deben ser revisados junto con otras pruebas clnicas o informacin
de diagnstico.

PROCEDIMIENTO 2 (Tecnica)
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1. Fijar los frotis a temperatura ambiente durante 30 segundos con solucin
fijadora.
2. Lavar los portaobjetos con agua corriente a chorro suave durante 2 minutos y
secar alaire durante 10 minutos, en la oscuridad.
3. Precalentar 50 ml de tampn TRIZMAL 6,3 diluido, en un bao de agua a 37
C.
4. Inmediatamente antes de su uso, aadir 1 vial de reactivo indicador de
peroxidasa, de hidrgeno al 3 %, al tampn Trizmal 6,3 diluido precalentado.
Mezclar a conciencia. Desechar despus de su uso.
5. Colocar los portaobjetos lavados, fijados (paso 2) con solucin de reactivo
indicador de peroxidasa (paso 4) durante 30 minutos, en un bao de agua a 37 C,
en la oscuridad.
6. Tras la incubacin, lavar los portaobjetos con agua corriente a chorro suave
durante 15 30 segundos y dejarlos secar.
7. Contrateir los portaobjetos con solucin de hematoxilina cida
,8. Aclarar los portaobjetos en agua desionizada corriente durante 15 30
segundos. Secar los portaobjetos al aire y examinarlos con el microscopio.
CARACTERSTICAS DE FUNCIONAMIENTO
Los frotis de sangre procedentes de donantes normales se tieron para
mieloperoxidasa de acuerdo con este procedimiento y mediante el mtodo de
bencidina.
1. Los neutrfilos muestran una granulacin marrn-negra con este
procedimiento, y una granulacin azul con el procedimiento de benzidina.
En ambos casos, los monocitos se tieron menos intensamente y los
linfocitos no mostraron ninguna actividad de mieloperoxidasa.

RESULTADOS

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