UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA
FACULTAD DE INGENIERIA INDUSTRIAL
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL E INDUSTRIAS
ALIMENTARIAS
PRACTICA DE LABORATORIO N° 05
“SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS”
Docente a cargo:
ING. MSC. SMITH TIMANA ROJAS
Asignatura:
COMPOSICION DE LOS ALIMENTOS
Integrantes:
ALBÁN VARGAS Ana Lucía
AQUINO GODOS Fiorella
CRUZ CRISANTO Anabel
DE LA CRUZ CASTILLO Job
DUEÑAS LABÁN Shirley
LANDACAY MOROCHO Mirtha
SEMESTRE 2019 - I
CICLO V
Castilla - Piura, Perú
2019
Tabla de contenido
Tabla de contenido .................................................................................................................................. 2
I. OBJETIVO ..................................................................................................................................... 3
II. INTRODUCCION .......................................................................................................................... 3
III. MARCO TEORICO .................................................................................................................... 3
Factores que afectan la solubilidad proteica ....................................................................................... 3
IV. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS ............................................................................. 5
V. PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS ....................................................................................... 5
Preparación de la solución rica en proteínas ....................................................................................... 5
Efecto del cambio de solventes (con acetona) .................................................................................... 6
Efecto del cambio de solventes (con metanol).................................. ¡Error! Marcador no definido.
Efecto del cambio de temperatura (agua hirviendo) ........................................................................... 7
Efecto del cambio de temperatura (agua helada) ................................................................................ 7
Efecto del cambio de la concentración de sales .................................................................................. 8
1. Colocar 15 mL de la solución de proteínas en un vaso precipitado. ............................................... 8
2. Con una espátula o cuchara agregar poco a poco el cloruro de sodio y mezclar. ........................... 8
3. Continuar agregando cloruro de sodio hace observar algún cambio. ............................................. 8
4. Hacer las respectivas anotaciones de los cambios. ......................................................................... 8
VI. PREGUNTAS ............................................................................................................................. 9
1. ¿Qué tipo de proteína son la caseína y la albúmina estructural y funcionalmente? .................... 9
2. ¿Qué métodos se conocen para aislar y purificar proteínas? ...................................................... 9
3. ¿Qué es el punto isoeléctrico de una proteína? ......................................................................... 13
4. ¿Por qué las proteínas precipitan con altas concentraciones de sales? ..................................... 13
5. ¿Qué efecto tienen los solventes orgánicos sobre las proteínas? .............................................. 14
VII. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................... 16
I. OBJETIVO
➢ Identificar los factores que afectan la solubilidad de las proteínas al modificar las
condiciones del medio en que se encuentran.
II. INTRODUCCION
Las proteínas desempeñan una enorme variedad de funciones: transporte, almacenamiento,
organización, estructural de las células y los tejidos y como catalizadores (enzimas) que
promueven la enorme variedad de reacciones que forman el metabolismo. Cada tipo de célula
en todos los organismos posee varios miles de clases de proteínas para cumplir la gran variedad
de funciones para ello mantener la multiplicidad de sus funciones, las proteínas son moléculas
extremadamente complejas que tienen una estructura determinada formada por la secuencia
definida de aminoácidos. La proteína tiene una estructura tridimensional específica de
plegamientos de su cadena dicho estructura debe mantenerse para que la proteína ejerza su
función, esto implica que existen interacciones entre los aminoácidos que conforman las
harinas y las moléculas del medio (agua fundamentalmente), adquiriendo una conformación
natural máxima estabilidad la cual no debe perderse.
III. MARCO TEORICO
Factores que afectan la solubilidad proteica
Los factores que pueden afectar la solubilidad de una proteína son la fuerza iónica del medio
(concentración de sales), el pH, la temperatura y la constante dieléctrica del solvente
(polaridad).
Cuando hay un cambio de cualquiera de estos factores, la proteína responde con una intensidad
proporcional al cambio, esto es, que puede afectar la estructura proteica de una manera
superficial o lo puede llegar a hacer tan intensamente que provoca una desnaturalización
irreversible.
Acetona
La adición de disolventes orgánicos como el etanol o la acetona, disminuye la permeabilidad
de cualquier medio acuoso. Aumentan así las fuerzas electrostáticas intra e intermoleculares,
repulsivas y atractivas. Las interacciones intramoleculares electrostáticas repulsivas
promueven el desplegamiento de la molécula proteica. En el estado desplegado la
permeabilidad favorece la formación de puentes de hidrogeno intermoleculares entre los grupos
péptidos expuestos y las interacciones electrostáticas intermoleculares entre grupos con carga
de signo opuesto. estas interacciones polares intermoleculares conducen a la precipitación de
la proteína en los disolventes orgánicos.
Es por ello que al adicionar acetona a las 2 muestras se presentan precipitados más pesados y
más evidentes.
-Sulfato de amonio más evidentes. (NH4)2NO4
La precipitación salina de las proteínas es una técnica en donde se logra la precipitación de una
fracción de proteínas mediante el aumento de la fuerza iónica del medio. Grandes cantidades
de una sal agregada a una solución de proteínas, disminuye la interacción proteína- H2O porque
quita la capa de solvatación, predominando la interacción proteína-proteína y generando la
precipitación de las mismas. La concentración salina a la que se produce la precipitación no es
igual para todas las proteínas, lo que permite usar ésta propiedad para la separación y
purificación de proteínas particulares a partir de mezclas complejas. Comúnmente se usa
sulfato de amonio para tal fin, a causa de su gran solubilidad (760 g de sulfato de amonio/1000
ml. de agua a una temperatura de 20°C) y porque el ion sulfato divalente permite alcanzar altas
fuerzas iónicas. La adición gradual de ésta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de
proteínas, las cuales son precipitadas, pero no desnaturalizadas.
-Aumento de temperatura
Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las moléculas con lo que se
desorganiza la envoltura acuosa de las proteínas, y se desnaturalizan. Asímismo, un aumento
de la temperatura destruye las interacciones débiles y desorganiza la estructura de la proteína,
de forma que el interior hidrofóbico interacciona con el medio acuoso y se produce la
agregación y precipitación de la proteína desnaturalizada.
IV. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS
Materiales: Insumos
- Huevo o clara de huevo
- Plancha de calentamiento
- Etanol o metanol
- Goteros
- Acetona
- Vasos de precipitado de cristal
- Hielo
- Agitador
- Cloruro de sodio
- Cuchara desechable
- Agua
- Sulfato de sodio
V. PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS
Preparación de la solución rica en proteínas
1. Romper con cuidado por la mitad a un huevo fresco y separar la clara de la yema con
mucho cuidado de no mezclarlas.
2. Diluir una porción de clara con dos porciones de agua destilada y mezclar suavemente.
3. Esta solución será la que utilizará en el resto de los experimentos.
Efecto del cambio de solventes (con acetona)
1. Colocar 15 mL de solución de proteínas en un vaso precipitado.
2. Dejar gotear lentamente acetona y agite suavemente hasta notar algún cambio
3. Anotar qué es lo que observa
Observaciones: Evidencia:
Con Acetona la solución de proteínas se
desnaturaliza. Las cadenas de proteínas
que hay en la clara de huevo, denominadas
proteínas globulares, se encuentran
enrolladas adoptando una forma esférica.
Al añadir acetona las cadenas de proteína
se desenrollan y se forman enlaces que
unen unas cadenas con otras. Disminuye la
solubilidad en agua de la mayor parte de
las proteínas globulares.
Efecto del cambio de temperatura (agua hirviendo)
1. Poner a hervir agua en recipiente de un litro.
2. Colocar un vaso de vidrio 15 mL de solución de proteínas.
3. Introducir el vaso con agua hirviendo y dejar dos minutos.
4. Con mucho cuidado sacar el vaso y observar que sucedió con el huevo.
Observaciones: Evidencia:
La clara del huevo está compuesta en gran
parte por agua y albúminas, un tipo de
proteínas. Al aumentar la temperatura las
proteínas de la clara del huevo se
desnaturalizan, va perdiendo su
solubilidad. La aplicación de calor afecta
la estabilidad de las interacciones no-
covalentes de la estructura tridimensional
de la proteína y se rompe el delicado
balance de los enlaces que mantienen el
equilibrio.
Efecto del cambio de temperatura (agua helada)
1. Poner a helar agua en recipiente de un litro.
2. Colocar un vaso de vidrio 15 mL de solución de proteínas.
3. Introducir el vaso con el agua helada y dejar dos minutos.
4. Con mucho cuidado sacar el vaso y observar que sucedió con el huevo.
Observaciones: Evidencia:
Dentro de un intervalo de temperatura entre
0ºC y 40ºC aumenta la solubilidad. La
mayor parte de las proteínas son estables a
bajas temperaturas.
Efecto del cambio de la concentración de sales
1. Colocar 15 mL de la solución de proteínas en un vaso precipitado.
2. Con una espátula o cuchara agregar poco a poco el cloruro de sodio y mezclar.
3. Continuar agregando cloruro de sodio hace observar algún cambio.
4. Hacer las respectivas anotaciones de los cambios.
Observaciones: Evidencia:
Toma un color blanquecino. Se produce
precipitado en poca cantidad, menos
denso que la solución. Las cadenas de
proteínas que hay en la clara de huevo se
encuentran enrolladas adoptando una
forma esférica. Se denominan proteínas
globulares. Al poner sal a la clara de
huevo, hace que las cadenas de proteína se
desenrollen y se formen enlaces que unen
unas cadenas con otras. Se desnaturaliza.
VI. PREGUNTAS
1. ¿Qué tipo de proteína son la caseína y la albúmina estructural y funcionalmente?
LA CASEÍNA:
- A nivel estructural cuenta con pocos tramos con estructura secundaria organizada,
debido a la presencia de abundantes restos de prolina, y tener unidos covalentemente
grupos fosfato a algunos de los restos de serina, y muy ocasionalmente a restos de
treonina. La falta de organización de las moléculas de caseína ha hecho que hasta el
momento ninguna haya podido cristalizar para llevar a cabo estudios detallados de su
estructura secundaria y terciaria.
- A nivel funcional: La caseína tiene propiedades anti-catabólicas. Es por eso que muchos
deportistas utilizan la caseína por la noche para evitar entrar en estado catabólico, es
decir, la pérdida muscular. Por ende, se clasifica como una enzima.
LA ALBÚMINA:
- A nivel estructural: Es una proteína globular de estructura terciaria, está constituida por
alrededor de 585 aminoácidos con 17 puentes de disulfuro.
- A nivel funcional: La albúmina por su función es una proteína de transporte.
2. ¿Qué métodos se conocen para aislar y purificar proteínas?
Aislamiento de proteínas: La primera etapa en el aislamiento de una proteína es su
liberación de las células que la contienen. El método elegido depende de las características
mecánicas del tejido de procedencia, así como de la localización celular de la proteína de
interés. Como métodos de ruptura mecánica de las células vegetales para liberar sus
proteínas se pueden mencionar: 1) trituración con arena o alúmina, 2) trituración en
mezclador de alta velocidad, 3) homogeneizador a pistón, 4) prensa francesa, 5) sonicación
y 6) congelación con nitrógeno líquido y macerado.
La diversidad de proteínas involucradas en procesos de crecimiento, desarrollo y defensa
impide la formulación de un procedimiento de extracción universal que permita recuperar
todas las proteínas de un tejido vegetal. Sin embargo, la solubilidad de las proteínas de
plantas, que está relacionada con la localización intracelular, permite formular diferentes
métodos de extracción. Ellos incluyen:
1) extracción con buffer acuoso 2) extracción con detergentes 3) precipitación directa con
TCA 4) precipitación con acetona y 5) precipitación con TCA-acetona.
Para prevenir la proteólisis durante la extracción se debe utilizar alguno/s de los
procedimientos siguientes: 1) extraer con buffer que contenga SDS (sodio dodecil sulfato),
2) extraer con TCA frío al 10 % (p/v), 3) adicionar un cóctel de inhibidores de peptidasas
al buffer de extracción, 4) trabajar a baja temperatura durante períodos cortos de tiempo, 5)
usar buffers de pH por encima o por debajo del óptimo, 6) adicionar agentes protectores
como dimetil sulfóxido (10 %, v/v) o glicerol (25 % v/v) o agentes reductores como
ditiotreitol (1mM), L-cisteína (5mM) o β-mercaptoetanol (1mM)) o 7) adicionar agentes
quelantes como EDTA (2 mM) o EGTA (2mM) para remover cationes bivalentes que son
cofactores de metalopeptidasas y de varias peptidasas serínicas.
Los compuestos fenólicos pueden inactivar las proteínas al formar puentes de hidrógeno
con los átomos de oxígeno de los enlaces peptídicos y también cuando los fenoles son
oxidados a quinonas pueden condensarse con los grupos -SH y -NH2 de las proteínas. Estas
interacciones químicas determinan la formación de dímeros y polímeros de proteína
entrecruzadas por polifenoles, afectando la calidad del patrón proteico observado en los
geles. Para evitar la acción de los compuestos fenólicos se pueden usar varias estrategias:
1) precipitar todas las proteínas triturando los tejidos en TCA frío (no permite medir
actividad biológica), 2) adicionar polivinilpirrolidona (PVP) que compleja los fenoles y
alcaloides, 3) en combinación con PVP, inactivar la fenoloxidasa con agentes reductores
como ascorbato, β-mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT), dietilditiocarbamato de sodio,
metabisulfito de sodio o tiourea, 4) agregar EDTA que secuestra el cobre que es un cofactor
necesario para la expresión de la polifenoloxidasa, 5) usar un buffer de extracción de bajo
pH que ayuda a prevenir la formación de quinonas y favorece la unión de PVP a fenoles y
6) remover fenoles y alcaloides por gel filtración
Purificación de Proteínas: Las proteínas se purifican mediante procedimientos de
fraccionamiento. En una serie de etapas independientes, se aprovechan las diversas
propiedades fisicoquímicas de las proteínas que interesan para separarlas progresivamente
de otras proteínas y/o de las demás sustancias. Las características de las proteínas que se
emplean en los diversos procedimientos de separación son: solubilidad, carga iónica,
tamaño molecular, propiedades de absorción y capacidad de unión a otras moléculas
biológicas.
Solubilidad: Los múltiples grupos ácido-base de una proteína determinan que sus
propiedades de solubilidad dependan de la concentración de las sales disueltas, de la
polaridad del disolvente, del pH y de la temperatura.
Separaciones cromatográficas: La fase móvil de una cromatografía consiste en una mezcla
de sustancias que se van a fraccionar disueltas en un líquido, que se hace fluir a través de
una columna de una matriz porosa, que constituye la fase estacionaria. Las interacciones
de los solutos individuales con la fase estacionaria determinan que cada componente migre
con velocidades diferentes y que la mezcla se separe en bandas de sustancias puras. Los
diversos métodos cromatográficos surgen de la interacción dominante entre la fase
estacionaria y las sustancias que están siendo separadas y son: cromatografía de
intercambio iónico, de adsorción, de exclusión molecular, de interacción hidrofóbica o de
afinidad.
Separaciones electroforéticas: La electroforesis es un método analítico de alto poder
resolutivo que permite la separación de moléculas biológicas cargadas por la combinación
de su migración en un campo eléctrico y el efecto de tamizado molecular a través de un gel
de corrida. Las proteínas, al ser moléculas anfotéricas polivalentes, migran en un campo
eléctrico de acuerdo con su carga neta, que a su vez depende de la carga macromolecular,
del tamaño y de la forma, como así también de las propiedades fisicoquímicas del medio
electroforético. La incorporación del detergente SDS a la solución proteica permite separar
todos los tipos de proteínas, incluyendo las insolubles en agua. El SDS se une a las regiones
hidrofóbicas de las moléculas proteicas haciendo que se desplieguen las cadenas
polipeptídicas, liberándolas de sus asociaciones con otras moléculas proteicas o lipídicas.
En estas condiciones la electroforesis separa los polipéptidos en función de su tamaño, lo
que proporciona información sobre su peso molecular. Además, el agregado de un agente
reductor como el β-mercaptoetanol reduce los enlaces disulfuro que pudieran existir en las
proteínas, de modo que se pueden visualizar todos los polipéptidos constitutivos de las
moléculas poliméricas.
Detección inmunológica: La exposición de las proteínas presentes en una muestra a un
anticuerpo específico contra la proteína en estudio y el revelado con un anticuerpo contra
el primero acoplado a una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina) o a un colorante
fluorescente, permite su identificación tanto en separaciones electroforéticas como en los
tejidos (inmunohistoquímica).
Las ventajas de estos métodos son las siguientes: a) no se necesitan reactivos radiactivos,
b) no se requieren precauciones especiales para mantener la conformación nativa de la
proteína y c) regiones de la proteína que están ocultas en la conformación nativa pueden
exponerse durante la electroforesis desnaturalizante, lo que permite usar anticuerpos anti
peptídicos.
3. ¿Qué es el punto isoeléctrico de una proteína?
El punto isoeléctrico se define como el pH en el cual el número de cargas positivas se iguala
al número de cargas negativas que aportan los grupos ionizables de una molécula. En el
punto isoeléctrico la carga neta de la molécula es cero (0).
Los puntos isoeléctricos proporcionan información útil para razonar sobre el
comportamiento de los aminoácidos y proteínas en solución. Así, la presencia de grupos
ionizables en estas moléculas tiene importantes consecuencias sobre la solubilidad.
Los aminoácidos y las proteínas son menos solubles en su punto isoeléctrico si las demás
condiciones permanecen iguales. Esto se debe a que los iones dipolares no presentan carga
neta y cristali-zan en forma de sales insolubles a ese pH.
4. ¿Por qué las proteínas precipitan con altas concentraciones de sales?
Las sales neutras ejercen efectos pronunciados sobre la solubilidad de las proteínas
globulares. A baja concentración, las sales incrementan la solubilidad de muchas proteínas,
fenómeno que recibe el nombre de solubilidad por salado o salting in, en el que los
contraiones adicionales recubren con mayor eficacia las numerosas cargas iónicas de las
moléculas proteicas, con lo que se incrementa la solubilidad de las proteínas. Las sales de
los iones divalentes tales como el K2SO4 y el (NH4) SO4, son mucho más eficaces en la
solubilización de las proteínas que las sales de iones monovalentes tales como el NaCl y el
KCl. Este efecto lo observamos en el siguiente grafico que muestra la solubilidad de la
carboxihemoglobina en su punto isoeléctrico dependiendo de la fuerza iónica y del tipo de
ion. S y S’ representan respectivamente las solubilidades de la proteína en la disolución de
la sal y en el agua pura.
La capacidad de las sales neutras para influir en la solubilidad de las proteínas está en
función de su fuerza iónica, que constituye una medida tanto de la concentración como del
número de las cargas eléctricas existentes en los cationes y los aniones aportados por la sal.
El efecto de solubilidad por salado está causado por cambios de la tendencia a la ionización,
de los grupos R disociables de la proteína. Por otra parte, a medida que la fuerza iónica
aumenta, la solubilidad de una proteína comienza a disminuir. A una fuerza iónica lo
suficientemente elevada, una proteína puede ser casi completamente precipitada de su
disolución, efecto llamado insolubilización por salado o salting out, que es el resultado de
la competencia por moléculas de solvatación entre los iones salinos agregados y los otros
solutos disueltos. Uno de los factores que explican este efecto es que la concentración
elevada de la sal puede eliminar el agua de hidratación de las moléculas de proteína,
reduciendo entonces su solubilidad. La solubilización e insolubilización por salado, son
procedimientos importantes para la separación de mezclas de proteínas, ya que las
diferentes proteínas varían en su respuesta frente a la concentración de sales neutras. Las
proteínas precipitadas por salado retienen su conformación nativa y pueden disolverse de
nuevo, normalmente sin experimentar desnaturalización. El sulfato amónico es el preferido
para precipitar las proteínas por salado, debido a su gran solubilidad en agua, lo que permite
alcanzar fuerzas iónicas muy elevadas.
5. ¿Qué efecto tienen los solventes orgánicos sobre las proteínas?
La adición de disolventes orgánicos neutros miscibles con el agua, particularmente etanol
o acetona, disminuye la solubilidad de la mayor parte de las proteínas globulares en el agua,
de tal manera que precipitan de su disolución. El estudio cuantitativo de este efecto muestra
que la solubilidad de una proteína a un pH y fuerza iónica determinados está en función de
la constante dieléctrica del medio. Puesto que el etanol posee una constante dieléctrica,
menor que la del agua su adición a una disolución acuosa de proteína incrementa la fuerza
de atracción entre las cargas opuestas, disminuyendo de este modo el grado de ionización
de los grupos R de la proteína. Como resultado, las moléculas de proteína tienden a
agregarse y precipitan.
VII. BIBLIOGRAFÍA
SITIOS WEB:
- https://espndeportes.espn.com/espn-run/nota/_/id/4794351/que-es-la-caseina
- https://www.ecured.cu/Case%C3%ADna
- https://es.slideshare.net/KarlozHernndez1/bioquimica-albumina
- http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/2211/Documento+completo.pdf?
sequence=15
- https://www.ecured.cu/Punto_isoel%C3%A9ctrico
