DETECCION DE LA

RESISTENCIA BACTERIANA

MODULO 2
Método de Disco Difusión
Javier Orlando Soto Pastrana
 METODO DISCO DIFUSION: HISTORIA
 A fines del Siglo XIX - Pioneros de la Microbiología: Pasteur, Koch
y Ehrlich hicieron referencias sobre “Antibiosis”.
 En 1874, William Roberts que en un medio
liquido con Penicillium glaucum no podía ser
fácilmente contaminado con bacterias.
 En 1976, John Tyndall hizo una observación
similar que en un caldo crecía bacterias o
hongos , pero raramente ambos.
 METODO DISCO DIFUSION: HISTORIA
La placa en la que Fleming descubrió que un moho habia
Penicillium
producido penicilina, una sustancia que frenaba el
crecimiento de Staphylococcus,y que Fleming intuyó ..

ANTIBIOSIS

Staphylococcus aureus

Sir Alexander Fleming

1881-1955

Saint Mary Hospital in London

22 de setiembre 1928

Fleming, A. On the antibacterial action of cultures of a penicillium, with special reference to

thier use in the isolation of B. influenzae. Br. J. Exp. Pathol. 10: 226-236, 1929
METODO DISCO DIFUSION: HISTORIA

ANTISÉPTICO

zanja
Evaluación antisépticos (1924)
Técnica “ditch plate”
 METODO DISCO DIFUSION: HISTORIA
A Redish ( 1928 )
- Uso de pocillos en el agar para antisépticos.

Heatley – 1941
- uso de pequeños cilindros de vidrio y
B metálicos, que luego se llamo «copa de
Oxford» o la «copa de Heatley».

Heatley – 1940

- uso de papel absorbente con la solución de

C antimicrobiano.

Vincent & Vincent – 1944

– Uso de discos (papel filtro) impregnados con penicilina.
 METODO DISCO DIFUSION: HISTORIA
Mohs – 1945 Cepa Patrón (S)

- Introdujo el «método siembra radial con discos» Cepa Problema

(Técnica de «Stokes»)
Resistente
Hoyt y Levine - 1947
Sensible
- Utilizo tabletas con penicilina en vez de papel
filtro impregnado..

Bondi y col - 1947

- Utilizo por primera vez discos de un cuarto de
pulgada (6 - 6.5 mm), utilizado frecuentemente
hasta hoy día.
 METODO DISCO DIFUSION: HISTORIA
 En los años 50, hubo la necesidad de estandarización.
 En 1961, la WHO publico un reporte sobre la estandarización de
las pruebas de susceptibilidad.
 En 1966, Kirby y Bauer y col. publicaron un método estandarizado
de la prueba de disco difusión.
Ericsson, H. Hogman K. y Wickman K.
“A paper disk method for determination of bacterial sensitivity to
chemotherapeutic and antibiotic agents “
Scand. J. Clin. Lab. Invest.., 1954; 6:21

Bauer, Kirby, Sherris y Turch,

“Antibiotic susceptibility testing by standardized single disk method.”
Am J Clin Pathol 1966;45:493-496.
 METODO DISCO DIFUSION
 En 1975, la NCCLS (actualmente la CLSI) adopto los pasos básicos
del procedimiento descrito en el estudio de Kirby, Bauer y col. de
1966.

M02
 PROCEDIMIENTO DEL METODO DISCO
DIFUSION
 Prepara el inoculo del cultivo de la placa primaria, tocando con
una asa o hisopo 3 a 5 colonias, de apariencia similar del
microorganismo a probar.
Selección de colonias y preparación del inoculo

X
 PROCEDIMIENTO DEL METODO DISCO
DIFUSION
 Transferir este crecimiento a un tubo con solución salina. Luego
comparar el tubo con la escala de Mc Farland 0.5 y ajustar la
turbidez adicionando mas bacterias o mas solución salina estéril.
PATRON DE TURBIDEZ:
• Agregar 0,5 ml de una solución de BaCl2 0,048
M (BaCl2.2H2O al 1,175% P/V) a 99,5 mL de
una solución de H2SO4 0,18 M (0,36 N) (1%
V/V).
• Verificar la densidad usando un
espectrofotómetro, cuya absorbancia a 625 nm
es 0,08 a 0,10.
• Distribuir de 4 ml a 6 ml en tubos con tapa
rosca o tapón de jebe, similares a los que se
usarán para preparar el inóculo.
• Guardar a temperatura ambiente, protegido de
la luz (duración 6 meses).
 PROCEDIMIENTO DEL METODO DISCO
DIFUSION
 Inocular la placa introduciendo el hisopo en el inoculo (remover
el exceso en la pared del tubo). Estriar el hisopo sobre la
superficie del medio 3 veces rotando la placa un ángulo de 60°.
 PROCEDIMIENTO DEL METODO DISCO
DIFUSION
 Los discos de antibióticos pueden ser colocados sobre la placa
inoculada usando: pinzas estériles, una plantilla o un
dispensador de discos de antibióticos.
 PROCEDIMIENTO DEL METODO DISCO
DIFUSION
 Las placas deberían ser colocadas en la incubadora (en ambiente
o en campana con CO2) dentro de los 30 minutos de su
preparación.
Microorganismos Temperatura
Enterobacterias, P.aeruginosa, 35 ± 2°C, Amb, 16-18 hrs.
Staphylococcus spp., Enterococcus
spp.
Acinetobacter spp., B. cepacia, 35 ± 2°C, Amb. 20-24 hrs.
S. maltophilia
Haemophilus spp. 35 ± 2°C, 5% CO2,16-18 hrs.

Neisseria gonorrhoeae 36 ± 1°C, 5% CO2,20-24 hrs

S. pneumoniae, Streptococcus spp. 35 ± 2°C, 5% CO2,20-24 hrs.

y N. meningitidis
 PROCEDIMIENTO DEL METODO DISCO
DIFUSION
MEDIDAS DE LA ZONA DE
INHIBICION:
 Usando una regla: medir bajo la
superficie de la placa conteniendo
el medio transparente.
 Usando un Vernier (pie de rey):
medir sobre la superficie de la
placa conteniendo el medio opaco.
 PROCEDIMIENTO DEL METODO DISCO
DIFUSION
MEDIDAS DE LA ZONA DE
INHIBICION:
 Usando una lectora
automatizada de las zonas
de inhibición .
̶ BIOMIC
̶ OSIRIS
̶ HALODAX
̶ AURA
PROCEDIMIENTO DEL METODO DISCO
DIFUSION
Luz reflejada Luz transmitida
INTERPRETACION DEL ANTIBIOGRAMA
 INTERPRETACION DEL ANTIBIOGRAMA
SENSIBLE:
Implica que los aislamientos son inhibidos por las concentraciones alcanzadas
normalmente del agente antimicrobiano cuando la dosis recomendada para el
tratamiento del sitio de infección es utilizado…
INTERMEDIO:
…Implica eficacia clínica en sitios del cuerpo donde los antibióticos están
fisiológicamente concentrado (pe. quinolonas y β-lactámicos en la orina) o
cuando una dosis mas alta de lo normal de un medicamento puede ser utilizado
(pe. β-lactámicos)…
RESISTENTE:
Implica que los aislamientos no son inhibidos por los concentraciones
alcanzadas normalmente del agente antimicrobiano con los esquemas de
dosificaciones normales…. Manual de la CLSI M100-S26, 2016
MANUAL CLSI M100-S26
T1: Enterobacteriaceae
T2: Pseudomonas aeruginosa
T3: Acinetobacter spp.
T4: Burkholderia cepacia
MMcomplex
T5: Stenotrophomonas
MMmaltophilia
T6: Otras no Enterobacterias
T7: Staphylococcus spp.
T8:Enterococcus spp.
http://em100.edaptivedocs.info/dashboard.aspx
T9: Haemophilus influenzae y
mmiiHaemophilus parainfluenzae
T10: Neisseria gonorrhoeae
T11: Streptococcus pneumoniae
T12: Streptococcus
MMMbetahemoliticos
T13: Streptococcus
MMMalfahemoliticos
T14: Neisseria meningitidis
T15: Anaerobios
T16: Propionibacterium acnes
 MANUAL CLSI M45-3ra edición 2015
METODOS PARA LA DETERMINACION DE LAS PRUEBAS DE
SENSIBILIDAD POR DIFUSION Y DILUCION PARA BACTERIAS
FASTIDIOSAS O QUE SE AISLAN INFRECUENTEMENTE

T1: Abiotrophia y Granullicatella T9: Lactobacillus spp.

MMspp.
T2: Complejo Aeromonas
MMHydrophila y Plesiomonas
MMshigelloides
T3: Bacillus spp. (No-
MMB.anthracis)
T4: Campylobacter jejuni / coli
T5: Corynebacterium spp.
T6: Erysipelothrix rhusopathiae
T7: Grupo Hacek
T8: Helicobacter
T10: Leuconostoc spp.
T11: Listeria monocytogenes
T12: Moraxella catarrhalis
T13: Pasteurella spp.
T14: Pediococcus spp.
T15: Vibrio spp. (incluye V.
MMMcholerae)
T16: Potenciales agentes de
MMMBioterrorismo.
 MANUAL CLSI M45-3ra edición 2015
Campylobacter jejuni /coli
Macrolidos Contenido disco Punto de corte Diámetro (mm) Punto de corte MIC
(µg) (µg/mL)
S I R S I R
Eritromicina 15 ≥ 16 13-15 ≤ 12 ≤8 16 ≥ 32

Quinolona Contenido disco Punto de corte Diámetro (mm) Punto de corte MIC
(µg) (µg/mL)
S I R S I R
Ciprofloxacina 5 ≥ 24 21-23 ≤ 20 ≤1 2 ≥4

Tetraciclina 30 ≥ 26 23-25 ≤ 22 ≤4 8 ≥ 16
Doxiciclina - - - - ≤2 4 ≥8
 CONTROL DE CALIDAD EN EL
ANTIBIOGRAMA: DISCO DIFUSION
 FACTORES QUE INFLUYEN EN EL TAMAÑO
DE LA ZONA DE INHIBICION
 El medio de cultivo
̶ Composición
̶ Profundidad
̶ pH
̶ Cationes
 El inoculo.
 Tiempo y temperatura de
incubación.
 Tamaño y la carga de los discos.
 COMPOSICION DEL AGAR
 Agar Mueller Hinton
 Buena reproducibilidad y bajo nivel de
inhibidores.
 Satisfactorio crecimiento para la
mayoría de patógenos.
 Almacenar en refrigeración (4-8 ºC).
 Duración: de 7 hasta 14 días sellados
con parafilm o en bolsas.
 Realizar control de esterilidad y calidad.
 INFLUENCIA DE LA PROFUNDIDAD EN EL
TAMAÑO DE LA ZONA DE INHIBICION
AGAR MUELLER HINTON
h: 6 mm Halo de inhibición

15 mm

h: 4 mm
Halo de inhibición

20 mm

h: 2 mm Halo de inhibición

25 mm
Profundidad del agar: 4 ± 0.5
 CALCULO DEL VOLUMEN DE LA PLACA
 OJO: “Diferentes marcas de placas,
diferentes diámetros”
2
Vol = π . r . h
2
Vol agar = 3.14 x ( r ) x 0.4 cm
Si ϴ = 9 cm » 25.4 ml
r = radio de la placa Petri Si ϴ = 10 cm » 31.4 ml
Si ϴ = 15 cm » 70.6 ml

Tolerancia:  0.5 cm (3.5 – 4.5)

 TAMAÑO Y PESO DE LOS DISCOS
Estándares para los discos Code of Federal Regulations
1 cm2 papel filtro del disco = 30 mg ± 4
Medida del disco = 6.18 mm
Peso de un disco = 9 mg
Área del disco = π.r2
A = 3.1416 x (3.09)2
A = 29,9963 mm2
A = 0,2999 cm2 9 mg
1 cm2 30.01 mg
Peso de los discos
 CONTROL DE CALIDAD EN EL
ANTIBIOGRAMA: DISCO DIFUSION
 El uso correcto y exacto del antibiograma es
dependiente de un buen control de calidad.
 Control de calidad: reactivos, medio,
procedimiento y competencia del personal.
 Resultados del paciente no deberían ser
entregados si los resultados de las cepas de
control de calidad están fuera de las
especificaciones.

Performance Standars for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests, M2-A12, CLSI, 2012
 CONTROL DE CALIDAD EN EL
ANTIBIOGRAMA: DISCO DIFUSION
 Cepas patrón para el control de calidad:
 Staphylococcus aures ATCC 25923
 Escherichia coli ATCC 25922
 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
 Escherichia coli ATCC 35218
 El control de calidad se debe hacer:
Cada semana o cada 5 lotes de pruebas
Cada nuevo lote del agar Mueller Hinton
Cada nuevo lote de discos.
 CONTROL DE CALIDAD EN EL
ANTIBIOGRAMA: DISCO DIFUSION
 CONTROL DE CALIDAD EN EL
ANTIBIOGRAMA: DISCO DIFUSION

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
 CONTROL DE CALIDAD EN EL
ANTIBIOGRAMA: DISCO DIFUSION
 Cepas de QC: Almacenamiento
– Guardar en pico de agar a 2 - 8 °C, subcultivadas
semanalmente hasta por un mes.
– En caldo (BHI) o skim milk a - 70°C.
 Discos y tiras de E-test: almacenamiento
– Los discos y tiras de uso diario deben ser
guardados a 4°C. Si no están en uso guardar a
- 20°C.
– Antibióticos β-lactamicos se recomienda guardar a
-20°C.
METODO DISCO DIFUSION: PRINCIPIOS
Leyes Generales de la Difusión

Factores Relacionados a la Difusión

 METODO DISCO DIFUSION: PRINCIPIOS
Difusión de los Agentes Antimicrobianos en el Agar

VARIABLES:
LA CARRERA «BACTERIA – ANTIBIOTICO»: 1. Concentración inicial
1. La difusión del antibiótico desde el disco a 2. Estructura y tamaño del antibiótico
través del agar. 3. Temperatura de incubación.
2. Crecimiento del organismo. 4. Características físico-químicas del gel.
CARACTERISTICAS DE LA ZONA DE
INHIBICION
Halo de inhibición

3 4
2
1
disco
Difusión del antibiótico

1. Zona de completa inhibición MIC

2 . Zona de crecimiento tardío
3. Zona de parcial inhibición
4. Zona de crecimiento estimulado
CARACTERISTICAS DE LA ZONA DE
INHIBICION

MIC

MIC
 CARACTERISTICAS DE LA ZONA DE
INHIBICION
DISCO
6 mm Concentración del disco: 10 g
Ampicilina 10µg
Diámetro del disco: 6 mm
80 g/ml
Espesor del agar: 4 mm

La superficie es de 30 mm2
4 mm
El volumen es de 120 mm3
4 mm
La concentración en el
Agar borde del disco es:
Mueller Hinton 10 g/120 mm3 = 80 g/ml
RELACION ENTRE EL MIC Y EL DIAMETRO
DE INHIBICION
25 mm
20 mm

80
AM

32
16
8
4
2 ug/ml ~ MIC
32 16 8 4 2 1 0.5 ug/ml
MIC
 FACTORES RELACIONADOS A LA DIFUSION
 La ley de difusión de Cooper (1946)

d2 = 4 D t 2,3(log C0 – log C1) Co C1

d = distancia de inhibición (diámetro de la zona)

D = coeficiente de difusión propio de cada antibiótico d
MIC
T = tiempo de difusión
C0 = concentración a nivel de la fuente
C1 = concentración en el borde de la zona de inhibición
MMN(concentración inhibitoria aproximada de la cepa estudiada)

Cooper K.E, and Woodman D. 1946. The diffusion of antiseptic through agar gels with special reference to
the agar cup assay method of estimating the activity of penicillin. J. Pathol. bacteriol. 58: 75-84.
 FACTORES RELACIONADOS A LA DIFUSION
 Formula de Humphrey and Lightbown (1952)

r2 = 9.21 Dt (logM – log 4πhDtc)

M
C
r = radio de la zonas de inhibición
D = constante de difusión de cada antibiótico
t = tiempo de inicio r
MIC
M = potencia del disco
c = es el MIC
h = profundidad del agar
Humphrey, J.H., and J.W. Ligthbown. 1952. A general theory for plate assay of
antibiotics with some practical applications. J. Gen. Microbiol. 7, 129-43.
 CALCULO DEL MIC
Curva de regresión de AMPICILINA CARGA DEL DISCO: 10 ug
128
Puntos de corte (breakpoints):
64
Concentraciones criticas: 8 – 32 (µg/ml)
32 Diámetros críticos: 13 – 17 (mm)
16
y = ax + c
8
donde :
MIC 4
y = diámetro (mm)
2
x = log 2 MIC (µg/ml)
1
6 10 13 15 17 20 22 25
mm
 10
Determinación del MIC a partir del halo de
Curva de regresión de CEFTRIAXONA
inhibición del antibiograma por disco difusión.
PUNTOS DE CORTES DE CEFTRIAXONA:

Interpretación CMI (ug/ml) Diámetro (mm)

Sensible ≤1 ≥ 23
Resistente ≥4 ≤ 19
1

30 mm

0.1
MIC de ceftriaxone: 0.09 µg/mL.

0.01
0 10 20 30 40
“… el pronóstico de la terapia antibiótica debería estar
basada en la relación entre la sensibilidad de la bacteria in
vitro y la concentración del antibiótico en varios fluídos
corporales. Como la concentración de los antibióticos en los
tejidos es a menudo menor que la en plasma, un debe como
regla tratar de asegurar que las concentraciones en plasma
sean 5 a 10 veces mayores que el nivel de sensibilidad (MIC)
correspondiente al agente etiológico”.

Hans Ericsson, M.D.

Professor of Microbiology
Karolinska Institute, Stockholm,
April 1961
 CONCENTRACION DEL ANTIMICROBIANO
EN EL SITIO DE INFECCION
 Debe ser por lo menos , de 2 a 4 veces mayor
que el valor del MIC:
Para que una
antimicrobiano alcance
una concentración
bactericida, y no sea
inhibitoria.
Fluoroquinolonas: 8 Aminoglucósidos: 10
Betalactamicos:
Penicilina > 4 Cefalosporinas > 16
 EVOLUCION DE LA CONCENTRACION
SERICA DE UN ANTIBIOTICO
Concentración sérica
g/ml COMPARACION CON EL MIC DE UN GERMEN
valores críticos de concentración
(Puntos de cortes)

R
C
I
MIC > C
c < MIC < C
c S

MIC < C

Tiempo en
Antibiótico 2 4 6 8 horas
 INDICE TERAPEUTICO (IT)
 Llamada también COCIENTE INHIBITORIO (IQ).

NIVEL SERICO ó NIVEL URINARIO

IT (IQ) =
CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA

 Cuando mayor es el índice terapéutico, mayor es la

probabilidad de que el tratamiento sea eficiente.
 Cuando mayor sea el nivel sérico o urinario y menor
el MIC mas eficiente será la terapia.
 UTILIZACION DEL INDICE TERAPEUTICO
Microorganismo: Escherichia coli Muestra : Orina
Diámetro en Interpretación
ANTIBIOTICO MIC IT
mm clínica

AMPICILINA 14 I 22.62 15.4

CIPROFLOXACINA 15 R 4.00 75.0
CEFTRIAXONA 20 R 2.82 283.6
GENTAMICINA 22 S 0.15 2666.6
NITROFURANTOINA 18 S 20.15 7.4
COTRIMOXAZOL 15 I 10.21 9.79

Índice Terapéutico (IT): Concentración del ATB en orina / MIC

 SISTEMAS AUTOMATIZADOS DEL METODO
DISCO DIFUSION
MEDIDAS DE LA ZONA DE
INHIBICION:
 Usando una lectora
automatizada de las zonas
de inhibición .
̶ BIOMIC
̶ OSIRIS
̶ HALODAX
̶ AURA
http://www.biomic.com/mics.html
Los resultados
cualitativos (halos de
inhibición) del método
disco difusión
correlaciona bien con
resultados cuantitativos
de las pruebas de MIC
Kirby, Bauer, Sherris, y Tuck (1966)
“…Cualquiera que les declare la guerra a los
microbios va a perder… Lo que tenemos que hacer
es aprender a llevarnos bien con los
microorganismos y entender su biología, ecología
y evolución”
Michael Gillings

Muchas Gracias por su atención