DETECCION DE LA

RESISTENCIA BACTERIANA
MODULO 2
Pruebas de susceptibilidad
antimicrobiana
Javier Orlando Soto Pastrana
 PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS
ANTIMICROBIANOS: HISTORIA

ANTISÉPTICO

zanja
Evaluación antisépticos (1924)
Fleming A. (1924). A comparison of the activities of antiseptics on bacteria and on Técnica “ditch plate”
leucocytes. Proceedings of the Royal Society of London, Series B96, 171 -80.
 PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS
ANTIMICROBIANOS: HISTORIA
 En 1929, Fleming desarrollo la
técnica de caldo dilución usando
como un indicador de punto final
la turbidez.
 En 1942, Fleming modifico el
método de caldo dilución usando
como un indicador de punto final
el pH en vez de turbidez.
Fleming, A. (1929). On the antibacterial action of cultures of a penicillium, with special
reference to thier use in the isolation of B. influenzae. Br. J. Exp. Pathol. 10: 226-236.

Fleming, A. (1942). In-vitro tests of penicillin potency. Lancet , i : 732-3

 PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS
ANTIMICROBIANOS: HISTORIA
 En 1940, Schmith y Reymann
describieron por 1ra vez la técnica de
dilución en agar.
 En 1954, Ericsson y col. publican un
método en disco de papel.
 En 1966, Kirby y col. estandarizaron el
método de disco difusión en agar.
 En 1975, Se crearon los comités de
estandarización: NCCLS (ahora la CLSI
“Clinical Laboratory Standard Institute”).
 PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS
ANTIMICROBIANOS: HISTORIA
 En 1974: aparecieron los primeros Sistemas automatizados.
– Autobac Disc elution system (Pfizer Diagnostic) resultados 4-6h
 En 1977, Abbott MS-2 System: resultados en 4h (+identificación)
 En 1977, se introdujo al AMS System predecesor del VITEK.
 PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS
ANTIMICROBIANOS (ANTIBIOGRAMA)
 Son métodos in vitro que
determinan la susceptibilidad de
los microorganismos que deben
reunir condiciones de laboratorio
específicas y estandarizadas.

Indicados para cultivos bacterianos clínicamente relevantes (de fluidos

normalmente estériles o sitios clínicamente infectados) y cuando la
susceptibilidad no puede ser predicha (Enterobacterias, Pseudomonas,
Estafilococos, Enterococos, Neumococos y Neisserias).
 IMPORTANCIA DEL ANTIBIOGRAMA
OBJETIVOS:
 Guiar al clínico en la elección del
mejor tratamiento del paciente.
 Monitorizar la evolución de la
resistencia bacteriana para poder
actualizar los tratamientos
empíricos.
El antibiograma mide la sensibilidad de una bacteria a diferentes
antimicrobianos in vitro y a partir de estos resultados predice la
eficacia in vivo.
 IMPORTANCIA DEL ANTIBIOGRAMA
 La sensibilidad del antibiótico no
predice necesariamente su eficacia in
vivo.
 Requiere además:
– Que el antibiótico alcance el lugar de la
infección.
– Que el antibiótico se concentre en el
sitio de infección.
– Que la concentración del antibiótico sea
sostenida en el tiempo.
 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA RESPUESTA
AL TRATAMIENTO ANTIBIOTICO
 Factores del agente antimicrobiano:
– Farmacocinética (ADME).
– Unión a proteínas del plasma.
– Vías de administración.
– Acción bacteriostática o bactericida.
– Concentración en el sitio de infección.
 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA RESPUESTA
AL TRATAMIENTO ANTIBIOTICO
 Factores del microorganismo:
– Virulencia.
– Alta concentración de microorganismos.
– Infección mixta.
– Desarrollo de resistencia durante el
tratamiento.
EFECTO INOCULO
 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA RESPUESTA
AL TRATAMIENTO ANTIBIOTICO
 Factores del huésped:
– Enfermedad de base.
– Estado inmunológico.
– Formación de absceso.
– Presencia del cuerpo extraño.
– Función renal y hepática.
– Cumplimiento del tratamiento.
 METODOS DE ANTIBIOGRAMAS
MÉTODOS
FENOTÍPICOS

DILUCION DIFUSION AUTOMATIZADO

MÉTODOS
BIOQUIMICOS

MÉTODOS
MOLECULARES
 METODOS FENOTIPICOS

Macrodilución Microdilución

Agar dilución Disco difusión E-test

Es una de las funciones más importantes de los laboratorios de microbiología clínica.
 METODO DE MACRODILUCION

CONTROL 0.2µg/ml 0.4µg/ml 0.8µg/ml

1.6µg/ml 3.1µg/ml 6.3µg/ml 12.5µg/ml 25µg/ml 50µg/ml

MIC: 1.6 µg/ml

MIC: La mas baja concentración del agente antimicrobiano

capaz de inhibir el crecimiento / multiplicación bacteriana (µg/ml)
 METODO DE MACRODILUCION
128 64 32 16 4 Dia 1
8 2 C1 C2
Adicionar 1 ml de la
suspensión de la
bacteria (1*106 CFU/ml)
a los tubos conteniendo
1 ml de caldo y
antibiótico (µg/ml)

64 32 16 8 4 2 1 C1 C2

Controles:
C1 = No antibiótico, verificar
viabilidad en placas de agar
Concentración bacteriana = 5*105 CFU/ml inmediatamente.
Incubar a 35 oC C2 = No bacteria
 METODO DE MACRODILUCION
64 32 16 8 4 2 1 C1 C2
Día 2
Anotar visualmente la
turbidez
Subcultivar los tubos no
turbios a placas de agar
(usar asas de 0.01 ml)
0.01 ml (diseminar en la placa), Incubar a 35 oC MIC = 16 µg/ml
Dia 3
Determinar las UFC en las placas:
En la placa de 16 µg/ml =
700 UFC/ml > 0.1% of 5 x 105 CFU/ml

64 32 16 MBC = 32 µg/ml
MBC: la mas baja concentración del agente antimicrobiano necesario para
producir una disminución del tamaño original del inoculo bacteriano en un
porcentaje mayor o igual al 99.9% (µg/ml).
 METODO DE MACRODILUCION
• 100% de la concentración original
bacteriana:
– 5 x 105 UFC/ml

• 0.1%
– [(5 x 105) x 0.1] / 100 UFC/ml
– 500 UFC/ml

• El recuento de colonias debería ser

menos de 5 UFC en la placa de agar
subcultivado con 0.01 ml.
– 500 x 0.01 = 5 UFC
 METODO DE MICRODILUCION

0.5 - +
1
2
4
8
16
32
64
≥64
 METODOS MICRODILUCION

VITEK® 2 Compact BD Phoenix™ System MicroScan WalkAway System

(bioMerieux-Vitek) (BD Diagnostic Systems) (Beckman Coulter)
 METODO DE AGAR DILUCION
M07-A9

MIC= 4µg/mL

MIC= 8 µg/mL
 METODO DE AGAR DILUCION

M07-A9
 METODO DIFUSION EN GRADIENTE
 Técnica que combina los
principios de la difusión en disco y
la dilución en agar en el estudio de
la susceptibilidad in vitro.
 Desarrollado en Suiza 1988 (E-test)
 Es muy simple y fácil de usar, y a
diferencia de la difusión en disco,
entrega un resultado cuantitativo
(MIC)
 METODO DIFUSION EN GRADIENTE
5 mm

 Es una tira plástica que

contiene un antimicrobiano en
un gradiente de concentración
predefinido y estable. 60 mm

 Amplio rango de concentraciones

(15 diluciones)
̶ 0.00025 – 4 ug/ml
̶ 0,002 – 32 ug/ml
̶ 0,016 – 256 ug/ml
̶ 0,032 – 512 ug/ml
Mediante el uso de una innovadora
̶ 0,064 – 1024 ug/ml técnica de química seca
 METODO DIFUSION EN GRADIENTE
GRADIENTE PREFORMADO: NO SE GENERA POR DIFUSION

Trasferencia La estabilidad de
inmediata desde la gradiente es
la tira al agar en mantenida hasta
“impronta” 18 a 20 horas
METODO DIFUSION EN GRADIENTE

MIC
 METODO DIFUSION EN GRADIENTE

Resistente
≥ 8 µg/mL

MIC Intermedio
2 – 4 µg/mL

MIC
Sensible
≤ 1 µg/mL

Pre calibrada con “escala continua” de valores

precisos de CIM (µg/ml)
 TOLERANCIA DEL INOCULO
E. coli ATCC 25922 / Gentamicina

102 103 104 105 106 107 UFC/mL

 ANTIBIOTICOS CON ALTO PESO
MOLECULAR

Disco
Disco (mm) vs
16 17 18 19
Gradiente
Predefinido

64
MIC por Etest
16
Vancomicina
2
0.5
vancomicina
 LECTURA DEL METODO DIFUSION EN
GRADIENTE

La intersección esta entre las marcas.
Leer el próximo valor mas alto. MIC
0.19 µg/mL.
Diferentes intersecciones en los
lados de la tira. Leer el valor mas
alto; si la diferencia es > de 1
dilución, repetir la prueba. MIC 0.5
µg/mL.
Leer donde la subpoblación Colonias resistentes aisladas debido a
resistente esta completamente mutación de bajo nivel. MIC > 256 µg/mL.
inhibida. MIC 4 µg/mL.
IMPORTANCIA EN EL USO DE LAS TIRAS DE
E-TEST
 Determinación de la prueba de
susceptibilidad para
microorganismos difíciles.
 H. influenzae
 N. gonorrhoeae
 N. meningitidis
 H. pylori
 Anaerobios
 Neumococo
 Streptococcus spp.
 Candida spp., etc
 IMPORTANCIA EN EL USO DE LAS TIRAS DE
E-TEST
 Determinación cuantitativa de
la prueba de sensibilidad (MIC)
para la terapia del paciente
individual y dirigida.

 Detección exacta del

mecanismo de resistencia
 IMPORTANCIA EN EL USO DE LAS TIRAS DE
E-TEST
Modelos farmacocinéticos y farmacodinámicos requieren MICs precisos
Pico /MIC
Concentración

ABC/MIC

Tiempo>MIC

MIC

Tiempo
 COCIENTE MIC BREAKPOINT (MBQ)
 Es calculado dividiendo el MIC
del breakpoint «Sensible» de
un antibiótico entre el MIC de
64
un patógeno en particular.
16
 El antibiótico mas eficaz seria
1.0 1.0 el que tiene el mas bajo MIC y
0.19
0.25 el mas alto MBQ
 Herramienta muy practico para
dirigir y afinar la terapia.
 MBQ: UN MODELO SIMPLE PK/PD

1 1
8 6 6
2

0.25

ACTIVIDAD IN VITRO : Antibiótico D > C > B > E > A

EFICACIA ESPERADA : Antibiótico C > E > D > B > A
 DETECCION EXACTA DEL MECANISMO DE
Cefepime
RESISTENCIA
Cefotetan Imipenem Meropenem
cefepime + Ac. clavulanico cefotetan + Ac. Boronico Imipenem + EDTA Meropenem + Ac. Boronico hGISA GISA
 DETECCION EXACTA DEL MECANISMO DE
RESISTENCIA
PRUEBA POSITIVA: Meropenem + EDTA Meropenem

1. Detección de la zona
fantasma.
2. Disminución del MIC del
antibiótico en 3 zona fantasma
(POSITIVO)
diluciones con respecto
Meropenem + Ac. Boronico Meropenem
al antibiótico + inhibidor.
3. Cociente del MIC del
antibiótico entre el MIC
del antibiótico + 1.5 / 0.64 = 23.43
inhibidor ≥ 8. MIC MP/MIC MPB ≥ 8 POSITIVO
 METODO DISCO DIFUSION
 Método de Kirby-Bauer
̶ Disco filtro impregnado con antibiótico.
̶ Método para mas de un antibiótico
̶ La sensibilidad se determina midiendo
el tamaño de la “zona de inhibición”.
̶ 1949: Bondi y col. disco de papel
̶ 1966: Kirby, Bauer, Sherris, y Tuck
estandarizaron el método.
̶ 1975: NCLSS (CLSI) adoptaron los
pasos en el manual M02.
Kirby y Bauer y col. demostraron que los resultados cualitativos del método disco
difusión correlaciono bien con resultados cuantitativos de las pruebas de MIC.
 METODO DISCO DIFUSION
Curva de regresión de
 Análisis de regresión 128 AMPICILINA

64

32

16

MIC 4

2
1
6 10 13 15 17 20 22 25
mm
 PRINCIPIOS DE LAS PRUEBAS DE
SUSCEPTIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA)
METODO CALDO DILUCION

METODO E-TEST
MIC METODO AGAR DILUCION

METODO AGAR DISCO DIFUSION

 VALORES DE LAS PRUEBAS DE
SUSCEPTIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA)
Valores Cuantitativos

HALOS DE INHIBICION (mm)

o
MIC (µg/ml)

Criterios microbiológicos
Criterios farmacológicas
Criterios clínicos

Valores Cualitativos

CATEGORIAS CLINICAS:
S SDD I R
 CATEGORIZACION CLINICA
SENSIBLE:
Implica que los aislamientos son inhibidos por las concentraciones alcanzadas
normalmente del agente antimicrobiano cuando la dosis recomendada para el
tratamiento del sitio de infección es utilizado…
INTERMEDIO:
…Implica eficacia clínica en sitios del cuerpo donde los antibióticos están
fisiológicamente concentrado (pe. quinolonas y β-lactámicos en la orina) o
cuando una dosis mas alta de lo normal de un medicamento puede ser utilizado
(pe. β-lactámicos)…
RESISTENTE:
Implica que los aislamientos no son inhibidos por los concentraciones
alcanzadas normalmente del agente antimicrobiano con los esquemas de
dosificaciones normales…. Manual de la CLSI M100-S26, 2016
 CATEGORIZACION CLINICA
SENSIBLE DEPENDIENTE DE LA DOSIS (SDD):
 La sensibilidad de un aislamiento es
dependiente del régimen de dosificación
que se utilice.
 Pie de nota: El criterio sensible se basa
en una dosis de 1g/12h. El criterio SDD
se basa en regímenes de dosificación
que resulten en una mayor
concentración de cefepime, ya sea
aumentando la dosis, la frecuencia o
ambos hasta alcanzar los limites
aprobados. Infusión continua
 CATEGORIZACION CLINICA

Datos Datos Datos

Microbiológicos Farmacológicos Clínicos

PUNTOS DE CORTE

SENSIBLE INTERMEDIO RESISTENTE

Agente Contenido Diámetro (mm) MIC (µg/ml)

antimicrobiano del disco R I S R S

Ampicilina 10 µg  13 14 - 16  17  32 8
 CURVA DE REGRESION
RESISTENTE
256
128
N: 300 – 500 cepas
64

32
16 SENSIBLE
8
4
2

6 10 14 18 22
DIAMETRO DE LA ZONA DE INHIBICION (mm)
 COMITÉ DE EXPERTOS
Metodologías estandarizadas (Europa)
 Swedish Reference Group for Antibiotics (Suecia)

 Deutsches Institut für Normung (Alemania)

 Werkgroep Richtlijnen Gevoeligheidsbepalingen (Holanda)

 British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC)

 Societé Française de Microbiologie (Francia)

 SENSIBLE
MIC INTERMEDIO Como debemos reportar
RESISTENTE las pruebas de
susceptibilidad?

MICs
vs
Categorización
clinica
 IMPORTANCIA DEL MIC
El conocimiento exacto y a tiempo del MIC para una
variedad de antibióticos y NO solo saber que es S, I o R es
importante para la decisión de elegir el antibiótico, la dosis
y el esquema de dosificación que generaría un favorable
resultado clínico y minimizaría la emergencia de la
resistencia.
George L. Drusano, M.D.
Co-Director
Ordway Research Institute
Albany, NY, USA
 METODOS AUTOMATIZADOS

VITEK® 2 Compact BD Phoenix™ System MicroScan WalkAway System

(bioMerieux-Vitek) (BD Diagnostic Systems) (BECKMAN COULTER)
 METODOS AUTOMATIZADOS

 Reporte del MIC (µg/mL), la categorización clínica (S, I o R) y informe del

probable mecanismo de resistencia (Ej. BLEE, AmpC o Carbapenemasa).
49
 METODOS BIOQUIMICOS
Detección de β-lactamasa
 Fundamento: discos o tiras
impregnados con una
cefalosporinasa cromogénica
que cambia de color cuando
es hidrolizado.
 Utilidad:
– Resistencia a AMPICILINA:
Haemophilus spp., Neisseria spp.,
Moraxella spp. y Enterococcus spp.
– Resistencia a PENICILINA en
Staphylococcus spp.
Nitrocef Disks™ Cefinase Disks™
 METODOS BIOQUIMICOS
ESBL NDP y CARBA NP. 2015 CLSI M100-S15
 Basado en la hidrolisis de CTX e IMP.
 Cambio de color en el indicador de
pH (Rojo de fenol).
 Requiere extractor enzimático.
 Rápido (< 2 horas).
RAPIDEC® CARBA NP
(Biomerieux)
Resultados en 30 min - 2 horas

Sensibilidad: 100%
Dortet et al., AAC 2012: 56: 6437
Especificidad: 100% Dortet et al., JCM 2012; 50: 3773
 METODOS BIOQUIMICOS
BLUE CARBA: Ensayo bioquímico.
 Basado en la hidrolisis de imipenem.
 Cambio de color en el indicador de
pH (azul de bromotimol).
 NO Requiere extractor enzimático.
 Rápido (< 2 horas).
Rapid CARB Blue Kit
(Rosco Diagnostica)

Sensibilidad: 91%
Especificidad: 100%
PRUEBAS INMUNOCROMATOGRAFICAS
 METODOS MOLECULARES
Cepheid GeneXpert® System PCR en un cartucho
descartable:

Lisis bacteriana
Extracción del ADN
Amplificación
Detección del amplicón

Xpert® Carba-R
Detecta genes de KPC, VIM, NDM,
IMP-1 and OXA-48.
NO detecta OXA-181.
 METODOS MOLECULARES
FilmArray®
Muchas Gracias por su atención

“…Una máquina puede hacer el trabajo de 50

hombres corrientes. Pero no existe ninguna
máquina que pueda hacer el trabajo de un hombre
extraordinario”
Elbert Hubbard