Técnicas de laboratorio para el diagnóstico de enfermedades víricas en animales

Cultivos víricos
Se han desarrollado métodos para el almacenamiento, visualización, cuantificación y de propagación
de los virus
También hay métodos para el diagnóstico de laboratorio de enfermedades virales como los métodos
serológicos basados en la detección de la respuesta del hospedador a la infección
Los virus necesitan células vivas para replicarse. Muchos virus se replican de forma activa en
cultivos celulares. Se denomina efecto citopático a las alteraciones morfológicas visibles
características en una línea susceptible debido a la replicación del virus.
Las líneas celulares pueden propagarse y/o mantenerse en el laboratorio, aunque lo más habitual es
adquirir los cultivos celulares monocapa comerciales. Las líneas celulares diploides son aquellas que
mantienen la infección vírica hasta de 20 a 50 pasadas y proceden de células fetales o de recién
nacidos. Un ejemplo son los fibroblastos humanos diploides. Las líneas celulares continuas son las
que proceden de cánceres humanos o animales o son células transformadas in vitro (Buitrago, 2012).
Huevos embrionarios
Huevos embrionados

 El huevo de pollito embrionado fue utilizado por primera vez para el cultivo de virus por
Goodpasture en 1931.
 El método desarrollado por Burnet se utilizó para el cultivo de virus en diferentes sitios del
huevo embrionado.
 Por lo general, los huevos de pollito de 8 a 11 días se utilizan para el cultivo de virus.
 Los virus se aíslan en diferentes sitios del huevo, como el saco vitelino, la cavidad amniótica
y la cavidad alantoidea y la membrana corioalantoidea (CAM).
 Muchos de estos virus causan focos característicos y bien definidos, que proporcionan un
método para la identificación, cuantificación o evaluación de la patogenicidad del virus.

En los huevos se identifican diferentes zonas con características distintas. Los diversos virus tienen
preferencia por localizaciones concretas.
Membrana corioalantoidea
La membrana corioalantoidea es el lugar preferente para inocular poxvirus. Tras unos días, se
pueden observar en esta membrana unas marcas, llamadas pocks, que son como manchas
blanquecinas en el tejido transparente. La inoculación de poxvirus en la membrana corioalantoidea
se puede emplear para cuantificar la concentración de virus, ya que se considera que cada pock
está producido por un virus. También pueden inocularse aquí el virus del herpes simplex, y el virus
del sarcoma de Rous.
Cavidad alantoidea
Otra localización es la cavidad alantoidea. La mayoría de los virus aviares se pueden aislar
inoculando la muestra en esta cavidad. Aquí se incluirían los adenovirus aviares, o el virus de la
enfermedad de Newcastle. Además, se emplea para la producción de vacunas frente a la influenza,
la fiebre amarilla, la rabia, o las paperas.
 Saco amniótico
El saco amniótico se emplea para el aislamiento primario de virus influenza o de las paperas, virus
que al tener hemaglutininas pueden detectarse porque producen hemaglutinación.
Saco vitelino
Finalmente, la inoculación en el saco vitelino es el método más sencillo para la multiplicación de
virus, aunque se dan mecanismos de interferencia en la mayoría de los virus aviares. En el saco
vitelino, que no es más que la yema del huevo, pueden crecer los virus del herpes simplex.
Usos
Como hemos comentado antes, los huevos embrionados se emplean ampliamente para el
aislamiento de muchos virus aviares y algunos de mamíferos, que pueden adaptarse a crecer en
embriones de aves. A través de este proceso, pueden atenuarse, adquiriendo mutaciones que los
hacen menos patógenos
En la actualidad, las vacunas antigripales se producen en embriones de pollo.
Método de inoculación de los virus
1. Selecciones los huevos embrionarios de 6 a 11 días de incubación (verificar por
transiluminación
2. Ubicar y marcar con una x donde se va a inocular el virus.
3. Delimitar la cámara de aire
4. Desinfectar el área delimitada con una solución yodada.
5. Realizar un pequeño agujero en el centro de la cámara en forma intacta de la membrana de la
cascara
6. Con una jeringuilla de 1 ml cargue 02-03 ml del material a inocular
7. Tomar la jeringuilla para luego proceder a inocular
8. Con el huevo colocado en el ovoscopio, inserte la aguja en dirección al embrión y pinche
suavemente en el mismo
9. Verifique que el embrido siga el movimiento de la aguja (lo que indica que esta en el lugar
correcto)
10. Luego inyecte 0.2 ml del material (de esa manera se inocula en el saco amniótico). En la
cavidad alantoidea inocule 0,2 ml. Em la cavidad careoalantoidea inocule 0,3 ml del inoculo
11. Retire cuidadosamente la aguja del huevo y selle el orificio con parafina o esmalle de uña
12. Luego inocule a los huevos inoculados a 33 grados C durante 3 días
Cultivos de células y tejidos
Esta técnica se refiere al crecimiento y mantenimiento de células de tejido vivos in vitro: Hay dos
tipos cultivo de explantes y cultivo de células. Los explantes son pequeños fragmentos de tejidos del
hospedero que se mantienen en cultivo, mientras que el cultivo de células se obtiene mediante de la
disgregación de diferentes tejidos del hospedero en células individuales. La mayoría de los sistemas
usados en virología son en realidad cultivos celulares y no cultivos de tejidos, aunque ambos
términos se usan de manera indistinta. Los cultivos celulares se subdividen a su vez en cultivos
primarios, cultivos semi-continuos y cultivos continuos.
Cultivo de explantes
Estos son cultivos de pequeños fragmentos de tejidos específicos, tomados directamente del
hospedero animal. Los cultivos de explantes son útiles para el aislamiento viral y se requieren para el
aislamiento de algunos coronavirus. La demostración de latencia de alguna alfa herpesvirus humanos
y animales puede requerir explantes de ganglio nervioso sensitivo (por ejemplo, trigémino).
Cultivos celulares se obtienen mediante la desintegración de diferentes tejidos del hospedador en
células individuales esta se subdivide a su vez en cultivos primarios, cultivos semicontinuos y
cultivos continuos
Cultivos celulares primarios
Estos se derivan de tejidos frescos que han sido digeridos enzimáticamente con tripsina u otras
proteasas, para liberar células individuales. Como resultado, con frecuencia los cultivos primarios
están compuestos de muchos tipos celulares diferentes. En condiciones in vitro las células de los
cultivos primarios raramente pueden dividirse, o se dividen a una velocidad muy baja. Es por esto
que tienen un tiempo de vida limitado, conocido como límite de Hayflick. A pesar del tiempo de vida
limitado de los cultivos primarios, son ideales para el aislamiento de algunos virus. Los cultivos
primarios raramente sobreviven más allá del vigésimo pase in vitro.
Cultivos semicontinuos
Son también conocidos como líneas celulares diploides, debido a que contienen el cromosoma
diploide normal característico de la especie de la que ellos se derivan. Los cultivos semicontinuos
son cultivos primarios que tienen algunas células que pueden ser cuidadas para sobrevivir más allá
del límite de Hayflick. Los cultivos semi-continuos tienden a morir entre el 30° y el 50° pase in vitro.
A pesar de esta limitante, los cultivos semi-continuos son útiles en la propagación de una gran
variedad de virus. Los cultivos semi-continuos son por lo general de fibroblastos.
Cultivos celulares continuos
Se les conoce también como líneas celulares heterodiploides, debido a que poseen un número
anormal de cromosomas. Estos cultivos se derivan de tejidos normales o neoplásicos y se
caracterizan por su habilidad para ser propagados in vitro indefinidamente. De manera general, las
líneas celulares continuas no son tan sensibles como las otras para propagación viral. Sin embargo,
facilitan la propagación a gran escala de algunos virus para vacunas e investigación. Muchas líneas
continuas están disponibles de proveedores como la Colección Americana de Cultivos Tipo.
Pruebas serológicas
Las pruebas serológicas más comúnmente empleadas en los laboratorios de diagnóstico veterinario
para el diagnóstico de infecciones virales son: prueba de seroneutralización (SN); prueba de
inhibición de la hemoaglutinación (IH); prueba de la inmunodifusión en gel de agar (AGID por sus
siglas en ingles) y prueba de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
La ténica de seroneutralización (SN), consiste en una prueba punto final seroneutralizante, que
permite identificar y cuantificar la capacidad de los anticuerpos séricos para inhibir o neutralizar el
efecto citopático de una cepa dada.
La prueba SN permite detectar y cuantificar los anticuerpos neutralizantes específicos para un
virus en una muestra de suero. Normalmente se preincuban series de diluciones a la 1/2 de la
muestra sérica con una cantidad conocida de virus y después se añade a las células diana sensibles
a la infección viral. Esto permite que los virus no neutralizados infecten las células y se pueda
determinar cual es la mayor dilución que es capaz de neutralizar la infección vírica y la presencia
de un efecto citopático.
Los ensayos SN son muy sensibles y específicos, miden el título de anticuerpos neutralizantes tras
la infección o la vacunación. La cuantificación del título puede basarse en la presencia o la
ausencia del efecto citopático o en la evidencia de infección viral mediante una técnica
inmunoreactiva. La prueba SN es útil para evaluar el nivel de reactividad cruzada serológica entre
los antisueros vacunales y los aislados víricos para evaluar y correlacionar la protección cruzada
Test de hemaglutinación (HI)

Se trata de una prueba serológico para la detección de anticuerpos y se basa en el principio de que la
hemaglutinina de los virus influenza, como la de otros virus, tiene un efecto hemaglutinante sobre los
glóbulos rojos, por lo tanto, es el método estándar para la detección de anticuerpos anti-influenza.
Esto significa que la sangre coagulará cuando se le añadan estos virus, porque los glóbulos rojos se
unirán a la hemaglutinina de la superficie del virus.

Los anticuerpos específicos inducidos como respuesta inmune humoral a la infección o vacunación
con el virus pueden inhibir la aglutinación al unirse a las hemaglutininas.

Si la muestra contiene anticuerpos específicos frente a la hemaglutinina, al añadir el virus de la

influenza se produce una reacción antígeno/anticuerpo. Esto se evidenciará con la siguiente adición
de eritrocitos: ya no se aglutinarán porque la reacción estará inhibida.

El título sérico puede utilizarse para determinar las diluciones a las que todavía se inhibe la
hemaglutinación. El valor recíproco de la mayor dilución a la que todavía se inhibe la
hemaglutinación proporciona el título de anticuerpos.

La Inmunodifusión en Gel de Agar (IDGA), es una técnica serológica cualitativa que se basa en
una reacción antígeno-anticuerpo, utilizando un antígeno de tipo soluble; y es utilizada para el
diagnóstico indirecto de enfermedades como la Anemia Infecciosa Equina, o la Epididimitis Ovina.
Su objetivo en la detección de anticuerpos contra el antígeno utilizado, lo cual se hará evidente
mediante una reacción de precipitación (línea de precipitación) en un gel de agarosa o agar noble que
es utilizado como medio de soporte de la prueba.

prueba de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

En esta técnica de inmunoensayo un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo

enlazado a una enzima que puede generar un producto detectable, como un cambio de color.
Un ELISA es un ensayo inmunológico comúnmente utilizado para medir anticuerpos o antígenos,
incluidas proteínas o glicoproteínas, en muestras biológicas. Como otros inmunoensayos dependen
de la unión de anticuerpos a sus objetivos para facilitar la detección.

Por lo general, los ensayos ELISA se realizan en placas de 96 pocillos, un formato que los hace aptos
para el cribado de muchas muestras a la vez. Suero, plasma, sobrenadantes de cultivos celulares,
lisados celulares, saliva, lisados tisulares y orina son todos los tipos de muestras que se utilizan
habitualmentepara estos ensayos, pero la mayoría de los tipos de muestras líquidas podrían usarse en
teoría. Sin embargo, es importante tener en cuenta que algunos tipos de muestras pueden incluir
factores inhibidores, como componentes tampón que comparten epítopos antigénicos similares 1 o
factores como proteasas 2 que pueden dañar el objetivo o los componentes de detección, que pueden
interferir con el rendimiento del ensayo.
prueba ELISA directa
Con un ELISA directo, los antígenos o anticuerpos en una muestra se adsorben directamente en la
placa de prueba de una manera no específica. A continuación, se aplica a los pocillos un anticuerpo
de detección conjugado o un antígeno específico para la diana. A continuación, se realiza una
detecciónel sustrato se utiliza para producir un cambio de color medible que se puede cuantificar en
un lector de placas.
Cultivo de células/tejidos

El cultivo de tejidos se refiere al crecimiento y mantenimiento de células de tejidos vivos in

vitro. Hay básicamente dos tipos: cultivo de explantes y cultivo de células. Los explantes son
pequeños fragmentos de tejidos del hospedero que se mantienen en cultivo, mientras que el
cultivo de células se obtiene mediante de la disgregación de diferentes tejidos del hospedero
en células individuales. La mayoría de los sistemas usados en virología son en realidad cultivos
celulares y no cultivos de tejidos, aunque ambos términos se usan de manera indistinta. Los
cultivos celulares se subdividen a su vez en cultivos primarios, cultivos semi-continuos y
cultivos continuos.

Cultivo de explantes

Estos son cultivos de pequeños fragmentos de tejidos específicos, tomados directamente del
hospedero animal. Los cultivos de explantes son útiles para el aislamiento viral y se requieren
para el aislamiento de algunos coronavirus. La demostración de latencia de algunos alfa
herpesvirus humanos y animales puede requerir explantes de ganglio nervioso sensitivo (por
ejemplo, trigémino).