Cultivo de

virus en
huevos
embrionados
Prctica 9
Informe grupal G3-M2

Flores Huaylla, Kevin

Gamarra Castro, Roco
Lauro Guerra, Jos
Salsedo Castillo, Luz
Virologa CULTIVO DE VIRUS EN HUEVOS EMBRIONADOS

INTRODUCCION
Se han utilizado ms de 50 aos. El cultivo de virus gripal en huevo embrionado fue
empleado por primera vez por Burnet en 1935, demostrando que el embrin de pollo es un
medio muy sensible para el aislamiento de estos virus, siendo adems un medio estril y poco
costoso. Ha sido posible cultivar virus de diversos grupos en varias cavidades del huevo
fecundado, o en el propio embrin en desarrollo. Tambin se emplearon huevos de pato y de
ganso para cultivar ciertos virus, pues estos animales tienen un periodo de incubacin ms
prolongado que el pollo; pero como regla, sigue usndose huevo de gallina de 6 a 8 das de
incubacin aproximadamente (a veces se usa huevos de ms tiempo de incubacin).
Los virus slo pueden reproducirse en determinadas partes del embrin; por
consiguiente, se deben inyectar en la regin apropiada, en los Mixovirus crecen bien en la
membrana corioalantoidea, en tanto que el virus de la parotiditis prefiere la cavidad
alantoidea. La infeccin puede producir una lesin tisular local conocida como pstula, cuyo
aspecto, a menudo, es caracterstico del virus. El mtodo exacto de inoculacin y la edad del
embrin que se emplea, dependen del virus problema. Por ejemplo para aislar en forma
primaria el virus de la influenza a partir de material recogido de la garganta, suele inocularse
este en la cavidad amnitica de embriones de 7 a 8 das; pero el virus se duplica fcilmente en
la membrana alantoidea de embriones de 12 a 13 das, despus de varias resiembras
adaptacin en el amnios. Los focos ms utilizados para la inoculacin, a parte de las
cavidades amnitica y alantoidea, son la membrana corioalantoidea y el saco vitelino.
Algunas veces, puede inyectarse directamente el virus en el embrin en desarrollo,
recurriendo a la inoculacin intravenosa, intraperitoneal o intracerebral. Una vez que se
duplic el virus dentro de las clulas de las membranas o del embrin, puede liberarse a los
lquidos vecinos, los cuales constituyen entonces una buena fuente de virus. P. ej. el virus de
la influenza, que se duplica en el sistema respiratorio del embrin y en las clulas de la
membrana amnitica, pasa al lquido amnitico, que luego puede recogerse con una jeringa y
aguja. En cambio, otros virus, como p.ej. los de la viruela y el herpes, que se duplican en la
membrana corioalantoidea, siguen unidos a las clulas en las lesiones o pstulas que se
forman sobre dicha membrana. Al moler y deshacer en una solucin salina isotnica las
membranas, logran liberarse estos virus. En consecuencia el crecimiento de un virus en un
embrin de pollo puede provocar la muerte del embrin (p.ej. virus de la encefalitis), producir
pstulas o placas sobre la membrana corioalantoidea (como herpes, viruela, vacuna),
desarrollar hemaglutininas en los lquidos o tejidos embrionarios (p.ej. influenza) o desarrollar
virus infectante por ejemplo poliovirus tipo 2. En el caso de los virus herpes y vaccinia, estos
se pueden cuantificar por la tcnica de inoculacin de huevos embrionados al correlacionar el
nmero de pstulas contadas con la dilucin viral inoculada.
Actualmente el mtodo preferido para cultivar virus de influenza aviar es la
inoculacin en huevos embrionados libres de patgenos especficos o huevos negativos a
anticuerpos especficos. El sobrenadante de los centrifugados de las muestras se inocula en el
saco alantoideo de al menos 5 huevos de 9-11 das de incubacin y se incuba a 35-37C
durante 4-7 das. Luego los huevos con embriones muertos, cuando esto ocurra, o los que
queden al final del periodo de incubacin se refrigeran a 4 C y el lquido alantoideo se
chequea con la prueba de hemaglutinacin. Si se detecta actividad de hemoaglutinatin hay
una probabilidad alta de la presencia de virus A de influenza o de un paramixovirus aviar. Los
fluidos que den reaccin negativa deben inocularse al menos en otro lote de huevos.

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OBJETIVOS

Conocer y aplicar correctamente los mtodos adecuados para realizar inoculaciones

de virus en embriones aviares.
Aislar correctamente los virus de la cavidad Alantoidea de la membrana
Corioalantoidea

Los huevos embrionados pueden ser utilizados para:

Diagnstico etiolgico por aislamiento directo,
Titulacin, estudio y conservacin de cepas
Deteccin y titulacin de anticuerpos antivirales
Produccin de antgenos diagnsticos
Produccin de vacunas, etc.
Como suministro de tejidos para la realizacin de cultivos celulares.

Los huevos utilizados para estudios virolgicos deben ser obtenidos de aves vigorosas, sanas,
libres de infecciones bacterianas o virales. La presencia de virus endgenos representa un
peligro potencial porque pueden interferir en la multiplicacin del agente inoculado o ser
llevados con los sucesivos pasajes junto con el virus que se trate aislar.

Las principales razones que llevan a utilizar huevos embrionados en estudios virolgicos
son:
Se pueden adquirir con facilidad
Son baratos
Tamao adecuado
No se forman anticuerpos contra el virus inyectado porque carecen de respuesta
inmune
El xito de la infeccin puede manifestarse como:
Muerte del embrin
Alteraciones macro y/o micropatolgicas
Formacin de cuerpos de inclusin
Presencia de depsitos de urea
Hemorragias sobre las membranas
Retraso del crecimiento embrionario
Engrosamiento -edematizacin-fibrosis de las membranas
Lesiones focales caractersticas (ej. virus varilico)
En algunos casos pueden no producirse manifestaciones visibles: en tal caso el xito de la
infeccin se manifiesta por la demostracin de antgenos especficos en los tejidos y en los
lquidos.

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Algunos de los factores que influyen sobre la multiplicacin del virus en el embrin de
pollo son:
Edad del embrin
Va de inoculacin
Dilucin y volumen del inculo
Temperatura y humedad de incubacin
Tiempo de incubacin
Antes de ser inoculados, los huevos deben ser incubados durante el tiempo ptimo para que
el embrin, las cavidades extraembrionarias y sus membranas posean el tamao necesario
segn la va de inoculacin a emplear.
Los virus que se inoculan en huevos embrionados, multiplican en las clulas de los tejidos y
rganos de los embriones y en las clulas de las membranas extraembrionarias. Cuando la
extraccin se realiza en el tiempo adecuado, los fluidos infectados y membranas proveen
una gran cantidad de material viral, relativamente libre de protenas extraas.
La va de inoculacin a seleccionar depender de la afinidad del virus por el tipo de clula
constituyente del embrin y sus membranas (origen endodrmico, mesodrmico,
ectodrmico). As por ejemplo los Poxvirus y Herpesvirus desarrollan mejor en la membrana
corioalantoidea (ectodermo-endodermo), los Mixovirus y Paramixovirus en la cavidad
alantoidea (endodermo), los Togavirus y los Rabdovirus en el saco vitelino (endodermo y
mesodermo), etc.

VIAS DE INOCULACIN:

Membrana corioalantoidea: se utilizan embriones de 10-12 das. Se inoculan con 0,1-0,5 ml.
Esta va es especialmente apropiada para aquellos virus que producen pstulas fcilmente
visibles. Ej: Poxvirus, Herpesvirus, Mixovirus, etc.
Cavidad alantoidea: se emplean embriones de 9-12 das. Se inoculan con 0,1-0,2 ml. Permite
cosechar grandes volmenes de material virulento. Es muy til para Mixovirus, Arbovirus,
Polio tipo III.
Cavidad amnitica: se pueden utilizar embriones de 7-15 das y se inocula con 0,1-0,2 ml.
Aqu se infecta la capa epitelial interna del amnios. la epidermis del embrin y las mucosas
altas de los aparatos respiratorios y digestivo. Esta va es muy adecuada para la
multiplicacin de Mixovirus especialmente para el aislamiento del virus de Influenza.
Saco Vitelino: se emplean embriones de 5-8 das de incubacin que se inoculan con 0,2-1 ml.
Es muy til para Mixovirus, Herpesvirus, Arbovirus, Virus rbico, etc.
Va intracerebral: puede practicarse en embriones de 8-14 das inoculando 0,01-0,02 ml .
Sirve para realizar estudios de lesiones intracerebrales pos-inoculacin. Se ha utilizado para
virus Influenza tipo A, Virus Rbico, Herpes, y virus encefalticos.
Va endovenosa: de muy poca aplicacin en virologa. Se utilizan embriones de 10-15 das
que se inoculan con 0,02-0,05 ml. Por esta va puede multiplicarse el virus de la fiebre aftosa.

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PROCEDIMIENTO

CUANTIFICACION DE VIRUS DE DIFTERIA VIRUELA

Marcar con un lpiz la cmara de aire, y la

posicin del embrin, con ayuda del ovoscopio.

Realizar dos orificios sin romper la membrana

coclear

Colocar una gota de solucin salina y aspirar

hasta que se forme la falsa cmara

Sellar el orificio e inocular 0.1mL el virus

10-1 10-2 10-3 C (-)

C (+)

Colocar en forma horizontal e incubar a 37C

mas humedad por 48 horas

AISLAMIENTO DE VIRUS POX VACCINE

Ubicar y marcar la cmara de aire y el ojo del

embrin

Realizar un orificio 5mm debajo de la cmara de

aire e inocular 0.1mL

Virus puro C (+)

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Procedimiento:

1.

2.

3.

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4.

5.

Pstula
s

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Tabla de resultados

Virus VIRUS DE VIRUS POX

DIFTERIA VACCINE
VIRUELA
dilucin
10-1
10-2
10-3

DISCUSION DE RESULTADOS

BLA BLA BLA.. BLABLA

La formacin de pstulas se focaliza en regiones de alta irrigacin sangunea que
permite un desarrollo y diseminacin rpido del virus, en estas pstulas, que se pueden
observar con estereoscopios, se acumulan partculas virales que forman inclusiones
intracitoplasmticas denominadas cuerpos de Bollinger; a su vez estos cuerpos de
inclusin estn formados por cuerpos de Borrel que son en s las partculas
elementales virales.

CONCLUSIONES

El conteo total de las pstulas de la membrana corioalantoidea puede ser determinante

para la determinacin de la dosis letal.
En el caso de la prctica realizada no se pudo determinar esta, (Jos aqu creo que
deberamos poner sobre que no se incubo a la temperatura adecuada
por eso los embriones murieron y no se obtuvo el resultado que se
esperaba).

REFERENCIA BIBLIOGRFICA

Petruccelli Miguel A. 2006. Catedra de patologia de aves y piliferos. Universidad

Nacional de la Plata.

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