Siembra y tinción de hongos y

bacterias
Stefania Valencia Moreno

Resumen
Las técnicas de siembra y tinción de microorganismos son ampliamente utilizadas ya que
permiten la propagación controlada y la identificación de ciertas características de los
microorganismos. Las técnicas de siembra, varían dependiendo de la necesidad del
microorganismo y del objetivo que se desee alcanzar. En todos los casos, los medios de
cultivo que se emplean en cada técnica, proporcionan un ambiente adecuado para el
crecimiento de los microrganismos. En esta práctica, realizamos la siembra por agotamiento
de tres especies de bacteria y la siembra masiva de una de ellas. La siembra por agotamiento
nos permite obtener cultivos axénicos (Que se desarrolla en un ambiente donde no hay
ningún otro organismo vivo). Las bacterias que se sembraron, fueron más tarde observadas
bajo el microscopio óptico gracias a la tinción de Gram. La tinción de Gram permite teñir las
bacterias de tal modo que se pueda observar con mayor claridad la morfología de las
mismas.

Palabras clave
Agar nutritivo, Bacillus cereus, Escherichia coli, Gram positiva, Gram negativa,
Staphylococcus aureus, siembra masiva, siembra por agotamiento, tinción.

1. Introducción
El análisis y la propagación controlada de microorganismos en el laboratorio, es una práctica
fundamental para un gran número de actividades tales como la producción de alimentos,
el estudio y diagnóstico de enfermedades, la investigación, etc. El cultivo y análisis de
microorganismos en el laboratorio se hace posible gracias a un conjunto de actividades bien
definidas entre las que destacaremos las técnicas de siembra y tinción.
En esta práctica se realizó la siembra por agotamiento de tres especies de bacteria (B.
cereus, E. coli, S. aureus), la siembra masiva de B. cereus y la siembra de un hongo
ascomiceto del género Xylaria. Las técnicas de siembra varían entre ellas según el
microorganismo y el objetivo específico que se desee alcanzar. Sin embargo, todas las
técnicas comparten el mismo principio: introducir artificialmente una porción de muestra
(inóculo) en un medio adecuado que les proporcione las condiciones adecuadas para su
desarrollo y multiplicación.
En este laboratorio se llevo a cabo la siembra de las siguientes especies:

• Staphylococcus aureus
S. aureus es una bacteria Gram positiva, que hace parte de la flora normal de los seres
humanos encontrándose principalmente en la piel y otras zonas del cuerpo. Sin embargo,
este patógeno se caracteriza también por ser el causante de infecciones en el torrente
circulatorio (BSI) e intoxicaciones ocasionadas por alimentos (ETA). S. aureus tiene un
tiempo de generación de aproximadamente 30 minutos. Crece entre los 7 - 47,8 °C,
teniendo su óptimo de crecimiento en 35 °C. Con respecto al pH, su intervalo de crecimiento
se encuentra entre 4,5 y 9,3. [1]

• Escherichia coli
Escherichia coli (E. coli) es una bacteria miembro de la familia de las enterobacterias que
habita normalmente en el intestino del ser humano y de los animales de sangre caliente. Es
un bacilo gramnegativo, anaerobio facultativo, cuya temperatura de crecimiento
preferente es a (35-43 °C). [2] La mayoría de las cepas de E. coli son inocuas, pero algunas
pueden causar graves intoxicaciones alimentarias. [3] El tiempo de generación de E. coli
puede ser tan corto como de 15 a 20 minutos.

• Bacillus cereus
La bacteria B. cereus es Gram positiva y se caracteriza por la formación de esporas
resistentes a altas temperaturas. B. cereus tiene una temperatura optima de crecimiento
de 28 – 35°C, su tiempo de generación es de 18 – 27 min, crece en un amplio rango de pH
4.9 – 9.3 y resiste una concentración de sal de hasta el 7.5%. Esta bacteria habita
normalmente en la tierra, por lo tanto, se transmite fácilmente a los alimentos [4]. La
intoxicación alimentaria causada por B. cereus se da en función a una combinación de
toxinas producidas por la bacteria y al estado de salud del huésped.
Las técnicas de siembra dieron paso a la tinción de los microorganismos para llevar a cabo
la observación de los mismos por medio del microscopio óptico.
La tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su entorno.
En microbiología existen diferentes métodos de tinción entre los que destaca, la tinción de
Gram; una prueba que proporciona información sobre la forma, tamaño y agrupación
celular de las bacterias.
La tinción de Gram es un tipo de tinción diferencial propuesta por el medico danés Christian
Gram (1884) quien, trabajando con el tejido pulmonar de los fallecidos por neumonía,
observó que la bacteria Streptococcus pneumoniae presente es estos tejidos, retenía el
colorante (marrón Bismark) mientras que el tejido pulmonar no. [5]
Según la estructura y organización de la pared celular, la tinción de Gram clasifica en dos
grupos a las bacterias: Gram positivas y Gram negativas. Los microorganismos Gram
positivos, mantienen y conservan el complejo cristal violeta-iodo, debido a la presencia de
una gruesa capa de péptidoglucano con abundantes entrecruzamientos en la membrana
externa de su pared celular. Las bacterias Gram negativas, tienen una delgada capa de
peptidoglucano y una alta concentración de lípidos que incrementan la porosidad en la
membrana externa de su pared celular. Por esto, se decoloran rápidamente con la
aplicación del alcohol, admitiendo el colorante de contraste que proporciona un color entre
rosa y rojo.

2. Materiales y métodos

2.2 Siembra por agotamiento de B. cereus, E. coli, S. aureus

Se esterilizo el asa antes de tomar una pequeña muestra de bacteria y de distribuirla
en cuatro áreas consecutivas del medio de cultivo (Agar Nutritivo). El asa se
esterilizó entre áreas para agotar la disponibilidad de bacteria.

2.3 Siembra masiva de B. cereus

Se vertió una gota de bacteria (en medio líquido), en la mitad del medio de cultivo
sólido (Agar Nutritivo) y con ayuda de un asa de Drigalsky se extendió el inóculo
hasta su absorción total.

2.4 Siembra de Xylaria.

Se tomo un cuadro de 1x1cm de Xylaria y se depositó sobre el nuevo medio de
cultivo (Agar nutritivo), asegurándose de que el hongo estuviera en contacto directo
con el nuevo medio de cultivo.
2.5 Tinción de Gram
Frotis: Inicialmente se depositó una pequeña gota de agua sobre el portaobjetos
para extender la muestra con ayuda del asa.
Fijación: Terminado el frotis, se secó la muestra con ayuda del mechero. La fijación
por calor preserva la morfología externa de los microorganismos, pero no las
estructuras internas.
Tinción: Cuando estuvo seca la muestra, se agregaron unas gotas de cristal violeta
sobre su superficie, dejando actuar este colorante por 1min. Pasado el minuto, se
enjuago con agua. Seguidamente, se dejo caer unas gotas de Lugol sobre la muestra
dejándolo actuar por 1min y enjuagando nuevamente. Después del paso anterior,
se dejaron caer unas gotas de alcohol-acetona sobre la muestra dejándolo actuar
por tan solo 30seg y enjuagando de nuevo. Finalmente se agregan unas gotas de
safranina dejando actuar por 1min para posteriormente volver a enjuagar y
finalmente secar con ayuda del mechero.

2.6 Tinción de Hongos

Para empezar, se dejó caer una gota de azul de metileno sobre un portaobjetos.
Seguidamente se deposito el micelio del hongo sobre la gota de colorante, haciendo
movimientos suaves con el asa para abrir y desenredar el micelio. Finalmente se
dejo caer un cubreobjetos sobre la muestra.

3. Resultados
3.1 Siembra por agotamiento
Se observo crecimiento bacteriano en los tres cultivos:

S. aureus
La siembra por agotamiento de esta bacteria nos permite
observar la formación de UFC bastantes grandes. Se
evidencia igualmente como se arrastro gran parte de la
bacteria desde el area 1 hasta el area 2 y 3.

E. coli
La siembra por agotamiento de E. coli nos permite observar
la formación de unidades formadoras de colonia bien
definidas en el área 4.

B. cereus
La siembra por agotamiento de esta bacteria no nos permite
observar las líneas de siembra que se dibujaron en cada área
ni tampoco las unidades formadoras de colonia.

3.2 Siembra masiva

Se observo crecimiento bacteriano
3.3 Tinción de gram

3.4 Observación de las baterías en el microscopio óptico

S. aureus
Se observa la tinción Gram positiva
pero no se logra visualizar la forma
de las bacterias.
 E. coli
No fue posible distringuir la
forma y la tinción de esta
bacteria con seguridad

B. sereus
Se puede observar con claridad su
tinción Gram positiva y su forma de
bacilos con esporas. Las esporas de
estos microorganismos no se tiñen
de color morado y son facilemnete
detectables en el lente X100 del
miscrocopio.

3.5 Observación de Xylaria

Se pudo observar el micelio del hongo: una red de

estructuras celulares filamentosas en quitina.
4. Discusión
Se llevo a cabo la comparación de las observaciones realizadas en el microscopio con otros
compañeros para evaluar la morfología y la tinción de las bacterias analizadas. Debido a
que no se obtuvieron resultados favorables en la tinción de Gram para las bacterias
evaluadas, se observó la muestra de otro compañero:

S. aureus
En esta muestra si es posible observar su forma
de coco y su tinción Gram positiva. Se les puede
observar agrupados en cadenas, solos,
emparejados y en racimos. Según la literatura,
su tamaño oscila entre 0,8 a 1,5 micras de
diámetro. Debido a que no tienen estructuras
especializadas, son inmóviles. [6]

E-coli
Se realizó la observación de otra muestra de E-
coli perteneciente a una compañera. En esta
muestra si podemos observar con claridad la
tinción Gram negativa de la bacteria, aunque
no se logre percibir con claridad la forma de
bacilos.
 B. sereus
Las esporas de esta bacteria les
confieren resistencia a altas
temperaturas al mismo tiempo que
les permite diferenciarlos de las
otras especies similares a este. [4]

5. Discusión
[1] “Staphylococcus aureus en la industria alimentaria.”
https://www.betelgeux.es/blog/2015/07/09/staphylococcus-aureus-en-la-
industria-alimentaria/ (accessed Mar. 19, 2022).
[2] “Escherichia Coli: características, patogenicidad y prevención (I).”
https://www.betelgeux.es/blog/2016/01/19/escherichia-coli-caracteristicas-
patogenicidad-y-prevencion-i/ (accessed Mar. 19, 2022).
[3] “E. coli.” https://www.who.int/es/news-room/fact-sheets/detail/e-coli (accessed
Mar. 19, 2022).
[4] “Encyclopedia of Food Microbiology - Google Libros.”
https://books.google.com.co/books?hl=es&lr=&id=1b1CAgAAQBAJ&oi=fnd&pg=PA
124&dq=B-cereus&ots=mAJ1ikWB07&sig=pem9MjKUL9NoIJQ-
qMpabMddOfw&redir_esc=y#v=onepage&q=B-cereus&f=false (accessed Mar. 20,
2022).
[5] “Técnicas básicas de Microbiología. Observación de bacterias. | Vázquez | REDUCA
(Biología).” http://revistareduca.es/index.php/biologia/article/view/819 (accessed
Mar. 19, 2022).
[6] “D D DATABiO Staphylococcus aureus”.