TINCIÓN DE GRAM Y ESPORAS

Herrera-Cruz Edwin
Zootecnista, Estudiante M.Sc. Biotecnología. Grupo de Investigación en Peces Nativos (GIPEN), Piscícola
San Silvestre S.A. Barrancabermeja Colombia. edwinherreracruz@gmail.com

Oviedo-Montiel Harold
Profesional en Acuicultura, Estudiante M.Sc. Biotecnología. Grupo de Investigación en Peces Nativos
(GIPEN), Piscícola San Silvestre S.A., Barrancabermeja Colombia. harold1794@gmail.com

RESUMEN

La tinción de Gram es una técnica fundamental en la caracterización e identificación de

bacterias y sus estructuras. Por lo anterior, esta práctica tuvo como objetivo principal
adquirir destrezas y habilidades en el desarrollo y fundamentación de las técnicas de tinción
de Gram y tinción de esporas. Al finalizar la práctica, se logró identificar células Gram
positivas y Gram negativas, así como identificación de las bacterias como bacilos y
endosporas sub-terminales en el mismo tipo de bacterias.
Palabras claves: Gram+, Gram-, Bacillus endosporados, Endosporas sub-terminales.

ABSTRACT

Gram staining is a fundamental technique in the characterization and identification of

bacteria and their structures. Therefore, the main objective of this practice was to acquire
skills and abilities in the development and foundation of Gram stain and spore staining
techniques. At the end of the practice, it was possible to identify Gram-positive and Gram-
negative cells, as well as identification of the bacteria as bacilli and sub-terminal
endospores in the same type of bacteria.
Key words: Gram +, Gram-, Endosporate Bacillus, sub-terminal endospores.

1. INTRODUCCIÓN

Desde el comienzo de la bacteriología, la coloración de Gram se ha considerado una

herramienta fundamental para la identificación bacteriana. Ideada por Hans Christian
Joachim Gram, la utilidad de la técnica se hizo evidente años después de su publicación,
hasta que, en 1889, se recomienda someter a todos los cultivos a la tinción de Gram, como
primera orientación diagnóstica. Hoy en día la coloración de Gram es una de los pilares del
diagnóstico temprano de las infecciones bacterianas (Morales, 2013).

El conocimiento de las estructuras de las membranas bacterianas, en cuanto al aspecto

físico y su composición molecular demostraron que la coloración de Gram distingue dos
grupos de bacterias muy diferentes. Las bacterias Gram positivas que presentan una gruesa

Maestría en Biotecnología, Universidad de Córdoba. Práctica de Laboratorio de Microbiología. Julio (2019).

 Oviedo-Montiel & Herrera-Cruz, (2019).

capa de peptidoglicano, y las Gram negativas con una delgada capa, a la que se le
superpone una capa de lipopolisacárido-lipoproteína, denominada membrana externa. La
presencia de esta membrana, marca la diferencia entre las bacterias Gram negativas y las
Gram positivas carentes de dicha estructura (Jiménez & Vélez, 2012).

Además de caracterizar el tipo de células de acuerdo a las capas lipídicas que la conforman,
la tinción de Gram también permite observar y caracterizar otro tipo de estructuras como
las esporas bacterianas o fúngicas (López-Jácome et al., 2014). Algunas bacterias son
capaces de formar endosporas que les permiten sobrevivir en ambientes desfavorables
(altas temperaturas, desecación, radiaciones ultravioletas, gamma y agentes químicos),
durante largos periodos de tiempo (Zubaidah & Elok, 2006). Las endosporas bacterianas se
originan en el interior de los microorganismos. Varios géneros son capaces de producir
estas estructuras, entre ellos: Clostridium, Bacillus, Sporosarcina. La mayoría de las
endosporas presentan una disposición central o subterminal. En el caso de Clostridium
tetani, produce una espora terminal más grande que el diámetro de la bacteria (espora
deformante) dando lugar a una espora que se reconoce fácilmente conocida como “palillo
de tambor”.

Debido a la gruesa pared celular, las esporas no se tiñen con las coloraciones
convencionales. La compleja composición de las esporas impide la entrada de la mayoría
de los colorantes. Si se estudia la espora de afuera hacia dentro se observan las siguientes
capas: en primer lugar está el exosporium, que es la capa más fina y externa formada por
glicoproteínas; luego viene la cutícula, que brinda resistencia a las altas temperaturas,
seguida de la corteza compuesta por peptidoglicano. Posteriormente está la pared de la base
que protege al protoplasto (Oktari et al., 2017).

Por lo anterior, la tinción de esporas bacterianas suele ser desarrollada por dos métodos
tradicionales. El método de Schaeffer Fulton y el método de Klein. La diferencia de estos
dos métodos es el tinte utilizado. En el primero, los colorantes utilizados son Verde de
Malaquita y Safranina, mientras que en el método de Klein se utiliza colorante Fucsina y
Azul Metileno. El método Schaeffer Fulton es el método más utilizado, debido a que el
tiempo de tinción es menor (López-Jácome et al., 2014).

La tinción Schaeffer Fulton, que usa una solución alcalina con pH de 11,2, junto con el
tinte verde de malaquita y la safranina puede funcionar bien en bacterias debido a la
alcalinidad (componente cromofórico positivamente cargado), mientras que el citoplasma
bacteriano es basófilo, por lo cual las bacterias puedan absorber bien los colorantes (Volk
& Wheeler, 2009).
 Oviedo-Montiel & Herrera-Cruz, (2019).

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Obtención del material biológico.

La práctica de laboratorio se realizó en el Laboratorio de Biotecnología del departamento

de Química (GRUBIODEQ) de la Universidad de Córdoba. Los cultivos bacterianos fueron
suministrados por el laboratorio donde previamente se incubaron durante 24 horas en medio
líquido enriquecido y mantenidos a temperatura ambiente del laboratorio (28 a 32 °C) y luz
indirecta intermitente.

2.2. Preparación de frotis.

Una pequeña cantidad de cultivo bacteriano en medio sólido, fue transferido a una gota de
agua dispuesta sobre un portaobjetos con ayuda de un asa de siembra previamente
esterilizada bajo la flama de un mechero. La mezcla se removió con el asa hasta formar una
suspensión homogénea y extendida para facilitar su secado. El portaobjetos fue flameado
en un mechero hasta que la fase líquida se evaporó, cuidando de no calentar demasiado la
muestra.

2.3.Tinción de Gram.

Posteriormente, se procedió a realizar la tinción de la siguiente manera: 1) Se tiño con

cristal violeta por 1 minuto y se lavó el exceso del colorante con abundante agua, 2) Se
cubrió con lugol durante 1 minuto y se lavó, 3) Se realizó decoloración con alcohol-acetona
durante 10 segundos y se lavó con abundante agua para eliminar el resto del solvente, 4) se
tiño con safranina por 30 segundos e inmediatamente se lavado, 5) la preparación se dejó
secar y 6) se examinó al microscopio con aceite de inmersión en objetivo de 100x.

2.4.Tinción de Esporas.

La muestra fue preparada de acuerdo al procedimiento descrito en el inciso 2.1. La tinción

se realizó como sigue: 1) La muestra se tiñó con verde malaquita y se colocó durante 5
minutos sobre la llama de un mechero para humear el colorante sin dejar hervir la fase
liquida y se añadió más colorante cuando la muestra se secó por completo. 2) Se lavó el
resto del colorante con abundante agua, 3) se tiñó durante 1 minuto con safranina y se lavó,
5) la preparación se dejó secar y, por último, 6) se observó al microscopio.

3. RESULTADOS

3.1. Tinción de Gram.

La prueba de tinción de Gram, permitió identificar el tipo de células bacterianas

proporcionadas por el Laboratorio GRUBIODEQ. En la figura 1, se observan bacillos
 Oviedo-Montiel & Herrera-Cruz, (2019).

Gram positivo endosporados de gran tamaño. En la figura 2, se observan bacillos Gram

negativos de pequeño tamaño.

Figura 1. Bacillos Gram positivos endosporados. Figura 2. Bacillos Gram negativos.

3.2. Tinción de Esporas.

En la figura 3, se observan bacillos Gram positivos con endosporas en posición subterminal

(coloración verdosa), algunas con hinchamiento de las células en la zona donde se
encuentra la espora. Las células son alargadas, y en algunas se observa una división
asimétrica.

Figura 3. Bacillos Gram positivos endosporados.

 Oviedo-Montiel & Herrera-Cruz, (2019).

4. DISCUSIÓN

4.1. Tinción de Gram.

En la figura 1, se observan bacterias teñidas de color violeta (color característico de

bacterias positivas a la tinción Gram). En el proceso de identificación de microorganismos
hay que tener unas consideraciones generales; primero, no siempre se puede detectar un
microorganismo mediante el cultivo. Un estudio mostró que hasta el 10% de las
endocarditis negativas, tanto en hemocultivos como en Gram convencional, son positivas
para Gram de tejido (Morris et al., 2003); esto puede suceder por uso previo de antibióticos
o por la presencia de un microorganismo inusual que sí se puede ver en el Gram de tejido
(Wilck et al., 2001). Segundo, el organismo aislado se debe correlacionar con una respuesta
del huésped frente a éste (Fartoukh et al., 2003). Tercero, no todos los microorganismos
crecen en los medios habituales (Jiménez y Vélez 2012). En la figura 2, se observan
bacterias pequeñas en magnificación 100x las cuales generaron una coloración rosado tenue
que concuerda en su totalidad con bacilos Gram negativos.

4.2. Tinción de Esporas.

Como se mencionó previamente, el verde de malaquita es un componente alcalino

(componente cromóforo cargado positivamente), mientras que el citoplasma bacteriano es
basófilo, por lo que hay una atracción entre los componentes del cromóforo en un tinte con
células bacterianas, ya que las bacterias pueden absorber bien los tintes (López-Jácome et
al., 2014). El calor modifica la permeabilidad de la endospora y permite la entrada del
colorante a través de las capas externas de la endospora. A continuación, el lavado con
abundante agua produce la decoloración de las formas vegetativas, así como de los
extremos de las bacterias esporuladas, que se tiñen por último con un colorante de
contraste; la safranina (López-Jácome et al., 2014). De esa manera se logra identificar la
presencia de endospora de color verde, dentro de la bacteria, tal como se observa en la
figura 3.

Con los resultados y la experiencia en el desarrollo del siguiente laboratorio, se logró

adquirir la destreza en el procedimiento y conocimiento de fundamentos sobre los tipos de
tinción, las características celulares y las estructuras que se pueden visualizar con la ayuda
del método de tinción.

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