Práctica No.

10
AISLAMIENTO Y SEPARACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Modificación a modalidad virtual, primer semestre, 2022

GUÍA GENERAL DE LA PRÁCTICA EN MODALIDAD VIRTUAL

Actividad Descripción Fecha

Estudio del tema Los estudiantes deberán: Previo a iniciar
Leer y analizar críticamente el documento: la práctica de
• «Práctica No 10 «Aislamiento y separación de laboratorio,
ácidos nucleicos». semana del 18
al 22 de abril.

Los estudiantes deberán realizar un pre-laboratorio

Elaboración y que incluye: A más tardar 5
entrega del pre- ● Diagrama de flujo del experimento descrito en el minutos antes
laboratorio instructivo de la práctica. del inicio de la
● Resolución del cuestionario que se presenta al final práctica.
del instructivo.

El pre-laboratorio se elabora de forma INDIVIDUAL y

se entrega como PDF a través de la plataforma
Moodle del Laboratorio PREVIO A INICIAR LA
PRÁCTICA.
Exámenes cortos Examen pre-laboratorio: se realizará durante los Examen pre:
primeros 15 minutos del período de laboratorio. Se
evaluará las bases teóricas de la práctica (instructivo y Semana del 18
anexos). al 22 de abril.
Examen post-laboratorio: consistirá en la elaboración
de un podcast relacionado con el tema. Las Examen post,
instrucciones para la elaboración del podcast serán entrega del
publicadas en la semana del 18 al 22 de abril. podcast semana
NOTA: Encender las cámaras en una reunión Zoom del 25 al 29 de
para realizar los exámenes cortos. abril
Explicación de los Los instructores de laboratorio brindarán, usando Día de la
fundamentos presentación PowerPoint y videos, una explicación de práctica
teóricos y los aspectos teóricos y prácticos de métodos de
procedimiento de extracción de ácidos nucleicos, especialmente del Semana del 18
la práctica, método empleado en el laboratorio. Posteriormente al 22 de abril.
análisis de explicarán el procedimiento a realizar durante la
resultados y práctica, la forma de analizar los resultados y la forma
forma de de reportarlos. Se resolverán dudas de los
reportarlos. estudiantes.
«Evaluaciones en Durante el desarrollo de la práctica, los estudiantes Durante la
tiempo real» deberán ir respondiendo evaluaciones en formularios práctica semana
de Google. Al responderlas, también estarán del 18 al 22 de
registrando su asistencia. abril.
Material de apoyo Extracción casera ácidos nucleicos IMPORTANTE:
https://youtu.be/JofXXyFZn38 Se recomienda
revisen el
Generalidades de ácidos nucleicos material de
https://youtu.be/MA-ouz1LtpM apoyo
previamente a
¿Qué información acerca de nuestros ancestros nos la práctica.
proporciona una prueba de ADN?
https://youtu.be/YiydsMxOdM8

Foro de preguntas Los estudiantes pueden hacer preguntas sobre la Semana previa a
práctica en el «Foro de discusión» en la plataforma la práctica
Moodle. El foro se habilitará durante la semana previa
a la práctica, y los instructores de laboratorio Semana del 4 al
responderán las preguntas en los días hábiles de la 8 de abril.
semana previa a la práctica.
Reporte de Cada grupo de laboratorio realizará un reporte escrito Semana
laboratorio: las instrucciones del instructivo correspondiente que posterior a la
encuentra en el portal Moodle - Laboratorio de práctica
Reporte escrito Bioquímica I. El reporte deberá ser entregado una
grupal semana después de realizada la práctica. Se habilitará Semana del 25
un apartado por día y sección de laboratorio para su al 29 de abril, a
entrega en la plataforma Moodle. más tardar 5
minutos antes
del inicio de
laboratorio.

PONDERACIÓN DE LA PRÁCTICA
Actividad Punteo por Punteo total Porcentaje de la
práctica de laboratorio nota de
laboratorio
sobre la zona
total del curso
Examen corto pre práctica 0.40 p 4.5 p
Examen corto post práctica 0.40 p 4.5 p
“Evaluación en tiempo real” 0.30 p 3.0 p
Reporte 0.40 p 4.5 p
20%
Pre-laboratorio (diagramas de flujo y 0.25 p 1.0 p
cuestionarios)
Examen final de laboratorio - 2.5 p
Total 1.75 p 20 p
Individual
Grupo de laboratorio
INTRODUCCIÓN

Los ácidos nucleicos, ADN o ácido desoxirribonucleico y ARN o ácido ribonucleico, son
las biomoléculas que contienen y almacenan la información genética de un organismo (ADN),
así como también, son responsables de la expresión de dicha información genética y su
regulación (ARN), además se reconoce la existencia de moléculas de ARN con actividades
catalíticas, las ribozimas. La existencia de virus con genoma ARN ha permitido demostrar que
esta molécula también posee la capacidad de almacenar y transmitir información genética
(Nelson & Cox, 2013).

Los ácidos nucleicos están compuestos de nucleótidos, que corresponden a las

unidades monoméricas que los conforman, conteniendo cada nucleótido una base
nitrogenada, un azúcar de 5 carbonos o pentosa (2 deoxirribosa y ribosa, respectivamente) y
uno o más grupos fosfato (Nelson & Cox, 2013). En la figura 1 se muestra la representación
básica de un nucleótido.

Las bases nitrogenadas que componen a los ácidos nucleicos son derivados de dos
tipos de compuestos: purinas y pirimidinas; distinguiéndose dos tipos de purinas (adenina, A y
guanina, G) y tres tipos de pirimidinas (citocina, C, timina, T y uracilo U), como bases
nitrogenadas principales o mayoritarias. Las bases nitrogenadas A, G y C se encuentran
presentes de manera regular tanto en ADN como en ARN, sin embargo, de las dos restantes, T
se encuentra presente en ADN y U, en ARN (Ferrier, 2017, Nelson & Cox, 2013). Existen,
además, bases nitrogenadas que se encuentran presentes en proporciones minoritarias,
algunas de ellas derivadas de modificaciones químicas de las bases principales; las bases
nitrogenadas minoritarias cumplen funciones específicas en los ácidos nucleicos, por ejemplo,
le presencia de inosina en algunos ARN de transferencia (ARNt), se asocia a su capacidad de
reconocimiento de codones específicos (Nelson & Cox, 2013). En la figura 2 se muestran las
bases nitrogenadas y los componentes básicos que los conforman.

Figura 1. Estructura básica de un nucleótido: el C2 de la pentosa (azul), carece de grupo

hidroxilo en los desoxirribonucleótidos que conforman el ADN.
Imagen modificada a partir de la imagen de FreeCliparts en Pixabay
 En cuanto a la organización de los ácidos nucleicos, el ADN cumple sus funciones en
forma de doble cadena (dos polímeros lineales enfrentados según el apareamiento específico y
complementario de las bases nitrogenadas, con un patrón de enrollamiento helicoidal
dextrógiro característico), por esta razón, frecuentemente se hace referencia al tamaño de las
moléculas de ADN considerando pares de bases (pb). Por aparte, las moléculas de ARN
cumplen su función, generalmente, en forma de hebra simple (un solo polímero lineal con
patrones de plegamiento específicos determinados por la identidad de sus nucleótidos).
Ambos tipos de ácidos nucleicos interactúan con proteínas para cumplir su función (Nelson &
Cox, 2013).

Figura 2. Bases nitrogenadas y componentes de nucleótidos.

Fuente: Alejandro Porto, CC BY-SA 4.0 <https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0>, vía
Wikimedia Commons
Página: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Componentes_nucleotidos.png
 El aislamiento de los ácidos nucleicos es una de las técnicas básicas necesarias para el
estudio de este tipo de biomoléculas y se basa en sus características químicas, tamaño y
organización molecular, su ubicación celular (eucariotas), entre otras características,
permitiendo así el aislamiento del total de ácidos nucleicos presentes en una muestra o un tipo
específico de éstos (ADN total, ADN plasmídico, ARN total, entre otros). Los métodos para
extracción de ácidos nucleicos varían mucho y ofrecen diferencias en cuanto al grado de pureza
y calidad del material extraído, sin embargo, todos parten de principios generales básicos.

Una vez los ácidos nucleicos han sido extraídos, la separación electroforética de los
mismos permite visualizar de forma macro la calidad de la extracción y permite, de manera
general determinar el contenido de ácidos nucleicos en la muestra, estimar su concentración y
grado de pureza. La electroforesis de ácidos nucleicos se realiza generalmente en geles de
agarosa, pero puede realizarse también en geles de poliacrilamida; teniendo cada tipo de gel
un propósito específico, así como alcances y limitaciones propias. La electroforesis en geles de
agarosa permite separar fragmentos de ADN con diferencias de tamaño superiores a 50 pares
de bases (pb), por lo que se considera que su poder de resolución es bajo, pero puede separar
moléculas de un amplio rango de tamaño (desde 50 pb hasta 40,000 pb). La electroforesis de
ácidos nucleicos con poliacrilamida pose un mayor poder de resolución, permitiendo separar
moléculas que solo difieren en un pb, sin embargo, posee un rango más estrecho de
fragmentos que puede separar (5 a 600 pb), (Fierro, s. f.).

La electroforesis permite la migración de las moléculas de ácidos nucleicos, a través de

un gel poroso, por acción de un campo eléctrico, permitiendo su separación de acuerdo con su
tamaño, peso molecular y forma (o conformación), o punto isoeléctrico (Nelson y Cox, 2013;
Yabar et al., 2003). La movilidad de las partículas está determinada de forma proporcional al
voltaje aplicado y la carga neta de la molécula y de forma inversamente proporcional a la
fricción de la molécula; esta última depende de la forma y el tamaño de esta. La relación entre
estas variables está representada en la siguiente ecuación:

Movilidad de la molécula = (voltaje aplicado) (carga neta de la molécula)

Fricción de la molécula (forma y tamaño)

Durante una electroforesis el voltaje se mantiene constante por lo que la movilidad de

la molécula dependerá de su carga, forma y tamaño: a mayor carga neta, la molécula migrará
más rápido; a su vez, a mayor fricción, la movilidad será menor (Nelson y Cox, 2013).

En una electroforesis de ácidos nucleicos, la carga negativa de los mismos promoverá

su migración al ánodo, esto es debido a la carga negativa presente en el esqueleto azúcar-
fosfato. En los fragmentos de ADN dobles (con estructura de doble hélice) la velocidad de
migración es proporcional a su tamaño (García, s.f.).

Cuando se ha completado la electroforesis, las moléculas más pequeñas han llegado al

ánodo, entonces se pueden revelar mediante la adición de un colorante específico para
hacerlas visibles. Para el efecto, se emplean compuestos como el bromuro de etidio,
colorantes del grupo de las cianinas (SYBR® Green, SYBR® Gold), GelRedTM, entre otros; los
cuales interactúan con los ácidos nucleicos presentes en el gel de electroforesis y al ser
enfrentados a una fuente de luz UV de longitud de onda adecuada, emiten una señal
fluorescente, permitiendo así visualizar los ácidos nucleicos y su desplazamiento en la
electroforesis (Bernhagen, et al, 2004, Biotium, s.f., Nelson y Cox, 2013).

Para estimar el tamaño de los fragmentos de ácidos nucleicos separados por

electroforesis se emplean «marcadores de peso molecular» que consisten en una mezcla de
fragmentos de ADN moléculas de tamaño conocido (en pb). Al realizar la electroforesis, el
marcador de peso molecular se analiza en un pozo específico, en conjunto con las muestras, la
migración de las bandas del marcador se compara con la migración de las bandas de las
muestras para determinar su tamaño. La distancia a la que se encuentra la banda del pozo en
el que fue colocada la muestra es (aproximadamente) inversamente proporcional al logaritmo
del tamaño de la molécula (Nelson y Cox, 2013).

Es importante señalar que la electroforesis en asociación con otras técnicas tales como
PCR, e hibridación, corresponde a las técnicas fundamentes de uso en la Biología Molecular,
Genética, Bioquímica, entre otras ciencias, y brinda una gran ayuda en el campo de la salud
(Nelson y Cox, 2013; Yabar et al., 2003).

En la presente práctica de laboratorio los estudiantes realizarán una extracción casera

de ADN a partir de fuentes diversas, realizarán una electroforesis virtual empleando un
simulador y analizarán el resultado de una electroforesis de ADN a partir de la fotografía de un
gel de agarosa. Los resultados de estas actividades serán organizados en un reporte escrito.

OBJETIVOS
Al finalizar la práctica, el estudiante estará en capacidad de:

• Realizar una extracción de ADN empleando un método casero.

• Explicar el principio de la electroforesis de ácidos nucleicos.
• Interpretar los resultados de una electroforesis de ácidos nucleicos y estimar el
tamaño de los fragmentos de ADN separados por comparación con un marcador de
peso molecular.

PROCEDIMIENTO

1. Extracción de ADN

Equipo
• Licuadora
• Colador
• Cucharas medidoras
• Tazas medidoras
• Vasos pequeños (o recipientes pequeños plásticos, transparentes; buscar que el
recipiente sea lo más angosto posible)
• Palillos de madera (idealmente palillos largos)
• Cuchara o paleta

Materiales (reactivos)
• Material biológico para extracción de ADN: emplear una de las siguientes opciones:
o Arvejas
o Hojas de espinaca cortadas en trozos
o Fresas
o Hígado de res o de pollo
• Sal
• Agua fría
• Detergente líquido (de ropa o de platos)
• Ablandador de carne (o jugo fresco de piña)
• Alcohol al 70% (etanol o isopropanol)
Procedimiento
a. Colocar en la licuadora ½ taza de material biológico, 1/8 de cucharadita de sal y 1 taza
de agua fría. Licuar por 15 a 20 segundos a la máxima velocidad.
b. Colar el material obtenido en un nuevo recipiente.
c. Al material colado (mezcla) agregarle 2 cucharadas de detergente líquido, mezclar bien
con una cuchara o paleta y dejar reposar por 5 a 10 minutos.
d. Trasvasar la mezcla a un vaso pequeño, llenándolo hasta 1/3 de su capacidad.
e. Agregar una pizca de ablandador de carne (o unas gotas de jugo de piña fresco),
mezclar suavemente y dejar reposar un minuto.
f. Inclinar el tubo y verter lentamente, por las paredes, alcohol al 70%, observar que el
alcohol forma una capa sobre la mezcla. Agregar un volumen de alcohol igual al
volumen de mezcla agregado inicialmente.
g. En la interfase mezcla – alcohol, buscar la presencia de material fibroso blanco,
retirarlo con la ayuda de un palillo de madera. Este material corresponde al ADN
extraído.
h. Trasladar el ADN a un recipiente pequeño con alcohol (tapado) y almacenar a -20°C (si
se desea conservar el ADN extraído).
i. Documentar cada paso de la práctica con una fotografía y completar la tabla 1.

Referencia
Adaptado de: How to extract DNA from Anything Living. Recuperado de:
https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/howto/

2. Electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa

Procedimiento
a. Ingrese al enlace que será informado por su auxiliar durante la práctica.
b. Con su grupo de trabajo repase cada uno de los aspectos teóricos planteados.
c. Realice el tutorial que se presenta en el enlace.
d. Documente la realización del tutorial por medio de fotografías y completar la tabla 2.

3. Análisis de una electroforesis de agarosa (ácidos nucleicos)

Procedimiento
a. Cada grupo recibirá la fotografía de una electroforesis de agarosa.
b. Identificar el marcador de peso molecular e identificar las bandas según el tamaño
correspondiente.
c. Por comparación con el marcador de peso molecular, identificar el tamaño de las
bandas de las muestras que aparecen en la fotografía del gel.
d. Presentar como resultado la imagen con la identificación de las bandas del marcador
de peso molecular y las muestras (figura 1). Describir al pie de la figura lo que se
observa.
RESULTADOS

Tabla 1. Extracción de ADN

Paso Fotografía Explicación / descripción de la

fotografía
1
2
3
4

Tabla 2. Electroforesis (simulador)

Paso Fotografía Explicación de la actividad que

se está realizando
1
2
3
4

Figura 1. Descripción de la figura.

CUESTIONARIO
1. Indique la importancia y función biológica del ADN.
2. Investigue y explique la función que cumplen los siguientes compuestos en el
procedimiento de extracción de ADN
a. Sal
b. Detergente o jabón líquido
c. Ablandador de carne (o jugo de piña)
3. ¿Qué precauciones debe tomar al momento de utilizar bromuro de etidio para visualizar
ácidos nucleicos en un gel de agarosa? Explique detalladamente.
4. Investigue y presente la ficha de toxicidad de: bromuro de etidio.
5. ¿Cuál es la composición y la fuente a partir de la cual se obtiene la agarosa?
6. Mencione dos aplicaciones de la técnica de electroforesis de ácidos nucleicos que puedan
aplicarse a su carrera.
7. Explique la utilidad de un marcador de peso molecular en la técnica de electroforesis.
8. Explique los riesgos del uso del transiluminador de luz UV y los aspectos básicos de
protección que debe tomar en cuenta.

Bibliografía

Guatemala, abril 2022

Departamento de Bioquímica
Adaptación modalidad virtual, 2022. Rosario D. Hernández, QB.