Guía de Seminarios y Trabajo de Laboratorio Dbio 1080 202320

GUÍA DE SEMINARIOS
Y
DETERMINACIONES
BIOQUÍMICAS
Bioquímica General
DBIO 1080
2023
ACTIVIDADES Y PLANIFICACIÓN
Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

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Bienvenida/o a la Guía de seminarios y determinaciones bioquímicas de la asignatura Bioquímica

General (Código DBIO1080). En este documento podrás encontrar los contenidos para cada
laboratorio, así como las actividades que deberás realizar en cada uno de ellos. En el programa de
la asignatura encontrarás toda la información del semestre, el cual incluye los contenidos, los
procedimientos (métodos de trabajo y habilidades) y las actitudes que debes desarrollar durante
este periodo. También podrás encontrar el porcentaje de cada evaluación y la bibliografía que debes
utilizar. Este documento deberás descargarlo desde la plataforma Classroom al igual que otros
documentos del curso que podrás encontrar.
A continuación, encontrarás un resumen de los laboratorios que realizarás. Las fechas serán
entregadas por tu docente a comienzos del semestre, te aconsejamos que las transcribas a esta
tabla y estés pendiente de ellas.
Nº Tema Tipo de Evaluación Fecha

Actividad de
Realización
1 Introducción a Actividades de Laboratorio y Seminarios, Laboratorio n/a
Parametrización y evaluaciones (ponderaciones). (uso 0
correcto de micropipetas y material de prácticos de
Bioquímica)
2 Actividad Práctica 1 Laboratorio 1 Reporte 1
Espectrofotometría y construcción de Curva de
Calibración (Reporte 1).
3 Seminario A Seminario n/a
-Código de azúcares
-Grasas trans, ácidos grasos omega y eicosanoides
4 Seminario B: Actividad bioinformática. Seminario: n/a

-Modelaje de proteínas (Fibrilares, Globulares, dominios Actividad
estructurales) Computacional
5 Seminario C: Seminario n/a
-Actividad 1. Moléculas transportadoras de electrones
(NADH, NADPH, FADH2)
-Actividad 2. Generalidades de las vías metabólicas, mapa
metabólico.
6 Actividad Práctica 2: Laboratorio 2 Reporte 2
Laboratorio construcción curva de progreso (Reporte 2)
7 CONTROL PRACTICO N°1. n/a

Distribución temas actividad posters (puede ser
presentación online o día de presentaciones)
8 Seminario D: Seminario n/a
Intolerancia a la lactosa, Esteatorrea, Síndromes de
malabsorción. Polisacáridos complejos de utilidad médica
(quitosano, derivados de la quitina, etc).

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9 Actividad Practica 3: Laboratorio 3 Reporte 3

Determinación de niveles de glucosa plasmática (Glicemia)
Parámetros óptimos, Interpretación de resultados. (Reporte
3)
10 Seminario tipo caso clínico breve: Seminario n/a
Resuelve situaciones fisiológicas que involucren
carbohidratos
11 Seminario E: Seminario n/a
Actividad 1: Análisis de la Estructura y funcionamiento de
ATP sintasa.
Actividad 2: Mecanismo de acción desacoplantes e
inhibidores químicos de CTE.
12 Actividad Practica 4: Laboratorio 4 Reporte 4
Determinación de perfil lipídico (trigliceridemia, colesterol
total y HDL)
Parámetros óptimos, Interpretación de resultados. (Reporte
4)
13 Seminario tipo caso clínico breve: Seminario n/a

Resuelve situaciones fisiológicas que involucren lípidos
Comparación de rendimiento energético de oxidación de
Azucares y grasas.
14 Control Práctico N°2. n/a
Revisión temas actividad posters (puede ser
presentación online o día de presentaciones)
15 Actividad Practica 5: Laboratorio 5 n/a
Enzimas de utilidad clínica/determinación de
transaminasas. (análisis de datos se realizará con los
estudiantes en lugar de reporte)
16 Consolidación final: Seminarios/Poster
Actividad audiovisual (poster, workshop, otros) con análisis
de alteraciones bioquímicas que involucre el metabolismo
celular.
INDICACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO Y SEMINARIOS
Del trabajo en laboratorio:
• Los Laboratorios se desarrollan en un módulo de clases según las fechas calendarizadas

para cada sección.
• Se exige un 100% de asistencia a las actividades prácticas, la ausencia a estas actividades

implica no cumplir con los requisitos de aprobación para la asignatura (ver Programa de la
Asignatura).

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• Se exige puntualidad, el retraso en el horario de entrada implica que NO estará autorizado

el ingreso al laboratorio, quedando ausente de la actividad con la consecuencia de incumplir
los requisitos de aprobación.
• Es requisito para el ingreso y permanencia en el laboratorio el uso del delantal blanco

cerrado de mangas largas. El estudiante que no cumpla con esta condición no puede
ingresar al laboratorio, quedando ausente de la actividad práctica. La vestimenta deberá
considerar el uso de pantalón largo sin hoyos, zapatos cerrados y en el caso de quienes
tengan el pelo largo, éste debe ser amarrado.
• Se exige un comportamiento acorde al trabajo en laboratorio, por lo que aquellos

estudiantes que no presenten una conducta responsable y realicen desorden serán
expulsados del laboratorio, quedando ausentes de la actividad y siendo calificados con
nota 1.0 (uno punto cero). Cada estudiante es responsable del material entregado para el
desarrollo de las actividades prácticas. Al finalizar la actividad deberá entregar los
materiales en buenas condiciones, así como el lugar de trabajo limpio y ordenado.
• No se permite durante el desarrollo de las actividades prácticas, el uso de celular y gorros,

ingerir cualquier tipo de alimento o bebida, masticar chicle, fumar, el uso de cualquier
implemento ajeno al trabajo de laboratorio que genere distracción de los estudiantes. Las
mochilas y/o bolsos deben ser dejados ordenadamente en los estantes dispuestos para ello;
no se permite la entrada y salida libre del estudiante del laboratorio, la salida sin
autorización implica que el estudiante no puede volver a ingresar al laboratorio quedando
ausente de la actividad y siendo calificado con nota 1.0 (uno punto cero).
• Las actividades serán realizadas en grupos de cuatro estudiantes o según las indicaciones
del profesor encargado.
• En lo posible traer un notebook o Tablet, ya que se necesitará buscar información o realizar

cálculos. (no se permite el uso de celulares durante la sesión práctica)
• El estudiante debe asistir a las actividades practicas con estudio previo de los temas
relacionados al práctico, con dominio y conocimiento de las actividades a desarrollar
durante cada laboratorio. En la plataforma Classroom se encuentra disponible la Guía de
Laboratorios. Adicionalmente, el Docente encargado podrá subir información
complementaria necesaria para el desarrollo de determinado práctico.
• Los estudiantes deberán entregar al TÉRMINO DE LA SESIÓN, un Reporte de Laboratorio,

correspondiente a la sesión realizada. El formato del informe deberá ser descargado de la
plataforma y completado durante el trabajo practico. Según las instrucciones del docente,
será posible subirlo a ClassRoom para su calificación.

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Del trabajo de Seminario:
• En los módulos de seminario se solicitará al estudiante que analice diferentes documentos

tipo artículos, reviews o similar generando como producto un mapa conceptual o recurso
audiovisual similar (presentación, cápsula, entre otros) donde deberá identificar las
principales ideas expresadas en el articulo y discutir junto a sus compañeros y docente la
relevancia del contenido. En la mayoría de ellos se requiere una lectura comprensiva previa
(utilizando las horas de estudio autónomo) para enriquecer la discusión científica.
• Adicionalmente, se deberán resolver casos bioquímicos donde se deberán aplicar y analizar

los principios revisados en clases teóricas.
• Como recurso bibliográfico se utilizarán las bases de datos y libros electrónicos disponibles
en https://biblioteca.uss.cl/libros-electronicos-3
• Para estos módulos se requiere que el estudiante asista idealmente con un equipo personal
tipo notebook, tablet o similar, ya que será necesario la conexión a internet y el acceso a
recursos on – line.
• La asistencia y cumplimiento de estas actividades se regirán con las mismas exigencias del
trabajo en el laboratorio. El docente a cargo indicará la necesidad o no de asistir con delantal
blanco.
NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

La bioseguridad es un conjunto de normas, medidas y protocolos que se aplican en múltiples
procedimientos, realizados tanto en investigaciones científicas como en el trabajo de profesionales
del área de la salud, en particular, al interior de los hospitales y centros de toma de muestras. Estas
tienen como objetivo contribuir a la prevención de riesgos y/o infecciones derivadas de la exposición
a agentes potencialmente infecciosos o con cargas significativas de riesgo biológico, químico y/o
físico.
Las disoluciones que se prepararán durante el semestre permitirán la cuantificación de analitos en
plasmas sanguíneos comerciales, por lo tanto, se aplicarán las siguientes las normas de
bioseguridad:

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De esta manera, las principales precauciones que se deben tener para reducir el riesgo de
transmisión de agentes patógenos son:
a) Precauciones estándares
a. Higiene de las manos, al inicio y finalización de las actividades
b. Uso de guantes.
c. Protección facial (ojos, nariz y boca).
d. Uso de delantal.
e. Prevención de pinchazo de aguja y lesiones con otros instrumentos afilados.
f. Higiene respiratoria y etiqueta de la tos (cubrirse nariz y boca al toser/estornudar).
g. Limpieza ambiental (desinfección del entorno).
h. Eliminación de desechos. Utilizar los medios de eliminación de material
contaminado.
Normas APA
Las normas APA son un conjunto de estándares creados por la American Psychological Association,
con la finalidad de unificar la forma de presentación de trabajos escritos a nivel internacional, que
se utiliza principalmente en trabajos de investigación que serán publicados en revistas
especializadas o en trabajos bibliográficos en los que se solicite esa forma de citar las referencias
bibliográficas. Ustedes deben aplicarlas para citar las referencias utilizadas en la preparación de
informes y del seminario. Esta serie de normas se actualizan constantemente y puede encontrar un
manual oficial de ellas en http://normasapa.net/2017-edicion-6/. Para facilitar la obtención de las
normas y fomentar su uso, la universidad posee dentro de su sistema de bibliotecas un documento
virtual en formato PDF que contiene dicha información. Dicho documento se puede obtener en:
https://www.uss.cl/biblioteca/wp-content/uploads/2018/01/MANUAL-APA_BIBLIOTECA-2017.pdf

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SESIÓN INICIAL: INTRODUCCIÓN A LAS PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
En la actualidad la utilización de soluciones se ha masificado en diversas áreas de la ciencia,

de tal forma que su preparación constituye una práctica rutinaria de la cual la medicina no
queda exenta. Se entiende por disolución a la dispersión homogénea del soluto en un
solvente. Este proceso generalmente requiere de una fuente de energía para que ocurra,
que puede ser calor y/o una fuerza mecánica como la agitación.
Las soluciones más comúnmente utilizadas son aquellas en las que el soluto es un sólido o un
líquido y el solvente es un líquido, normalmente agua. La concentración de la solución nos
da información acerca de la cantidad de soluto incorporado en un solvente, expresado en
unidades de concentración.
Existen diversas formas de expresar la concentración, pero sólo se analizarán aquellas
unidades de mayor aceptación internacional. Las unidades de concentración más utilizadas
son m/m, m/v, Molaridad (M = mol/L).
En varias ocasiones es fundamental preparar ciertas soluciones a concentraciones muy bajas
y en forma precisa. Las soluciones son más estables a mayor concentración, por lo que éstas
se almacenan lo más concentradas posibles. Cuando se trata de un producto de alto costo, se
prepara sólo la cantidad necesaria del producto deseado para optimizar recursos, por lo que
es útil entender el concepto dilución seriada.
Dilución Seriada:
El objetivo de las diluciones seriadas es obtener una solución diluida a partir de otra solución
concentrada, a través de diluciones sucesivas de volumen y concentración establecidos por el
usuario. La magnitud de las diluciones y el volumen final de soluciones son establecidos por
el usuario de acuerdo con la disponibilidad de material para realizarlo y sus objetivos, ya que
una de las finalidades de esta técnica es facilitar en la práctica la dilución de una solución
concentrada para su cuantificación.
El cálculo de concentraciones y alícuotas se determina mediante la relación: C1xV1=C2xV2,
teniendo siempre claro la concentración de la solución inicial y la de la solución final, y el
volumen de la solución final. La siguiente Figura muestra un ejemplo de una dilución de una
solución de albúmina.
Si se conoce la concentración de la solución original, y se efectúa un número determinado de
diluciones seriadas, es factible obtener distintas concentraciones de una solución final según
lo que se necesite.

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Micropipetas: son instrumentos volumétricos bastante precisos, que permiten medir

volúmenes pequeños. Poseen un dial que permite variar la cantidad de volumen a pipetear.
Este volumen está medido en microlitros (µL). Existen distintas micropipetas según su
capacidad: de 1-20 μL, de 20-100 μL, de 100-1000 μL
Equivalencia de unidades
Recuerde que: 1 mL = 1000 µL
Por lo tanto, para transformar mL a µL, debe multiplicar por un factor unitario.
Por ejemplo, si requiere utilizar un volumen de 0,45 mL, el cálculo de equivalencia es:
1000 𝜇𝐿
𝟎, 𝟒𝟓 𝒎𝑳 × = 𝟒𝟓𝟎 𝝁𝑳
1 𝑚𝐿

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Para el uso correcto de las micropipetas, considere que se trata de material volumétrico
delicado, por lo que deben tratarse con cuidado y no forzarlas. Para medir adecuadamente
un volumen, debe seguir los siguientes pasos:
1. Marcar en el dial el volumen deseado.
2. Apretar el émbolo hasta el primer tope. (con el pulgar, según imagen)
3. Con la pipeta bien recta, introducir la punta en la solución a pipetear.
4. Aspirar el contenido previamente ajustado, cuidando de no generar burbuja.
5. Para verter el volumen aspirado, apretar el émbolo, hasta el segundo tope para vaciar
el volumen completamente.
6. Se desecha la punta en el recipiente correspondiente después de terminar.

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ACTIVIDAD PRÁCTICA
Materiales
• Micropipetas 20, 200 y 1000 microlitros
• Caja puntas amarillas
• Caja de puntas azules
• Vasos precipitados
• Gradilla para tubos eppendorf
• Tubos eppendorf
• Agua destilada Estrategia
• Solución CuSO4 18%m/v
Aprendizaje colaborativo
• Se trabajará en grupos de 3-4 alumnos o según lo indique el profesor. El grupo deberá
organizarse para aprender a manipular y medir volúmenes con las distintas micropipetas
disponibles.
• Practicar los pasos que se deben seguir para el correcto uso de las micropipetas (Vea Figura
1). Hágalo sin tomar ninguna solución, hasta que este seguro de los pasos ordenados para
el funcionamiento de la micropipeta.
• Una vez que haya diferenciado los dos topes, practique tomando volúmenes de solución
coloreada, por ejemplo, CuSO4 al 18%m/v. Para ello agregue una solución coloreada a un
vaso precipitado pequeño y vierta volúmenes determinados en otro vaso precipitado.
• Tome 500 y 20 μL de solución coloreada y agréguelo a tubos eppendorf por separado.
• Rotule los tubos y diríjase a su profesor a cargo para que evalúe su desempeño.

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ACTIVIDAD PRÁCTICA N°1

ESPECTROFOTOMETRÍA Y CONSTRUCCIÓN DE CURVA DE CALIBRACIÓN
INTRODUCCIÓN:
La espectrofotometría es un método físico que permite detectar un compuesto en una solución y/o
determinar su concentración, aprovechando el comportamiento de este frente a la luz ultravioleta
o visible. Tanto compuestos inorgánicos como los orgánicos tienen la capacidad de absorber luz de
una determinada longitud de onda, que puede estar en el rango visible o ultravioleta (UV) del
espectro de radiación electromagnética (Figura 1). La longitud de onda de la luz se expresa
generalmente en nanómetros (1 nm = 1 x 10-9 m) y nos da cuenta de la región del espectro que se
está utilizando (Figura 1).
Figura 1. Espectro de radiación electromagnética. En el espectro visible, diferentes longitudes de

onda se observan en diferentes colores. (Extraído de guía Laboratorio DBIO 1076, USS)
Absorción colorimétrica.
Fundamentos:
Algunos compuestos químicos y bioquímicos (proteínas, carotenos, ácidos nucleicos e
hidratos de carbono, entre otros), absorben una cierta intensidad de luz en el rango visible o
UV del espectro. Los compuestos que presentan esta propiedad se denominan cromóforos.
Dependiendo del tipo de compuesto, será diferente la longitud de onda a la cual absorben.
Las proteínas y los ácidos nucleicos pueden absorber luz en la región UV y/o visible.
Dependiendo de la concentración y del tipo de proteína o ácido nucleico que se trate, se
observará una mayor o menor capacidad de absorción de la luz
Los grupos funcionales aromáticos confieren la propiedad de absorber la luz en el espectro
UV.
La mayoría de las biomoléculas no absorben luz visible, excepto las que son coloreadas
(ejemplo: hemoglobina y mioglobina).

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Algunas biomoléculas, al reaccionar con determinados compuestos químicos forman

productos coloreados que absorben en el espectro visible, como es el caso de la reacción de
las proteínas con el reactivo de Biuret.
ABSORCIOMETRÍA
Si a una energía radiante que tiene una intensidad inicial denominada Io se le hace atravesar
una cubeta que contiene una solución de una sustancia que absorbe esa energía radiante, la
intensidad de la luz que sale de la solución luego de atravesarla (It o I), será menor que Io. Ver
las figuras.
La sustancia en solución puede absorber a una cierta longitud de onda del espectro de luz, ya
sea, UV (200-340 nm) o visible (340-750 nm),
La Absorbancia se define como la cantidad de luz que es absorbida por una solución
a una longitud de onda fija. Esta Absorbancia es directamente proporcional a la concentración
de la solución.
La Ley de Lambert-Beer, define la relación, directamente proporcional, entre la absorbancia y
la concentración de una solución y se precisa según la siguiente fórmula:
Donde:
A = Absorbancia
ε= Coeficiente de extinción molar, que es una constante característica para cada sustancia. l
ι = Longitud que debe atravesar la luz, es también una constante que depende del equipo y
generalmente es igual a 1 cm, que corresponde al ancho de la cubeta.
c = Concentración de la solución.

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Otro término asociado es la transmitancia, que se define como el porcentaje de la luz que
atravesó la solución en relación con la intensidad de luz inicial Io y que tiene una relación
logarítmica con la Absorbancia.
Revise previamente a su actividad práctica el siguiente video:
Ley de Lambert Beer : https://www.youtube.com/watch?v=xJZIOOkvTOo
Cuando una solución de proteínas se alcaliniza fuertemente con Hidróxido de sodio o de Potasio y
luego se agrega a una solución diluida de sulfato de cobre, se produce un color violeta, cuya
intensidad es proporcional a la concentración de la proteína de la solución.
Esta reacción, se denomina reacción de Biuret, y es propia de las sustancias que contienen dos
grupos carbamilos o amidas (-CONH) unidos directamente o por medio de un átomo de carbono o
de nitrógeno. Las proteínas y los péptidos (a partir de los tripéptidos) presentan dicha estructura, y
por lo tanto, dan positiva esta reacción.
El reactivo de Biuret (sulfato cúprico en medio alcalino), reacciona con compuestos que tienen dos
o más enlaces peptídicos dando coloración característica. El color desarrollado se debe a la
formación de un complejo de coordinación entre el Cu++ y cuatro átomos de nitrógeno que
provienen de dos cadenas peptídicas. Este color se puede medir por absorciometría.
Curva de calibración:
Fundamento:
Una curva de calibración es la representación gráfica de una señal que se mide en función de la
concentración de un analito. En este caso, la señal es el color desarrollado por la reacción de Biuret,
y el analito, corresponde a las proteínas que queremos medir.
El color desarrollado se mide en un espectrofotómetro, a una longitud de onda tal, que permite
medir el color azul violeta (546 nm).
La etapa de calibración analítica se realiza mediante un modelo de línea recta que consiste en
encontrar la recta de calibrado que mejor ajuste a una serie de “n” puntos experimentales, donde
cada punto se encuentra definido por una variable “x” (variable independiente, generalmente
concentración del analito de interés) y una variable “y” (variable dependiente, generalmente
respuesta instrumental, en este caso la Absorbancia).

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La recta de calibrado se encuentra definida por una ordenada al origen (b) y una pendiente (m),
mediante la ecuación y = mx + b .
Complemente esta información visitando el siguiente link:

https://www.youtube.com/watch?v=7PZJGGfbU7U
ACTIVIDAD PRÁCTICA
MATERIALES
• Espectrofotómetro ajustado a 546 nm.
• Cubetas de plástico de 1,5 mL
• Material volumétrico (micropipetas de 100 µL y de 1000 µL, tubos de ensayo)
• Muestras de suero normal y patológico.
• Estándar de proteínas totales.
• Reactivo Biuret
• Timer o cronómetro.
• Agua destilada
MUESTRAS
• Suero N
• Suero P

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ESTRATEGIA
Aprendizaje colaborativo, se trabajará en grupos de 3-4 alumnos o según lo indique el profesor. El
grupo deberá organizarse para construir una curva de calibración para la determinación de
proteínas plasmáticas por el método de Biuret, luego hacer una determinación de proteínas en dos
muestras desconocidas y discutir sus resultados para realizar el informe grupal.
I.- Construcción de la curva de calibración:

Revise los siguientes videos, enfatizando el primero de ellos:
https://www.youtube.com/watch?v=kwsaXna5_j0 Dr. Felipe Cabezas, Departamento de CB, USS

https://www.youtube.com/watch?v=ZA1lzPMyCMU
En esta actividad, los puntos experimentales son 5 y están dados por las coordenadas x e y
correspondientes a los tubos 1,2,3,4, y 5, en donde el eje x es la concentración de proteínas [g/dL]
de cada tubo y el eje y corresponde a su Absorbancia a 546 nm.
El tubo 1 corresponde al tubo blanco.
La medida de la Absorbancia del blanco puede realizarse de dos maneras:
a) ajustando a cero la absorbancia del blanco
b) restar la absorbancia del tubo blanco a la absorbancia de todos los tubos con distintas
concentraciones del analito, ya sea puntos de la curva de calibración o muestras (Absorbancia
corregida =Absorbancia medida- Absorbancia del tubo blanco).
II.- Cuantificación de proteínas en dos muestras desconocidas:
Debido a que se usará la curva de calibración para obtener las concentraciones de las muestras
desconocidas, las muestras deben ser tratadas exactamente igual a los tubos de la curva y
corresponderán a los tubos 6 y 7.
La concentración de proteínas de los tubos para la curva de calibración (tubos 2-3-4 y 5) se obtienen,
ya sea, por la utilización de estándares de proteínas de distintas concentraciones que se agregan en
igual volumen (en este caso 50 µL), o tomando distintos volúmenes menores del estándar de 8 g/dl,
diluyendo con agua hasta completar 50 µL (modalidad utilizada aquí).
Para poder realizar la curva de calibración, usted deberá calcular previamente, la

concentración de proteínas en cada tubo. Realice los cálculos y complete la tabla siguiente.
Considere que el estándar de proteínas tiene una concentración de 8.0 g/dL.

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Preparación tubos Curva de Calibración Preparación tubos muestras
Tubos Curva de Calibración Tubos

Muestras
N° tubo 1 2 3 4 5 6 7
Estándar de proteínas 0 20 30 40 50 0 0
8 g/dL (µL)
H2O destilada (µL) 50 30 20 10 0 0 0
Muestra N (µL) 50 0
Muestra P (µL) 0 50
Reactivo de Biuret (µL) 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000
Concentración de
Proteínas
(g/dL)
*Mezclar por agitación suave, incubar 10 minutos a temperatura ambiente y leer la

Absorbancia a 546 nm.

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ACTIVIDAD PRÁCTICA N° 2
CINETICA ENZIMATICA: CALCULO DE LA VELOCIDAD INICIAL ENZIMATICA
INTRODUCCIÓN:
La cinética enzimática estudia la velocidad de una determinada reacción enzimática. Estos datos
permiten medir los parámetros cinéticos de una enzima.
Por actividad enzimática se define la capacidad de una determinada enzima de transformar sustrato
en producto en una unidad de tiempo. La unidad con que se expresa la actividad enzimática
corresponde a la unidad de actividad enzimática (U) definida como la cantidad de enzima que
cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en producto en un minuto.
La velocidad inicial de una reacción enzimática se puede calcular a partir de la pendiente de la gráfica
de la curva de progreso de la reacción enzimática (gráfica de formación de producto v/s tiempo).
En esta sesión de laboratorio se calculará la velocidad inicial de la reacción de la enzima Celobiasa.

La celobiasa corresponde a una enzima β-glucosidasa, que cataliza la hidrólisis de la celobiosa usada
como sustrato, liberando dos moléculas de glucosa como producto. (la glucosa así obtenida, puede
ser fermentada para generar moléculas de etanol que pueden ser utilizadas como bio-combustible).
La actividad de esta enzima puede ser determinada a partir de un ensayo colorimétrico utilizando
el compuesto p-nitrofenil glucopiranósido como sustrato de la reacción (sustrato artificial para la
celobiasa). La acción catalítica de la celobiasa sobre este sustrato genera como producto el p-
nitrofenol, molécula, que en medio básico, genera una molécula de color amarillo en solución, la
que puede ser determinada espectrofotométricamente.

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Si quisiéramos calcular la actividad enzimática en mmoles de sustrato por minuto, se debe

tener en cuenta la Ley de Lambert-Beer:
Donde:
A = Absorbancia
ε= Coeficiente de extinción molar, que es una constante característica para cada sustancia
(averiguar el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol, el cual debe estar expresado en
mL/mmol cm
l = Longitud que debe atravesar la luz, es también una constante que depende de las cubetas
utilizadas en el equipo y generalmente es igual a 1 cm.
C= Concentración de la solución.
Si despejamos la concentración, tenemos que C= A / ε * l
Por otro lado, si reemplazamos A por m * V ensayo, donde:

m corresponde a la pendiente de la curva de progreso : ΔA/Δt
V ensayo es el volumen de ensayo ( 1 mL)
La actividad de la enzima queda expresada en unidades de velocidad:

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En este práctico calcularemos la velocidad inicial de la reacción mediante el cálculo de la

pendiente de la curva de progreso de la reacción enzimática.
MATERIALES
• Kit Biofuel Enzyme©, BioRad
• Espectrofotómetro
• Cubetas para espectrofotómetro
• Tubos de ensayo
• Micropipetas
• Cronómetro
MUESTRAS
• Celobiasa
ESTRATEGIA
Aprendizaje Colaborativo, se trabajará en grupos de 3-4 alumnos o según lo indique el profesor, los
que determinarán la velocidad de una reacción en presencia y ausencia de una enzima (Celobiasa).
Mediante un ensayo colorimétrico, y discutirán sus resultados para realizar un informe grupal.
ACTIVIDADES
I.- Construcción de curva de estándar de p-nitrofenol:

Utilizando los estándares de p-nitrofenol de concentración conocida, lea la absorbancia de cada
estándar a 410 nm en el espectrofotómetro. Con estos valores construya la curva standard o curva
de calibración: Abs 410 nm v/s concentración p-nitrofenol.
Utilice dicha curva para el cálculo de la concentración de producto formado en cada tiempo
de reacción de la siguiente actividad.

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II.- Determinación de la velocidad de reacción enzimática:

Para determinar la velocidad de la reacción catalizada por la celobiasa, se utilizará el kit Biofuel
Enzyme© (BioRad). Se utilizarán 7 condiciones experimentales para evaluar la actividad
enzimática: Una condición control inicial (tiempo 0), cinco mediciones experimentales (a
tiempos 1, 2, 4, 6, 8 minutos), y un punto de control final de reacción (tiempo 10 min, sin
enzima).
Ubique los tubos cónicos rotulados: “Stop Solution”, “1.5 mM Substrate”, “Enzyme”,
“Buffer”.
1. Rotule 5 cubetas E1 a E5 (raye sólo en parte superior)
2. Rotule las dos cubetas restantes como: “Inicio” y “Final”. Estas cubetas servirán como
punto de control al tiempo cero y tiempo final, respectivamente, ambas sin contener
enzima.
3. A cada una de las siete cubetas, agregue cuidadosamente 500 µl de Stop Solution.
(Use pipetas de transferencia plásticas desechables (PTPD), luego enjuáguela con
agua destilada)
4. Rotule dos tubos cónicos de 15 mL, al primero rotúlelo Reacción enzimática y al

segundo Control.
5. Al tubo rotulado. “Reacción enzimática” agréguele 2 mL de solución 1.5 mM Sustrato

y al tubo “Control “agréguele 1 mL de la misma solución. (use PTPD).

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6. Ahora rotule una PTPD “E” exclusivamente para enzima y otra “C” exclusivamente
para Control. Debe usar la PTPD “E” para el tubo Reacción enzimática y la PTPD “C”
para el tubo control. NO INTERCAMBIAR.
¡Los siguientes pasos son determinantes en nuestro experimento!! Lea

detenidamente las instrucciones 8 a la 11, antes de realizar la actividad
experimental, ya que son dependientes del tiempo!!!!.
7. Utilizando la PTPD rotulada “C” agregue 500 µL de buffer de reacción al tubo cónico
de 15 mL rotulado “Control” y mezcle suavemente. Una vez mezclado el buffer con el
sustrato, saque 500 µL de esta solución y agréguela a la cubeta denominada “Inicio”
8. Usando la PTPD rotulada “E” agregue 1mL de enzima al tubo cónico de 15 mL rotulado
“Reacción enzimática”. Mezcle suavemente e inicie su cronómetro, esto marca el
inicio de la reacción enzimática.
9. A los tiempos indicados, use la PTPD rotulada “E” para sacar 500 µL de solución del
tubo “ Reacción Enzimática y vaya agregándolos a las cubetas correspondientes y que
contienen la solución de detención de la reacción ( “Stop Solution”)

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10. Después que han sido colectadas todas las muestras enzimáticas, use la PTPD rotulada
“C” para sacar 500 µl de la solución del tubo “Control”, a la cubeta rotulada “Final”.
11. Mida la absorbancia a 410 nm, de cada una de las cubetas, utilizando el
espectrofotómetro asignado (Si tiene dudas en el uso del equipo, pida asistencia al
profesor para la medición).
Los resultados obtenidos en esta actividad debe presentarlos realizando los gráficos y
contestando las preguntas del Informe.

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ACTIVIDAD PRACTICA N°3

METABOLISMO DE GLÚCIDOS: DETERMINACIÓN DE GLICEMIA
INTRODUCCIÓN:
Los carbohidratos son uno de los principales componentes de la dieta en los seres humanos.
La glucosa es el monosacárido más importante que se utiliza para extraer energía. Cualquier
alteración en su metabolismo origina patologías, como la diabetes. El metabolismo de la
glucosa incluye, entre otros, los procesos de glucólisis, glucógenolisis, glucógenogénesis y
gluconeogénesis, los cuales son regulables por hormonas tales como la insulina, glucagón y
adrenalina.
Las determinaciones de glucosa pueden realizarse en diferentes fluidos biológicos, siendo el

más común la determinación en sangre (glicemia).
Esta determinación se realiza en estado de ayuno.
VALORES DE REFERENCIA GLICEMIA EN AYUNAS: 70 a 100 mg/dL
Determinaciones de glicemia fuera del rango de referencia, determinan condición de

hipoglicemia e hiperglicemia:
Hipoglicemia : valores por debajo de 70 mg/dL

Hiperglicemia : valores por encima de 100 mg/dL
La determinación de la glicemia se efectuar mediante un ensayo enzimático-colorimétrico, el

cual consiste en dos reacciones enzimáticas acopladas. En la primera reacción (reacción
específica), catalizada por la enzima glucosa oxidasa (GOD), se oxida la glucosa y se genera
H2O2. En la segunda reacción (reacción indicadora), la enzima peroxidasa (POD) cataliza la
descomposición del H2O2 lo que provoca oxidación de un cromógeno que pasa de su forma
reducida (4-aminoantipirina, incolora) a su forma oxidada (quinoneimina, coloreada). La
aparición del cromógeno oxidado (coloreado) se mide mediante un espectrofotómetro,
siendo la coloración producida directamente proporcional a la concentración de glucosa en la
muestra. La coloración se determina mediante una lectura espectrofotométrica a 546nm.

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Glucosa + O2 ácido glucónico + H2O2

Glucosa-oxidasa
H2O2 + 4-aminoantipirina + 4-clorofenol Quinoneimina + HCl + H2O

Peroxidasa
Se debe utilizar una solución de glucosa de concentración conocida con la que se hace la
comparación de Absorbancia.
MATERIALES
• Tubos de ensayo.
• Baño de agua termorregulado.
• Micropipetas de 10 µL y 1000 µL con sus respectivas puntillas.
• Reactivo para determinación de Glucosa
• Estándar de Glucosa 100 mg/dL
MUESTRAS
• Suero Normal
• Suero Patológico
ESTRATEGIA
Aprendizaje Colaborativo, se trabajará en grupos de 3-4 alumnos los que cuantificarán la glicemia
de dos muestras distintas y discutirán sus resultados para realizar un informe grupal.

P á g i n a | 25
ACTIVIDADES
I.- Determinación de la Glicemia: Prepare una serie de 4 tubos, de acuerdo con la tabla siguiente:
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

(Blanco) (Estándar) (muestra N) (muestra P)
H2O(µL) 10 0 0 0
Estándar de 0 10 0 0
Glucosa
(100 mg/dL) (µL)
Suero Normal 0 0 10 0
(µL)
Suero Patológico 0 0 0 10
(µL)
Reactivo GOD-PAP 1000 1000 1000 1000
(µL)
A. Incube los tubos a temperatura ambiente por 10 minutos.

B. Lea la absorbancia de cada tubo en espectrofotómetro a 546nm.
C. Obtenga la concentración de glucosa de ambas muestras, utilizando la Absorbancia
546 nm de un standard de concentración conocida y comparándolas
aritméticamente con la Absorbancia 546 nm de sus muestras.
Δ Absorbancia 546 nm de la muestra X 100 (mg/dL)

Glicemia en la muestra (mg/dL)=
Δ Absorbancia 546 nm del Stándard
Los resultados obtenidos en esta actividad debe presentarlos contestando las

preguntas del Informe.

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ACTIVIDAD PRACTICA N°4

METABOLISMO DE LÍPIDOS: DETERMINACIÓN DE COLESTEROL, COLESTEROL-HDL Y
TRIGLICERIDOS
INTRODUCCIÓN:
Los lípidos se clasifican como sustancias orgánicas insolubles en agua, pero solubles en
solventes orgánicos. Los principales lípidos del plasma humano son colesterol, triglicéridos,
fosfolípidos y ácidos grasos. Estos lípidos son transportados en el plasma formando las
lipoproteínas. Las lipoproteínas se dividen en varias clases dependiendo de su densidad, lo
que determina su nomenclatura: Quilomicrones, VLDL (lipoproteínas de muy baja densidad),
IDL (lipoproteínas de densidad intermedia), LDL (lipoproteínas de baja densidad) y HDL
(Lipoproteínas de alta densidad).
Los lípidos plasmáticos de interés para diagnóstico y monitoreo de los tratamientos de las
dislipidemias son el colesterol y los triglicéridos. Los métodos rutinarios de Laboratorio
determinan a estos lípidos como parte de las lipoproteínas. Dentro de las lipoproteínas las de
mayor interés clínico son las HDL y las LDL, porque se correlacionan con el riesgo de
enfermedades cardiovasculares.
En este laboratorio, determinaremos: Colesterol Total, Triglicéridos y lipoproteínas HDL en

dos muestras distintas. Por otra parte, calcularemos las lipoproteínas LDL, de tal forma de
obtener un Perfil Lipídico de ambas muestras.
Para la determinación de colesterol total, se realiza un ensayo enzimático-colorimétrico que

consiste en tres reacciones enzimáticas acopladas. En la primera reacción, los ésteres de
colesterol contenidos en las lipoproteínas son hidrolizados por la enzima colesterol hidrolasa,
en la segunda reacción, la colesterol oxidasa, oxida el grupo 3-OH del colesterol y se forma
peróxido de hidrógeno, y en la tercera reacción la enzima peroxidasa cataliza la
descomposición del H2O2 lo que provoca oxidación de un cromógeno que pasa de su forma
reducida (4-aminoantipirina, incolora) a su forma oxidada (quinoneimina, coloreada). La
aparición del cromógeno oxidado (coloreado) se mide mediante un espectrofotómetro,
siendo la absorbancia del producto coloreado directamente proporcional a la concentración
de colesterol en la muestra. La coloración se lee a 546nm.
Ester de Colesterol + H2O Colesterol + ác. Graso

Colesterol hidrolasa
Colesterol + O2 Colest-4-en-3-ona + H2O2

Colesterol Oxidasa

Peroxidasa

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VALOR DE REFERENCIA: Colesterol Total Menor que 200 mg/dL
Las lipoproteínas plasmáticas son complejos macromoleculares encargados de transportar los

lípidos de forma soluble en la sangre. En su núcleo o parte central se ubican los lípidos y en la
superficie se encuentran las apolipoproteínas. Las distintas lipoproteínas tienen diferente
cantidad y tipo de apoproteínas y ello se usa para determinar algunas de ellas. La HDL es la
única lipoproteína que no posee apolipoproteína apo-B en su estructura y los métodos de
laboratorio utilizan esta propiedad para separarla de las otras lipoproteínas y cuantificarla en
forma separada.
Existen varios métodos para determinar el Colesterol-HDL:
A. Por Precipitación selectiva de las lipoproteínas que tienen apo B: Para la determinación
de Colesterol-HDL, se utiliza un reactivo precipitante que contiene ciertas sales que
reaccionan con las apo B precipitando a las lipoproteínas que la contengan. Como las HDL
no contienen apo B, no precipitan, y quedan en el sobrenadante obtenido por
centrifugación. Al determinar el colesterol que queda en el sobrenadante (por igual
método enzimático colorimétrico con el cual se determinó el colesterol total), se estará
determinando sólo el contenido en las lipoproteínas HDL.
B. Por determinación enzimática homogénea en presencia de surfactantes específicos para

HDL. Este método destinado a la determinación directa del colesterol HDL en suero y
plasma utiliza enzimas modificadas por PEG y sulfato de dextrano. En presencia de iones
de magnesio, el sulfato de dextrano forma complejos hidrosolubles, selectivamente con
LDL, VLDL y quilomicrones haciéndoles de este modo resistentes a la acción de las enzimas
modificadas con PEG. Cuando las enzimas colesterol esterasa y colesterol oxidasa son
modificadas por PEG (polietilénglicol), se manifiesta una actividad catalítica selectiva
hacia las partículas de HDL. La colesterol esterasa acoplada con PEG provoca el
desdoblamiento selectivo de los ésteres de colesterol de las partículas HDL a colesterol
libre y ácidos grasos. Este colesterol libre se oxida por la acción de la colesterol oxidasa,
acoplada a PEG, formando una colestenona y peróxido de hidrógeno. Por la acción de una
peroxidasa, el peróxido de hidrógeno oxida a un cromógeno que se determina
fotométricamente. La intensidad del colorante formado será directamente proporcional
a la concentración de colesterol HDL.
VALOR DE REFERENCIA: HDL mayor a 35 mg/dL
La determinación de triglicéridos se realiza mediante un análisis enzimático-colorimétrico que

consiste en cuatro reacciones enzimáticas acopladas. En la primera reacción, los triglicéridos
son hidrolizados por la enzima lipasa, en la segunda reacción, el glicerol es fosforilado con ATP
por la glicerol quinasa para producir glicerol-3-fosfato.En la reacción siguiente, el glicerol-3-
fosfato en presencia de O2 es oxidado a dihidroxicetona fosfato, con liberación de H2O2.
Finalmente, el H2O2 formado reacciona con 4aminoantipirina, en presencia de peroxidasa,

P á g i n a | 28
formando quinoneimina, que absorbe a 546 nm, siendo su formación directamente

proporcional a la cantidad de triglicéridos presente en la muestra.
Triglicéridos Glicerol + ácidos grasos

Lipasas
Glicerol + ATP Glicerol- 3-Fosfato + ADP

Gliceroquinasa
Glicerol- 3-Fosfato + O2 Dihidroxiacetona fosfato + H2O2

Glicerol 3 fosfato oxidasa

Peroxidasa
VALOR DE REFERENCIA: Trigliceridemia menor que 150 mg/dL
MATERIALES
• Tubos de ensayo.
• Baño de agua termorregulado
• Centrífuga
• Micropipetas de 10 µL, 100 µL y de 1 mL con sus respectivas puntillas.
• Reactivo para determinación de Colesterol
• Reactivo precipitante
• Reactivo para determinación de Triglicéridos
• Estándar de colesterol total
• Estándar de Colesterol-HDL
• Estándar de triglicéridos
MUESTRAS
• Suero N
• Suero P

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ESTRATEGIA
Aprendizaje Colaborativo, se trabajará en grupos de 3-4 alumnos los que cuantificarán el
colesterol total, Colesterol-HDL y Triglicéridos de dos muestras distintas y discutirán sus
resultados para realizar un informe grupal.
ACTIVIDADES
I.-Determinación de Colesterol TOTAL:
Preparar cuatro tubos adecuadamente rotulados, según lo indicado a continuación:

H2O (µL) 100 0 0 0
Colesterol
(200 mg/dL) (µL)
(µL)
(µL)
Reactivo para 1000 1000 1000 1000
determinación de
Colesterol Total
(µL)
A. Incube los tubos a 20 – 25°C por 10 minutos.

B. Lea la absorbancia en espectrofotómetro a 546nm.
C. Obtenga la concentración de colesterol de ambas muestras.
Δ Absorbancia de la muestra X 200 (mg/dL)

Colesterolemia total (mg/dL) =
Δ Absorbancia del Estándar

P á g i n a | 30
Fase 1: Separación de HDL de las demás lipoproteínas.
A. En un tubo Eppendorf coloque 200 μL de suero Normal y en otro tubo, 200 μL de

suero Patológico.
B. Agregue a ambos tubos, 500 μL de reactivo precipitante. (Es por ello que el factor de
dilución que se aplica en la fórmula para calcular la concentración es 3,5 ya que 200
μL de muestra quedan en 700 μL finales)
C. Incube los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente.
D. Centrifugue a 5000 rpm por 5 minutos.
E. Luego de centrifugar no mueva el tubo para no mezclar y déjelo cuidadosamente en
una gradilla hasta realizar la determinación.
Observación: Ya que se utilizan finalmente 100 uL del sobrenadante para hacer la reacción de
cuantificación de colesterol-HDL (vea tabla siguiente), se pide que entre 2 grupos hagan
solamente 1 reacción de precipitación por cada suero.
Fase 2: Cuantificación de colesterol-HDL
A. Preparar cuatro tubos, según lo indicado a continuación. Tenga precaución al aspirar los
sobrenadantes para que no se contaminen con el precipitado.
Tubo 1 Tubo2 Tubo3 Tubo 4

(Blanco) (Estándar) (sobrenadante (sobrenadante
muestra N) muestra P)
Ha)O (μL) 100 0 0 0
Estándar de HDL Colesterol 50 0 100 0 0

mg/dL (μL)
Sobrenadante muestra 0 0 100 0

Normal (μL)
Sobrenadante muestra Patológica 0 0 0 100

(μL)
Para asegurarse que los 4 tubos comiencen a reaccionar casi al mismo tiempo, agregue
los 1000 μL el reactivo para determinación de colesterol, cuando los 4 tubos contengan
los 10 μL de sus respectivos reactantes.
Reactivo determinación de 1000 1000 1000 1000

Colesterol (μL)

P á g i n a | 31
B. Incube los tubos a 37°C por 5 minutos, nuevamente

C. Lea la absorbancia en espectrofotómetro a 546nm.
D. Obtenga la concentración de colesterol-HDL de ambas muestras.
Concentración de Δ Absorbancia de la muestra x 3.5

colesterol-HDL (mg/dL)= Concentración STD X Δ Absorbancia del Estándar
III.-Cuantificación de Triglicéridos
Preparar cuatro tubos, según lo indicado a continuación:

H2O (μL) 10 0 0 0
Triglicéridos
(200 mg/dL) (μL)
(μL)
(μL)
Reactivo para 1000 1000 1000 1000
determinación de
Triglicéridos (μL)
A. Incube los tubos a temperatura ambiente por 10 minutos.

B. Lea la absorbancia en espectrofotómetro a 546nm.
C. Obtenga la concentración de Triglicéridos de ambas muestras.
Δ Absorbancia de la muestra X 200 (mg/dL)

Trigliceridemia (mg/dL) =
Δ Absorbancia del Estándar
Los resultados obtenidos debe presentarlos contestando las preguntas del Informe.

P á g i n a | 32
ACTIVIDAD PRACTICA 5
ACTIVIDAD ENZIMATICA DE AMINOTRANSFERASAS Y DE
GAMMAGLUTAMILTRANSPEPTIDASA
INTRODUCCIÓN:
Las AMINOTRANSFERASAS son enzimas ampliamente expresadas en el organismo, que catalizan la

transferencia de un grupo amino de un aminoácido a un alfa- cetoácido, en una de las reacciones
más importantes del metabolismo de los aminoácidos. Esta reacción es reversible y necesita como
grupo prostético al piridoxalfosfato.
El interés clínico está centrado especialmente en dos de ellas:
TGP (GPT) (transaminasa glutámico pirúvica) o ALAT (alaninaaminotransferasa)

TGO (GOT) (transaminasa glutámico oxalacética) o ASAT (aspartatoaminotransferasa)
Las reacciones catalizadas por GOT y GPT son las siguientes:
Alanina + ac. alfa-cetoglutarico ac.Pirúvico + ac. Glutámico

GPT
Ac. Aspártico+ ac. alfa-cetoglutárico ac.Oxalacético + ac.Glutámico

GOT
Las determinaciones de aminotransferasas, se basan en la medición de los alfa cetoácidos, ya sea

del alfa cetoácido consumido o del alfa cetoácido formado. A medida que la reacción transcurre, un
alfa cetoácido aumenta de concentración, a medida que el otro disminuye. Para su medición, se
utilizan reacciones enzimáticas acopladas, y los alfa cetoácidos producidos por la respectiva
aminotransferasa, son reducidos a hidroxiácidos por las enzimas lactato deshidrogenasa (LDH) o
malato deshidrogenasa (MDH) que utilizan coenzima reducida (NADH) y la oxidan a NAD+.
Debido a que el NADH absorbe a 340 nm, por la acción enzimática de la aminotransferasa, se
observará una disminución de la absorbancia a esta longitud de onda.
Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+

LDH
** en la reacción catalizada por GPT.
Oxalacetato + NADH + H+ Malato + NAD+

MDH
**en la reacción catalizada por GOT.

P á g i n a | 33
La desaparición del NADH por unidad de tiempo puede medirse por la disminución de la absorbancia
a 340nm. En estas mediciones el cambio de absorbancia por minuto (∆Abs/min) puede relacionarse
directamente con los micromoles de NADH oxidados que serán proporcionales a su vez con los
micromoles de sustrato transformados por minuto, lo que equivale a la actividad enzimática de la
aminotransferesa respectiva.
La gammaglutamil transferasa (GGT) cataliza la transferencia de una porción de gamma-glutamil

desde el glutatión un aceptor (un aminoácido, un péptido o una molécula agua). Esta enzima juega
un papel clave en el ciclo del gamma-glutamil, que permite transferir aminoácidos a través de la
membrana, y ser una vía para la síntesis o la degradación del tripéptido glutatión.
Para su determinación, se utiliza una reacción en la cual la GGT cataliza la transferencia del grupo γ-
glutamilo de la γ-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida (sustrato artificial) a la glicilglicina, produciendo
Glutamil– glicilglicina y 3-carboxi-4-nitroanilina. La actividad de la enzima se determina midiendo la
velocidad de formación de la 3-carboxi-4- nitroanilina que es el producto coloreado. Este producto
absorbe a 405 nm.
1,2 γ–Glutamil–3–carboxi–4-nitroanilida + Glicilglicina γ–Glutamil–glicilglicina + 3–carboxi–4nitroanilina
MATERIALES
Tubos de ensayo.
Baño de agua termorregulado
Espectrofotómetro
Micropipetas de 100 Ly de 1 mL y sus respectivas puntillas.
Reactivo para determinación de GOT
Reactivo para determinación de GGT
MUESTRAS
Suero N
Suero P
ESTRATEGIA
Aprendizaje Colaborativo, se trabajará en grupos de 3-4 alumnos los que medirán cinéticamente
las enzimas GOT y GGT en dos muestras distintas y discutirán sus resultados para realizar un
informe grupal.

P á g i n a | 34
ACTIVIDADES
I.-Determinación de la actividad de GOT
Se determinará la actividad de la enzima en dos muestras de suero y a una temperatura de 37°C,

para ello, con cada muestra de suero realice el siguiente procedimiento:
a) En una cubeta de 1.0 mL agregue 1.0 mL de Reactivo y 100 µL de suero.

b) Mezcle, incube y lea la absorbancia a 340 nm después de un minuto exacto. Realice
lecturas después de 1, 2 y 3 minutos a contar de la primera lectura. (4 lecturas de
Absorbancia) Lea frente a blanco de aire. Recuerde los valores de Absorbancia irán
disminuyendo.
c) Luego de obtener las lecturas de absorbancia, calcule la diferencia de absorbancia por
minuto (∆Abs/min).
∆ Absorbancia = Absorbancia 1 – absorbancia 2

Obtenga el promedio ∆ Abs/min.

Este promedio se multiplica por un factor estandarizado según la temperatura con la que se
trabaja (Factor a 37 °C = 2143).
Si la reacción se lleva a cabo a otra temperatura, considerar el factor adecuado.
Actividad enzimática (U/L) = ∆ Absorbancia 340 nm/min x F
II.- Determinación de la actividad de gammaglutamiltranferasa
Se determinará la actividad de la enzima en dos muestras de suero y a una temperatura de 37°C,

para ello, con cada muestra de suero realice el siguiente procedimiento:
a) En una cubeta de 1.0 mL agregue 1.0 mL de Reactivo y 100 µL de suero

b) Mezcle, incube y lea la absorbancia a 405 nm después de un minuto exacto. Realice
lecturas después de 1, 2 y 3 minutos a contar de la primera lectura. Lea frente a blanco de
aire.
c) Luego de obtener las lecturas en absorbancia, calcule el cambio de absorbancia por
minuto (∆Abs/min).
∆ Absorbancia = Absorbancia 2– absorbancia 1

∆ Absorbancia = Absorbancia 4 -- absorbancia 3
Obtenga el promedio ∆Abs/min.

P á g i n a | 35
Este promedio se multiplica por un factor estandarizado según la temperatura con la que se
trabaja (Factor a 37 °C =1158).
Actividad enzimática GGT(U/L) = ∆ Absorbancia 405 nm /min x F
Los resultados obtenidos debe presentarlos contestando las preguntas del Informe.

Guía de Seminarios y Trabajo de Laboratorio Dbio 1080 202320

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GUÍA DE SEMINARIOS

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

Bienvenida/o a la Guía de seminarios y determinaciones bioquímicas de la asignatura Bioquímica

Nº Tema Tipo de Evaluación Fecha

4 Seminario B: Actividad bioinformática. Seminario: n/a

7 CONTROL PRACTICO N°1. n/a

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

9 Actividad Practica 3: Laboratorio 3 Reporte 3

13 Seminario tipo caso clínico breve: Seminario n/a

INDICACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO Y SEMINARIOS

Del trabajo en laboratorio:

• Los Laboratorios se desarrollan en un módulo de clases según las fechas calendarizadas

• Se exige un 100% de asistencia a las actividades prácticas, la ausencia a estas actividades

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

• Se exige puntualidad, el retraso en el horario de entrada implica que NO estará autorizado

• Es requisito para el ingreso y permanencia en el laboratorio el uso del delantal blanco

• Se exige un comportamiento acorde al trabajo en laboratorio, por lo que aquellos

• No se permite durante el desarrollo de las actividades prácticas, el uso de celular y gorros,

• En lo posible traer un notebook o Tablet, ya que se necesitará buscar información o realizar

• Los estudiantes deberán entregar al TÉRMINO DE LA SESIÓN, un Reporte de Laboratorio,

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

Del trabajo de Seminario:

• En los módulos de seminario se solicitará al estudiante que analice diferentes documentos

• Adicionalmente, se deberán resolver casos bioquímicos donde se deberán aplicar y analizar

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

SESIÓN INICIAL: INTRODUCCIÓN A LAS PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA

En la actualidad la utilización de soluciones se ha masificado en diversas áreas de la ciencia,

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

Micropipetas: son instrumentos volumétricos bastante precisos, que permiten medir

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

ACTIVIDAD PRÁCTICA N°1

Figura 1. Espectro de radiación electromagnética. En el espectro visible, diferentes longitudes de

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

Algunas biomoléculas, al reaccionar con determinados compuestos químicos forman

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

Revise previamente a su actividad práctica el siguiente video:

Ley de Lambert Beer : https://www.youtube.com/watch?v=xJZIOOkvTOo

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

Complemente esta información visitando el siguiente link:

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

I.- Construcción de la curva de calibración:

https://www.youtube.com/watch?v=kwsaXna5_j0 Dr. Felipe Cabezas, Departamento de CB, USS

II.- Cuantificación de proteínas en dos muestras desconocidas:

Para poder realizar la curva de calibración, usted deberá calcular previamente, la

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

Preparación tubos Curva de Calibración Preparación tubos muestras

Tubos Curva de Calibración Tubos

*Mezclar por agitación suave, incubar 10 minutos a temperatura ambiente y leer la

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

En esta sesión de laboratorio se calculará la velocidad inicial de la reacción de la enzima Celobiasa.

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

Si quisiéramos calcular la actividad enzimática en mmoles de sustrato por minuto, se debe

Si despejamos la concentración, tenemos que C= A / ε * l

Por otro lado, si reemplazamos A por m * V ensayo, donde:

La actividad de la enzima queda expresada en unidades de velocidad:

Departamento de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad San Sebastián

En este práctico calcularemos la velocidad inicial de la reacción mediante el cálculo de la

I.- Construcción de curva de estándar de p-nitrofenol: