Práctica No 4 - Algunas Propiedades Químicas de Los Aminoácidos y Las Proteínas - 2022

Práctica No.
4
ALGUNAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS Y LAS PROTEÍNAS
Primer semestre 2022
________________________________________________________________________________
GUÍA GENERAL DE LA PRÁCTICA EN MODALIDAD VIRTUAL
Actividad Descripción Fecha
Estudio del tema Los estudiantes deberán: Previo a iniciar

la práctica de
Leer y analizar críticamente los documentos: laboratorio
• “Práctica No 4 Algunas propiedades químicas de Semana del 21
aminoácidos y proteínas_2022”
al 25 de febrero.
• “Anexo_medición de proteína en una muestra
problema”
Elaboración y Los estudiantes deberán realizar un pre-laboratorio
entrega del pre- que incluye:
laboratorio
● Diagrama de flujo de los procedimientos descritos
en: “Práctica No 4 Algunas propiedades químicas de
aminoácidos y proteínas_2022”
● Resolución del cuestionario que se presenta al final
del instructivo.
El pre-laboratorio se elabora de forma INDIVIDUAL y se A más tardar 5
entrega como PDF a través de la plataforma Moodle del minutos antes
Laboratorio PREVIO A INICIAR LA PRÁCTICA. del inicio de la
práctica.
Exámenes cortos Examen pre-laboratorio: se realizará durante los Examen pre:
primeros 15 minutos del período de laboratorio. Se
evaluará las bases teóricas de la práctica (instructivo y Semana del 21
anexo, indicados previamente). al 25 de febrero.
Examen post-laboratorio: se realizará durante los Examen post:

primeros 15 minutos de la práctica de la semana
Semana del 28
siguiente. Se evaluará la comprensión e interpretación
de febrero al 4
de los resultados obtenidos y algunos aspectos
de marzo.
importantes de los procedimientos realizados.
NOTA: Encender las cámaras en una reunión Zoom para
realizar los exámenes cortos.
USAC, FACULTAD DE CC QQ Y FARMACIA.
Escuela de Química Biológica, Departamento de Bioquímica. Práctica No. 4
Prácticas de laboratorio de Bioquímica I, primer semestre 2022 ALGUNAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE AA Y PROTEÍNAS
Explicación de los Los instructores de laboratorio brindarán, usando Día de la

fundamentos presentación Power Point y videos, una explicación de práctica
teóricos y los aspectos teóricos y prácticos de la determinación
procedimiento de de las propiedades químicas de aminoácidos y Semana del 21
al 25 de febrero.
la práctica, proteínas. Posteriormente explicarán el procedimiento
análisis de a realizar durante la práctica, la forma de analizar los
resultados y resultados y la forma de reportarlos. Se resolverán
forma de dudas de los estudiantes y a final de la práctica, cada
reportarlos. grupo de laboratorio recibirá resultados para ser
analizados e interpretados.
“Evaluaciones en Durante el desarrollo de la práctica, los estudiantes Durante la

tiempo real” deberán ir respondiendo evaluaciones en formularios práctica
de Google. Al responderlas, también estarán
registrando su asistencia. Semana del 21al
25 de febrero.
Material de apoyo Qualitative Analysis of Amino Acids - Amrita University

https://www.youtube.com/watch?v=wmhmAESv72E
Color reactions of Proteins : Biochemistry series
https://www.youtube.com/watch?v=RSAo9qPV5R4
Precipitation Reactions of Proteins : Biochemistry
https://www.youtube.com/watch?v=CyndI0rK1zE
IMPORTANTE: Se recomienda revisen el material de

apoyo previamente a la práctica.
Foro de preguntas Los estudiantes pueden hacer preguntas sobre la Semana previa a
práctica en el “Foro de discusión” en la plataforma la práctica
Moodle. El foro se habilitará durante la semana previa
a la práctica, y los instructores de laboratorio Semana del 14
responderán las preguntas en los días hábiles de la al 18 de febrero.
semana previa a la práctica.
Reporte de Cada grupo de laboratorio realizará un reporte escrito Semana

laboratorio: siguiendo las instrucciones del instructivo de posterior a la
“Elaboración de reportes de Laboratorio” que se práctica
Reporte escrito encuentra en el portal Moodle - Laboratorio de
grupal Semana del 28
Bioquímica I. El reporte se deberá entregar una
semana después de realizada la práctica, siguiendo las de febrero al 4
instrucciones del documento mencionado. Se de marzo, a más
habilitará un apartado por día y sección de laboratorio tardar 5
para su entrega en la plataforma Moodle. minutos antes
del inicio de
laboratorio.
2
PONDERACIÓN DE LA PRÁCTICA
Actividad Punteo por Punteo total Porcentaje de la

práctica de laboratorio nota de
laboratorio
sobre la zona
total del curso
Examen corto pre práctica 0.40 p 4.5 p
Examen corto post práctica 0.40 p 4.5 p
“Evaluación en tiempo real” 0.30 p 3.0 p
Reporte 0.40 p 4.5 p
20%
Pre-laboratorio (diagramas de flujo y 0.25 p 1.0 p
cuestionarios)
Examen final de laboratorio - 2.5 p
Total 1.75 p 20 p
Individual
Grupo de laboratorio
INTRODUCCIÓN
Los aminoácidos son compuestos que tienen un grupo funcional carboxilo y un grupo
funcional amino unido a un mismo carbono (alfa); los otros dos enlaces están formados con
un átomo de hidrógeno y con un grupo de átomos distintivo denominado grupo R o cadena
lateral. La reactividad de los aminoácidos depende de las características químicas de los
grupos carboxilo, amino y los grupos funcionales de los grupos R.
Las proteínas se encuentran en todos los sistemas biológicos, siendo el grupo de

macromoléculas más diverso; se presentan en diferentes tamaños, localizaciones celulares,
estructuras tridimensionales y cumpliendo las más diversas funciones. Desde el punto de
vista cuantitativo, las proteínas son la clase más abundante de biomoléculas, pues
representan más del 50% del peso seco de las células (Nelson & Cox, 2017).
Todas las proteínas se construyen a partir de los mismos 20 aminoácidos, unidos

entre sí por medio de enlaces covalentes llamados enlaces peptídicos. Los aminoácidos
tienen tres tipos de reacciones químicas importantes: (1) reacciones debido a la presencia
del grupo carboxilo (-COOH), (2) reacciones debidas al grupo amino (-NH2), y (3) reacciones
debido al grupo R. Las reacciones debidas al grupo carboxilo y al grupo amino son generales
y se dan para todos los aminoácidos. Las reacciones de la cadena lateral R son reacciones
específicas; pueden servir de base para la identificación específica de proteínas, por
ejemplo, la cisteína da una reacción para azufre, el triptófano da ciertas reacciones de color
debido a que su molécula contiene el grupo indol, la tirosina da otras reacciones de color
debido a su grupo fenólico, etc. Ya que la mayoría de las proteínas contienen uno o más
residuos de estos aminoácidos, algunas de las reacciones de color que son específicas para
3
aminoácidos individuales se usan como reacciones de color generales para proteínas

(Robert & White, 1990; Wilson & Walker, 2000).
La detección de aminoácidos y proteínas se puede realizar por medio de

procedimientos físicos, químicos o biológicos. Por ejemplo: la presencia de aminoácidos
con un grupo aromático en su cadena lateral (Fen, Tir) o un anillo indol (Trp), puede ser
detectada por medio de la medición de su absorbancia al ser enfrentados a luz ultravioleta
(280 nm) (Nelson & Cox, 2009).
Existen reacciones que dan positivas para todas las proteínas, por lo que se pueden
usar para cuantificarlas. La reacción de Biuret permite cuantificar de forma específica la
presencia de enlaces peptídicos a través de la reacción del sulfato de cobre con el enlace
peptídico en un medio alcalino. Esta reacción produce un compuesto púrpura cuya
absorbancia máxima se observa a 540 nm. Otros métodos, como el de Folin o de Lowry et
al y la reacción de Bradford, se desarrollaron ya hace tiempo, pero se siguen utilizando para
cuantificar proteínas de manera sencilla y precisa (Cozzone, 2002; Lasseter, 2020).
Otra forma de identificar proteínas es a través de reacciones de sus grupos

prostéticos. Una importante cantidad de proteínas presentan uniones covalentes con
moléculas de carbohidratos simples o complejos (glicosilación). De esta forma, la utilización
de reacciones que permitan la identificación de carbohidratos permite, de manera indirecta,
identificar proteínas glicosiladas (Cozzone, 2002).
La presente práctica, en su modalidad virtual, consistirá en (a) la utilización de un

simulador para la determinación cualitativa de aminoácidos, (b) la revisión de diversas
metodologías (con énfasis en sus principios y procedimiento) para la determinación de
algunas propiedades químicas (generales y específicas) de las proteínas, y la interpretación
de resultados que se obtendrían al analizar una serie de proteínas (albúmina de huevo,
caseína, gelatina), una mezcla de péptidos -producto de una hidrólisis parcial de proteínas-
(peptona), y un aminoácido (glicina) con las metodologías indicadas, y (c) revisión de una
metodología para la cuantificación de proteínas en suspensión, y el análisis e interpretación
de los resultados que se obtendrían al analizar una muestra problema.
OBJETIVOS
Al finalizar la práctica, el estudiante deberá estar en capacidad de:
• Explicar el principio y el procedimiento para la caracterización cualitativa de

aminoácidos y proteínas.
• Explicar la relación existente entre los aminoácidos que constituyen una proteína y
las características químicas de la misma.
• Explicar la diferencia entre reacciones generales y específicas de las proteínas.
4
• Describir el principio y el procedimiento para la determinación de la concentración

de una proteína en suspensión.
• Realizar los cálculos para determinar la concentración de proteína en una muestra
problema.
MATERIALES Y EQUIPO PARA LA PRÁCTICA VIRTUAL
• Computadora, conexión a internet y simulador en línea.

• Procedimientos (anexos 2 y 3), y resultados que se obtendrían de aplicar las
metodologías descritas.
PROCEDIMIENTO
En su modalidad virtual, la práctica consistirá en los siguientes 3 aspectos:
A. ANÁLISIS CUALITATIVO DE AMINOÁCIDOS
1. Fundamento:
Al exponer una alícuota de un aminoácido a la presencia de compuestos químicos, este
reaccionará o no dependiendo de los grupos funcionales presentes en el aminoácido.
La reacción se puede notar por un desarrollo o cambio de color, formación de
precipitados, etc.
En su modalidad virtual, se utilizará un sitio en línea que simula las reacciones y sus
resultados. En este se pueden simular las pruebas de la ninhidrina, xantoproteica, de
Pauli, de Million, de Hopkins Cole y del sulfuro de plomo.
2. Parte experimental:
- Conectarse al simulador de la práctica “Qualitative Analysis of Amino Acid” en el sitio

de la Amrita University, usando el siguiente enlace:
https://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=63&sim=1094&cnt=4
- Marcar la opción para poner el simulador en pantalla completa:
5
Pantalla
completa
- Revisar la ayuda del simulador. Si se tiene alguna duda sobre el procedimiento de cada
prueba, consultar la sección de procedimientos de las metodologías, en el enlace:
https://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=63&sim=1094&cnt=2
Ayuda/
instruciones
Cuadro de diálogo
con instruciones
- Llevar a cabo la simulación, hasta haber realizado todas las pruebas siguientes:
• Ninhidrina
• Xantoproteica
• Diazo de Pauli
• De Million
• Hopkins Cole
• Sulfuro de plomo
- En caso que el resultado no permita avanzar para realizar las pruebas restantes,
reiniciar la simulación (RESET).
6
- Registrar con capturas de pantalla el procedimiento realizado.
- Resumir los resultados de la simulación como se describen los resultados de una

marcha analítica.
B. ANÁLISIS CUALITATIVO DE PROTEÍNAS
1. Fundamento:
Estructuras características de las proteínas, como los enlaces peptídicos, los grupos R
de los residuos aminoacídicos o sus grupos prostéticos, definen la forma en que una
proteína reaccione ante ciertos reactivos.
Reacciones como la de Biuret, dan resultado positivo en muestras que contengan
cualquier tipo de proteína, mientras que otras pueden ser más específicas; la
Xantoproteica da positivo con proteínas con residuos aminoacídicos fenólicos y la de
Molisch con proteínas que tengan carbohidratos como grupos prostéticos. Por otro
lado, las proteínas globulares, dependiendo de su interacción con reactivos alcaloidales
y/o ácidos fuertes pueden coagular o precipitar.
2. Parte experimental:
- Revisar en el anexo 2, y en los videos del anexo 1, recursos en línea, los principios y
procedimientos de las siguientes pruebas para el análisis cualitativo de proteínas:
• Biuret
• Xantoproteica
• Molisch
• Precipitación de proteínas por reactivos alcaloidales
• Precipitación de proteínas por ácidos perminerales fuertes
- El instructor entregará a cada grupo de laboratorio una serie de resultados (Tabla No.
1), los cuales se obtendrían al realizar las pruebas indicadas a las siguientes muestras:
• Glicina
• Peptona
• Caseína
• Gelatina
• Albúmina
- Analizar, discutir y llegar a las conclusiones correspondientes, usando la información

del anexo 1 y la tabla No. 1.
7
C. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD
1. Fundamento
El colorante Coomassie Azul Brillante G-250 convierte su forma roja en la forma azul
cuando se adsorbe a una proteína, con lo cual modifica su espectro de absorción. La
unión con la proteína estabiliza la forma azul del colorante Coomassie, por lo que la
cantidad de complejo de la solución es proporcional a la cantidad de proteína presente
en la muestra, y se puede estimar por espectrofotometría. El aumento de la
absorbancia a 595 nm es proporcional a la cantidad de colorante unido, y por lo tanto
a la cantidad de proteína presente en la muestra (González et al, 2014).
2. Parte experimental
- Revisar en el anexo 3 los principios y procedimientos para la cuantificación de

proteínas por el Método de Bradford
- El instructor entregará a cada grupo de laboratorio una serie de resultados de una

curva de calibración (Tabla No. 2), y los valores de absorbancia que se generarían al
cuantificar por triplicado una muestra problema y sus respectivas diluciones.
- Generar una curva patrón como se indica en el anexo 2, y calcular la concentración de

proteína que tendría la muestra problema.
DIAGRAMA DE FLUJO
Esquematice el procedimiento a emplear en la realización de la práctica.
CUESTIONARIO
Reacción de Biuret
1. Describa las bases químicas de la reacción.
2. ¿Por qué debe ser alcalina la solución?
3. ¿Cuál es el mínimo de aminoácidos que deben estar presentes para que la reacción
resulte positiva?
4. Escriba la fórmula del complejo que se forma.
5. ¿Dan todas las proteínas positiva la reacción? Explique.
6. Explique por qué el amonio interfiere en la reacción de Biuret.
Reacción xanto proteica:
7. ¿Por qué el ácido nítrico colorea la piel de amarillo?
8. ¿Todas las proteínas dan positiva la reacción xanto proteica?
8

Reacción de Molish
10. Describa las bases químicas de la reacción de Molish.
11. Mencione al menos 5 proteínas que tienen carbohidratos como grupo prostético.
Reacción de Bradford
12. Describa las bases químicas de la prueba de Bradford.
13. Explique las similitudes y diferencias entre la cuantificación de proteínas por el método
de Bradford y el de Lowry (Folin).
BIBLIOGRAFÍA
Guatemala, febrero 2022

Departamento de Bioquímica
Elaboración de modalidad virtual y versión 2022 Dr. Rubén Velásquez
9
ANEXO 1
RECURSOS EN LÍNEA
Qualitative Analysis of Amino Acids - Amrita University

https://www.youtube.com/watch?v=wmhmAESv72E
Duración: 8 min 15 seg
Idioma: Inglés
Subtítulos: Inglés
Color reactions of Proteins: Biochemistry series

https://www.youtube.com/watch?v=RSAo9qPV5R4
Idioma: Inglés
Subtítulos: Inglés, con posibilidad de traducción simultánea al español
00:35 Biuret
2:33 Ninhydrin
4:25 Xantoproteic
6:21 Millon's
7:22 Sakaguchi
8:38 Sulfur/Lead sulfide
10:13 Pauly's
11:30 Aldehyde/Hopkins-Cole
Precipitation Reactions of Proteins: Biochemistry

https://www.youtube.com/watch?v=CyndI0rK1zE
Idioma: Inglés
5:45 Precipitación por metales pesados
6:31 Precipitación por ácidos minerales Fuertes
6:57 Precipitación por ácidos orgánicos
Qualitative Analysis of Proteins - MeitY OLabs

https://www.youtube.com/watch?v=OsdhNtNNNds
Idioma: Inglés
Qualitative Analysis of Proteins- This video explains some simple tests of proteins.
10
ANEXO 2
REACCIONES DE CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS
*los resultados de esta sección se registran en la Tabla 1*
MATERIAL Y EQUIPO
• Tubos de ensayo
• Pipetas volumétricas
• Micropipetas (5-50 ul; 50-100 ul; 500-1,000 ul)
• Puntas para micropipetas
• Beaker o baño de agua
• Gradilla
• Pinzas
• Estufa
• Vórtex
• Espectrofotómetro
REACTIVOS
• Glicina, peptona, caseína, gelatina y albúmina de huevo al 5%

• Hidróxido de sodio 6 N
• Sulfato de cobre al 0.5%
• Ácido nítrico concentrado
• α-naftol al 5% en etanol al 95% (preparar antes de su uso)
• Ácido sulfúrico concentrado
• Ácido tricloroacético al 10%
• Ácido clorhídrico concentrado
• Agua destilada
• Solución de albúmina sérica bovina (BSA) 1 mg/mL
• Reactivo de Bradford (Sigma-Aldrich o BioRad)
• Muestra de concentración desconocida de proteína
1. REACCIÓN DE BIURET
1.1 Fundamento
El ión cobre formará un complejo con las proteínas de una manera similar al que forma
con el amonio. El complejo en el caso de las proteínas es rojo o violeta, y azul en el caso
del amonio. Los aminoácidos libres y los dipéptidos no dan el color rojo o violeta, pues
se necesita al menos dos uniones peptídicas para obtener dicha coloración. La
sustancia más simple que tiene esa estructura requerida es Biuret (NH 2CONH2)2 y ésta
es la razón por la cual la reacción lleva ese nombre (Cozzone, 2002; Nelson & Cox, 2009).
11
1.2 Parte experimental
Llevar a cabo la reacción de Biuret en las soluciones de glicina peptona, caseína, gelatina
y albúmina de huevo al 5%. A 2 mL de cada una de las soluciones anteriores agregar 2
mL de hidróxido de sodio 6 N y una gota de solución de sulfato de cobre al 0.5%, mezclar
bien y agregar más sulfato de cobre gota a gota hasta distinguir un color rosado o
violeta, si el color no aparece luego de agregar 15 gotas dejar reposar el tubo durante
10 ó 15 min. Anotar cualquier diferencia en el color obtenido de las diferentes
soluciones.
1.3 Descarte de cobre
2. REACCIÓN XANTO PROTEICA
2.1 Fundamento
Esta reacción es específica para proteínas que contienen aminoácidos aromáticos,

especialmente triptófano. Si se le agrega hidróxido de sodio al ácido nítrico la
fenilalanina dará positiva a esta reacción (Cozzone, 2002).
Hacer la reacción en las soluciones de glicina, peptona, gelatina, caseína y albúmina al

5%. Colocar 2 mL de cada una de las soluciones en tubos de ensayo previamente
identificados y agregar 2 mL de ácido nítrico concentrado a cada tubo. Calentar a
ebullición muy lentamente o hasta que se disuelva el precipitado que se formó al
agregar el ácido, enfriar la solución y agregar 4 mL de hidróxido de sodio 6 N. El color
amarillo cambia a naranja.
2.3 Desechos básicos
3. REACCIÓN DE MOLISCH
3.1 Fundamento
La reacción de Molisch es general para carbohidratos. Como consecuencia, las

glicoproteínas dan positiva esta reacción, por ser proteínas conjugadas que contienen
carbohidratos como grupo prostético. En esta reacción los carbohidratos son
deshidratados por ácidos fuertes a furfural o derivados de furfural el cual se condensa
con el α-naftol para formar un producto coloreado rojo violeta (Cozzone, 2002; Nelson
& Cox, 2017).
12
A 2 mL de las soluciones de glicina, caseína, albúmina, gelatina y peptona al 5% agregar

2 gotas de solución de α -naftol al 5% en etanol al 95% (NO MEZCLAR), y
cuidadosamente agregar ácido sulfúrico concentrado resbalándolo por las paredes del
tubo para formar dos capas. En la unión de las dos capas aparecerá un anillo rojo
violeta, el cual indica la presencia de carbohidratos.
3.3 Desechos de α-naftol
4. PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR REACTIVOS ALCALOIDALES
4.1 Fundamento
A esta clase de reactivos se les llama de esa forma porque tienen la propiedad de
precipitar a los alcaloides, aunque se utilicen en cantidades pequeñas. Como ejemplo
de estos reactivos tenemos: ácido tricloroacético, ácido tánico, ácido pícrico, ácido
salicílico y ácido metafosfórico. Los ácidos se combinan con las proteínas (las cuales
tienen una carga positiva neta en el lado ácido del punto isoeléctrico), para formar
complejos insolubles en los cuales la proteína y los aniones están unidos por uniones
electrostáticas. Estas reacciones son muy usadas para separar a las proteínas de fluidos
biológicos (Cozzone, 2002).
Colocar en tubos de ensayo distintos 2 mL de las soluciones de glicina, caseína,

albúmina, gelatina y peptona al 2 %, y agregar 2 mL de ácido tricloroacético al 10 %
(v/v). Observar la presencia de precipitado.
4.3 Desechos de ácido tricloroacético
5. PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR ÁCIDOS MINERALES FUERTES
5.1 Fundamento
Los ácidos minerales fuertes desnaturalizan ciertas proteínas y causan que ellas se
vuelvan insolubles en soluciones acuosas. Esta propiedad de las proteínas es usada
frecuentemente en la clínica, para determinar si la albúmina está presente en la orina
(Cozzone, 2002).
Colocar 3 mL de las soluciones de albúmina de huevo, peptona y gelatina al 5%, en

distintos tubos de ensayo, agregar ácido nítrico concentrado resbalando éste por las
13
paredes, para formar una capa abajo de la solución de la proteína. Observar el

precipitado que se forma en la unión de las dos capas. En otra serie de tubos, repetir
la reacción con ácido clorhídrico concentrado.
5.3 Desechos ácidos
6. Resultados
Tabla No 1:
Algunas propiedades químicas de las proteínas
Proteínas
Reacción Glicina Peptona Caseína Gelatina Albúmina
Biuret
Xantoproteíca
Molisch
Precipitación de
proteínas por reactivos
alcaloidales
Precipitación
HNO3 NA NA
de proteínas
por ácidos
minerales
HCl NA NA
fuertes
14
ANEXO 3
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD
1. Fundamento
El colorante Coomassie Azul Brillante G-250 convierte su forma roja en la forma azul
cuando se adsorbe a una proteína, con lo cual modifica su espectro de absorción. La
unión con la proteína estabiliza la forma azul del colorante Coomassie, por lo que la
cantidad de complejo de la solución es proporcional a la cantidad de proteína presente
en la muestra, y se puede estimar por espectrofotometría. El aumento de la
absorbancia a 595 nm es proporcional a la cantidad de colorante unido, y por lo tanto
a la cantidad de proteína presente en la muestra (González et al, 2014).
2. Parte experimental
Preparar una serie de tubos de ensayo con distintas concentraciones conocidas de

albúmina de suero de res (bovino), con el siguiente esquema de pipeteo:
Tubo No.
1 2 3 4 5 6 7 8
Volumen de solución
ul de albúmina sérica bovina 1 mg/ml 0 5 20 35 50 65 80 100
ul de H2O destilada 100 95 80 65 50 35 20 0
A cada tubo (1-8) agregar 1 mL del reactivo de Bradford y mezclar. Dejar reposar por al
menos 5 minutos. Leer la absorbancia a 595 nm de los tubos 2 al 8, usando el tubo No.
1 como blanco. *registrar los resultados en la Tabla 2*
Trazar una gráfica con la concentración de proteína (albúmina sérica bovina) en el eje
horizontal (x) y las respectivas absorbancias en el eje vertical (y). Calcular la ecuación
de la recta de esta “curva patrón”.
Medir por triplicado la absorbancia de 100 ul de la muestra desconocida en la forma

como se obtuvo (muestra sin diluir); repetir la medición por triplicado con una muestra
diluida. Dependiendo de la absorbancia del ensayo con las muestras sin diluir, se puede
hacer diluciones que varíen entre 1+1, hasta 1+5. *registrar los resultados en la Tabla
3*
Usar estos valores de absorbancia de la muestra problema y la ecuación de la “curva

patrón” para calcular la concentración de proteína.
3. Desechar la mezcla de análisis
4. Resultados
15
Tabla No. 2:
Cuantificación de proteínas por el método de Bradford
Curva patrón
Concentración BSA Absorbancia

Tubo No. (mg/ml) (595 nm)
1
2
3
4
5
6
7
8
Tabla No. 3:
Cuantificación de proteínas por el método de Bradford
Resultados de la muestra problema No ________
No. Abs (595 nm)

Repetición Sin diluír Dilución (1 + __)
1
2
Guatemala, febrero 2022

Departamento de Bioquímica
Elaboración en modalidad virtual y versión 2022 Dr. Rubén Velásquez
16
Práctica No. 4
ALGUNAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS Y LAS PROTEÍNAS
Melva Mariela Cux Cutzal

201604364
CUESTIONARIO
Reacción de Biuret
En la reacción de biuret, una estructura peptídica que contiene por lo menos dos enlaces
peptídicos produce una coloración violeta cuando se trata con sulfato de cobre alcalino. El
complejo de coordinación coloreado se forma entre el ion Cu2 + y el oxígeno del carbonilo
(> C = O) y el nitrógeno amídico (= NH) del enlace peptídico. (Aryal, 2020)
2. ¿Por qué debe ser alcalina la solución?

Porque cuando hay presencia de una solución alcalina, el ión cobre II de color azul puede
formar un complejo con los enlaces peptídicos, ya que el péptido tiene pares de electrones
no compartidos en nitrógeno y oxígeno del agua. (Aryal, 2020)
3. ¿Cuál es el mínimo de aminoácidos que deben estar presentes para que la reacción
resulte positiva?
Son necesarios al menos 2 o 3 aminoácidos, para un cambio de color significativo y medible
con estos reactivos. (Bosisio, 2005)
4. Escriba la fórmula del complejo que se forma.
(Barragan F., Valle J., 2014)
5. ¿Dan todas las proteínas positiva la reacción? Explique.

Esta prueba se realiza mediante compuestos que contienen dos o más enlaces peptídicos
(grupo CO-NH). Dado que todas las proteínas y péptidos poseen al menos dos enlaces
peptídicos, es decir, el tripéptido da positivo en la prueba de Biuret. (Aryal, 2020)
6. Explique por qué el amonio interfiere en la reacción de Biuret.

Porque puede reducir el ion cúprico en medio alcalino produciendo resultados
insatisfactorios. (Moore, Devries, Lipp, Griffiths and Abernethy, 2010)
Reacción xanto proteica:
7. ¿Por qué el ácido nítrico colorea la piel de amarillo?
Son el resultado de una reacción de xantoproteína. El ácido xantoproteico se forma cuando
el ácido nítrico reacciona con los aminoácidos o la queratina de la piel, y esta reacción
produce el tinte amarillo. (Aryal, 2020)
8. ¿Todas las proteínas dan positiva la reacción xanto proteica?

La mayoría de proteínas mostrarán una reacción positiva en esta prueba, dado que la
mayoría de las proteínas contienen uno o ambos de estos aminoácidos. (Aryal, 2020)

La prueba xantoproteica se basa en el hecho de que los grupos aromáticos de los
aminoácidos se nitran mediante calentamiento con HNO3 concentrado para producir un
derivado nitro de color amarillo intenso. Sin embargo, tras la adición de álcali, el residuo se
vuelve naranja debido a la formación de una sal de la forma tautomérica del compuesto
nitro. (Aryal, 2020)
Reacción de Molish
10. Describa las bases químicas de la reacción de Molish.
La reacción se basa en el hecho de que el ácido concentrado cataliza la deshidratación de
los azúcares para formar furfural (a partir de pentosas) o hidroximetilfurfural (a partir de
hexosas). Cuando los monosacáridos se tratan con H2SO4 concentrado o HCl concentrado,
el grupo -OH del azúcar se elimina en forma de agua y el furfural se forma a partir del
azúcar pentosa y el hidroximetil furfural se forma a partir del azúcar hexosa. Estos
productos reaccionan con el α-naftol sulfonado para dar un complejo de color púrpura (rojo
violeta). (Murray, Bender, Botham, Kennelly, Rodwell y Weil, 2009)
11. Mencione al menos 5 proteínas que tienen carbohidratos como grupo prostético.
● inmunoglobulina G
● Glicoproteínas
● Colágeno
● Fosfata Alcalina (FA)
● Lectinas
(Murray, et al., 2009)
Reacción de Bradford
12. Describa las bases químicas de la prueba de Bradford.
El método se basa en la unión específica del colorante azul de Coomassie brillante G250
(CBBG) a los residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe de las proteínas. El CBBG se une a los
residuos de las proteínas produciendo una absorbancia máxima a 595 nm, mientras que el
colorante libre tiene una absorbancia máxima a 470 nm. El desarrollo del color en los
ensayos de proteínas de Bradford está asociado con la presencia de ciertos aminoácidos
básicos (principalmente arginina, lisina e histidina) en la proteína. (Bradford, 2004)
13. Explique las similitudes y diferencias entre la cuantificación de proteínas por el método
de Bradford y el de Lowry (Folin).
Similitudes
● El ensayo de proteínas de Bradford y Lowry son dos ensayos bioquímicos que
determinan la concentración de proteínas en una solución de muestra.
● Poseen el mismo principio de detección de proteínas
● Ambos ensayos utilizan técnicas colorimétricas para proporcionar resultados.
Diferencias
● La lectura de absorbancia es de mayor y mejor precisión con el método de Lowry
que con el de Bradford.
● El procedimiento de Lowry proporciona una mejor linealidad a altas concentraciones
de proteínas y una mejor estabilidad una vez que se ha desarrollado el color.
● En el método de Lowry se utiliza un segundo reactivo, el cual se agrega para
incrementar la intensidad del color.
● El método de Bradford consiste en 1 etapa mientras que el de Lowry consiste en 2
etapas, por lo tanto, el método de Bradford se realiza en menor tiempo.
● El ensayo de proteínas de Bradford se basa en el cambio de absorbancia del
colorante azul brillante Coomassie G-250, mientras que el ensayo de proteínas de
Lowry se basa en la reacción de iones de cobre (Cu +) producidos por la oxidación
de enlaces peptídicos con el reactivo de Folin- Ciocalteu.
● El método de Bradford depende de la composición del aminoácido y el de Lowry
depende parcialmente de la composición del aminoácido.
(Thermo Fischer Scientific, s.f)
Referencias
Aryal, S. (2020) Biuret test for protein. Biochemistry microbe Notes, Online Microbiology
and Biology Study Notes. Recuperado de:
https://microbenotes.com/biuret-test-for-protein/
Barragan F., Valle J., (2014). Reacción de Biuret: Prácticas de laboratorio de bioquímica.
Recuperado el 17 de febrero del 2022 de:
http://bioqingquim6.blogspot.com/2014/07/escuela-superior-politecnica-de_7321.html
Bosisio, B. (2005) Proteins: Physiological Samples. Encyclopedia of Analytical Science (2nd

Ed.) Recuperado de:
https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/biuret
Bradford, M. (2004) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical
Biochemistry, Vol. 72, Issue 1-2, pp. 248-254. Recuperado de:
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0003269776905273?via%3Dihu
b
Moore, J., DeVries, J., Lipp, M., Griffiths, J. and Abernethy, D. (2010) Total Protein Methods
and Their Potential Utility to Reduce the Risk of Food Protein Adulteration. Wiley
Online Library: Comprenhensive Reviews in Food Science and Food safety, Vol. 9
Issue 4 pp. 330-357. Recuperado de:
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1541-4337.2010.00114.x
Murray, R., Bender, D., Botham, K., Kennelly, P., Rodwell, V. y Weil, P. (2009) Harpers
illustrated Biochemistry (28th Ed.) McGraw Hill Lange Medical
Thermo Fisher Scientific (s.f) Chemistry of Protein Assays. Recuperado el 17 de febrero del
2022 de :
https://www.thermofisher.com/gt/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-
learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/chemistry-pro
tein-assays.html
Diagrama de Flujo
A. Análisis cualitativo de aminoácidos-Modalidad Virtual
Llevar a cabo la
Entrar al simulador de la práctica
Registrar con capturas
Revisar la ayuda simulación, hasta haber
“Qualitative Analysis of Amino Acid”
de pantalla el
del simulador realizado todas las
utilizando el enlace proporcionado procedimiento realizado
pruebas
Resumir resultados
de la simulación, igua a
los resultados de una
marcha analítica
B. Análisis cualitativo de proteínas-Parte experimental

1. Reacción de Biuret
Tomar las soluciones Agregar a c/2 mL de Mezclar y gregar Agregar 15 gotas
distinguir
de glicina peptona, caseína, solución 2 mL de NaOH 6N más CuSO4 gota dejar reposar el
un color rosado o
gelatina y albúmina de y una gota de solución de a gota tubo durante
violeta
huevo al 5%. sulfato de cobre al 0.5%, 10 ó 15 min
Anotar cualquier difere-
Descartar Cu
ncia en el color obtenido
2. Reacción de Xanto proteica
Tomar las soluciones

Agregar 2 mL de ácido Anotar cambio de
de glicina peptona, caseína, Hata que el precipi-

Agregar 4 mL de
nítrico concentrado a
color, de amarillo
gelatina y albúmina de tado disuelva NaOH 6 N

cada tubo a naranja
huevo al 5%.
Descartar dese-
chos básicos
3. Reacción de Molisch
Agregar H2SO4
Agregar 2 mL de las soluciones
Agregar 2 gotas de Observar presencia de
concentrado resbalándolo
de glicina, caseína, albúmina,
solución de α -naftol al carbohidratos, como un
gelatina y peptona al 5% 5% en etanol al 95% por las paredes del tubo anillo rojo violeta
para formar dos capas
Descartar dese-
chos de α -naftol
4. Precipitación de Proteínas por Reactivos Alcaloides
Colocar en tubos de ensayo

Agregar 2 mL de
distintos 2 mL de las soluciones bservar la presencia
Descartar desechos
ácido tricloroacético al
de glicina, caseína, albúmina, de precipitado de ácido tricloroacético
10 % (v/v)
gelatina y peptona al 2 %
5. Precipitado de Proteínas por Ácidos Minerales Fuertes
Colocar 3 mL de las solucio-

Agregar ácido nítrico Observar el Repetir la reacción
nes de albúmina de huevo,
concentrado resbalando precipitado en la unión con ácido clorhídrico
peptona y gelatina al 5%, en
éste por las de las dos capas concentrado
distintos tubos de ensayo
Descartar
esechos ácidos
Cuantificación de Proteínas por el método de Bradford
Preparar concentraciones Leer la absorbancia a

Agregar a cada tubo
conocidas de albúmina de Dejar reposar por al 595 nm de los tubos 2-8,
1 mL del reactivo de
suero de res (bovino), con la menos 5 minutos usando el tubo No.1
Bradford y mezclar.
info. del cuadro 1 como blanco
Trazar una gráfica con la

Medir por triplicado la Registrar los
Calcular la ecuación concentración de proteína en

absorbancia de 100 ul de resultados en la
de la recta el eje (x) y las respectivas

la muestra desconocid Tabla 2
absorbancias en el eje (y)
Calcular la concentración
Repetir la medición Registrar los

de proteína utilizando Desechar la mezcla
por triplicado con resultados en la

los valores calculados
de análisis
una muestra diluida Tabla 3
anteriormente

Práctica No 4 - Algunas Propiedades Químicas de Los Aminoácidos y Las Proteínas - 2022

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Práctica No.

GUÍA GENERAL DE LA PRÁCTICA EN MODALIDAD VIRTUAL

Actividad Descripción Fecha

Estudio del tema Los estudiantes deberán: Previo a iniciar

Examen post-laboratorio: se realizará durante los Examen post:

Explicación de los Los instructores de laboratorio brindarán, usando Día de la

“Evaluaciones en Durante el desarrollo de la práctica, los estudiantes Durante la

Material de apoyo Qualitative Analysis of Amino Acids - Amrita University

IMPORTANTE: Se recomienda revisen el material de

Reporte de Cada grupo de laboratorio realizará un reporte escrito Semana

Actividad Punteo por Punteo total Porcentaje de la

Las proteínas se encuentran en todos los sistemas biológicos, siendo el grupo de

Todas las proteínas se construyen a partir de los mismos 20 aminoácidos, unidos

aminoácidos individuales se usan como reacciones de color generales para proteínas

La detección de aminoácidos y proteínas se puede realizar por medio de

Otra forma de identificar proteínas es a través de reacciones de sus grupos

La presente práctica, en su modalidad virtual, consistirá en (a) la utilización de un

Al finalizar la práctica, el estudiante deberá estar en capacidad de:

• Explicar el principio y el procedimiento para la caracterización cualitativa de

• Describir el principio y el procedimiento para la determinación de la concentración

MATERIALES Y EQUIPO PARA LA PRÁCTICA VIRTUAL

• Computadora, conexión a internet y simulador en línea.

En su modalidad virtual, la práctica consistirá en los siguientes 3 aspectos:

A. ANÁLISIS CUALITATIVO DE AMINOÁCIDOS

- Conectarse al simulador de la práctica “Qualitative Analysis of Amino Acid” en el sitio

- Marcar la opción para poner el simulador en pantalla completa:

- Registrar con capturas de pantalla el procedimiento realizado.

- Resumir los resultados de la simulación como se describen los resultados de una

B. ANÁLISIS CUALITATIVO DE PROTEÍNAS

- Analizar, discutir y llegar a las conclusiones correspondientes, usando la información

C. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD

- Revisar en el anexo 3 los principios y procedimientos para la cuantificación de

- El instructor entregará a cada grupo de laboratorio una serie de resultados de una

- Generar una curva patrón como se indica en el anexo 2, y calcular la concentración de

Esquematice el procedimiento a emplear en la realización de la práctica.

9. Describa las bases químicas de la reacción.

Guatemala, febrero 2022

Qualitative Analysis of Amino Acids - Amrita University

Color reactions of Proteins: Biochemistry series

Precipitation Reactions of Proteins: Biochemistry

Qualitative Analysis of Proteins - MeitY OLabs

• Glicina, peptona, caseína, gelatina y albúmina de huevo al 5%

1.2 Parte experimental

1.3 Descarte de cobre

2. REACCIÓN XANTO PROTEICA

Esta reacción es específica para proteínas que contienen aminoácidos aromáticos,

2.2 Parte experimental

Hacer la reacción en las soluciones de glicina, peptona, gelatina, caseína y albúmina al

2.3 Desechos básicos

La reacción de Molisch es general para carbohidratos. Como consecuencia, las

3.2 Parte experimental

A 2 mL de las soluciones de glicina, caseína, albúmina, gelatina y peptona al 5% agregar

3.3 Desechos de α-naftol

4. PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR REACTIVOS ALCALOIDALES

4.2 Parte experimental

Colocar en tubos de ensayo distintos 2 mL de las soluciones de glicina, caseína,

4.3 Desechos de ácido tricloroacético

5. PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR ÁCIDOS MINERALES FUERTES

5.2 Parte experimental

Colocar 3 mL de las soluciones de albúmina de huevo, peptona y gelatina al 5%, en

paredes, para formar una capa abajo de la solución de la proteína. Observar el

5.3 Desechos ácidos