Bacillus y Clostridium

Bacillus
CAPITULO 53
Bacillus
Luis Bentancor
R
l género Bacillus está integrado por bacilos productores de endosporas, Gram po-
sitivos, aerobios o anaerobios facultativos. Algunos son móviles mediante flage-
los perítricos y otros poseen la capacidad de elaborar una cápsula. Presentan la
TO
habilidad de desarrollar sobre una variedad de sustratos y dentro de un amplio rango de
temperatura y pH, dependiendo de la especie.
Este género comprende un número importante de especies algunas de las cuales in-
tervienen en procesos de degradación de materia orgánica, otras elaboran enzimas con
actividad proteolítica y/o lipolítica, aplicables al ambiente en el cual se desarrollan, produc-
tos metabólicos de uso industrial, como alcoholes, vitaminas y compuestos con actividad
AU
antimicrobiana. En el laboratorio se suelen aislar con frecuencia como contaminantes de
las muestras clínicas. La facilidad de cultivo y la rapidez de su desarrollo permitieron la
elección de este género como un modelo útil para realizar estudios metabólicos y genéti-
cos, determinar secuencias cromosómicas, detectar bacteriófagos y plásmidos y manipular
alguno de estos elementos en desarrollos de ingeniería genética.
Un grupo reducido de especies son agentes de enfermedades de importancia en el
hombre y en los animales superiores, peces e insectos. Dentro de estos, el patógeno más
importante es Bacillus anthracis descripto por Robert Koch y Louis Pasteur a mediados del
A
siglo XIX. Los postulados de Koch constituyen la base de la Microbiología Médica y se de-
sarrollaron a partir de sus trabajos con esta bacteria. B. anthracis es el responsable de una
afección mortal de los animales, particularmente bovinos y ovinos, de distribución mundial
PI
y transmisible accidentalmente al hombre, es decir una zoonosis, denominada carbunclo.
Taxonomía
O
El género Bacillus pertenece al Dominio Bacteria, Reino Eubacteria, Phylum Firmicutes,

Clase Bacilli, Orden Bacillales, Familia Bacillaceae. Comprende un amplio y heterogéneo
grupo de bacterias de las que se han descripto más de 80 especies. La especie tipo es
B. subtilis. La diversidad biológica y en algunos casos genética ha llevado a una nueva
C
agrupación y a la inclusión de algunas especies en otros géneros como son Brevibacillus,

Geobacillus o Paenibacillus.
Dentro del género Bacillus se menciona el “grupo Bacillus cereus”, integrado por siete
especies de bacilos con un origen filogenético común y que comparten caracteres geno y
fenotípicos. La clave de los determinantes de virulencia del “grupo B. cereus” reside en la
especificidad de hospedador y en la patogenia causada, cuya base genética se encuentra
en pequeñas porciones de sus genomas, como elementos móviles con capacidad de trans-
mitirse y adquirirse.
Los integrantes de este grupo son Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus thuringien-
sis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus weihenstephanensis y Bacillus
cytotoxicus. Se encuentran muy distribuidos en la naturaleza y ocupan una variedad de
nichos ecológicos.
Microbiología Veterinaria 657

Bacillus
R
Figura 1. Bacillus anthracis. Izquierda Coloración de Gram, Derecha: Verde de Malaquita.
Bacillus anthracis
TO
Características generales
Es un bacilo grampositivo, recto, con los extremos truncados, grande, inmóvil, de 1 a 3
mm por 5 a 8 mm. En extendidos de sangre provenientes de animales infectados se pueden
observar bacilos rectos o ligeramente curvados con los extremos redondeados, aislados o
en pares rodeados por una cápsula o, en algunos casos, formando cortas cadenas y con
sus extremos truncados. La cápsula está formada por una capa polimerizada de ácido
AU
poliglutámico y sólo se desarrolla en el hospedador. In vitro, esta cápsula se produce si al
medio de cultivo se le agrega suero, bicarbonato y anhídrido carbónico, creando condicio-
nes similares a las presentes en el tejido vivo. En los medios comunes de laboratorio no se
forma. Se puede demostrar su presencia en improntas a partir de materiales de necropsia
mediante la técnica de M’ Fadyean, coloreando con azul de metileno, Giemsa o Violeta de
Genciana. De esta forma se evidencia un material amorfo alrededor de los bacilos, de color
púrpura rosado, en correspondencia con la cápsula desintegrada (Figura 1).
A
B. anthracis forma esporas elipsoidales, de ubicación central, que no se detectan en el

individuo infectado y se forman con facilidad en contacto con el oxígeno y en los medios
de cultivo. La esporulación se produce al final de la fase de crecimiento exponencial y el
PI
protoplasma residual del bacilo se desintegra una vez que estas se han formado comple-
tamente.
Características culturales
O
Es una bacteria aerobia y anaerobia facultativa. No es exigente y desarrolla en medios

de cultivo simples entre 24 y las 36 horas a 37 ºC, con un límite de temperatura entre los
12 y los 44 ºC.
En medios sólidos forma colonias grandes, elevadas, granulosas, con bordes irregula-
C
res, blanco grisáceas de 2 a 3 mm de diámetro. Observadas con lupa o microscopio de

bajo aumento muestran el aspecto característico, con filamentos, semejando una “cabelle-
ra de medusa”. Estas colonias de apariencia rugosa (R) corresponden a cepas virulentas.
En los extendidos realizados a partir de ellas se pueden observar largas cadenas de
bacilos, con esporas centrales no deformantes semejando una “caña de bambú”. Con pos-
teriores subcultivos in vitro se pueden transformar en variantes lisas (S), más pequeñas y
con menor virulencia. En los medios con bicarbonato, suero y CO2, con el desarrollo de la
cápsula, las colonias son mucoides (M) y blanquecinas. En agar sangre no produce hemó-
lisis lo cual es una característica diferencial con otras especies de bacilos (Figura 2).
En los medios líquidos produce flóculos finos y sedimento en el fondo. Suele desarrollar
película que flocula rápidamente. En tubos de gelatina sembrados por punción crece desde
la superficie hacia el fondo semejando un pino invertido y no la licúa o lo hace en forma muy
lenta. Produce catalasa y fermenta varios hidratos de carbono con producción de ácido.
658 Microbiología Veterinaria

Bacillus
La identificación bioquímica rara vez resulta

necesaria para el diagnóstico.
Los medios de cultivo con el agregado de
0,5 UI /ml de penicilina inducen la transfor-
mación de los bacilos en estructuras esfé-
ricas, redondeadas, semejando un “collar
de perlas”. Esto también se puede lograr
colocando un disco con 10 UI de penicilina
G sobre la superficie de una placa con Agar
Müeller Hinton sembrada con el bacilo. Lue-
go de tres horas de incubación a 37 ºC se
puede detectar esta característica.
R
Resistencia Figura 2. Colonias de Bacillus en agar sangre.
Las formas vegetativas poseen la resis-
TO
tencia común de los bacilos no esporulados, su punto térmico letal es de 60 ºC en 30
minutos.
En los cadáveres de individuos infectados si permanecen entre 25 y 30 ºC, sin que el
interior tome contacto con el oxígeno ambiental, no tiene oportunidad de esporular y difícil-
mente resulte viable luego de 4 o 5 días en estas condiciones. Aquí además, se establece
una competencia con otros microorganismos implicados en el proceso de putrefacción,
como clostridios, enterobacterias o Pseudomonas, cuyas bacteriocinas actúan rápidamen-
AU
te sobre muchas cepas de B. anthracis.
En cambio, si los cadáveres permanecen a temperaturas entre 5 y 10 ºC, se puede re-
cuperar hasta después de un mes, aun cuando no haya esporulado. En contacto con el
oxígeno esporula fácilmente dentro de los 60 minutos y resulta altamente resistente a los
agentes ambientales como calor, radiaciones, presiones y compuestos químicos. Puede
sobrevivir durante largos periodos contaminando el suelo.
B. anthracis es naturalmente sensible a penicilina y la aparición de cepas de campo que
A
presentan resistencia es escasa. La mayoría de las cepas descritas como resistentes a

este antibiótico son variantes de laboratorio derivadas de manipulaciones genéticas.
PI
Factores de virulencia
La patogenicidad de B. anthracis depende de manera fundamental de dos factores de
virulencia, la cápsula y la toxina. Además, se ha estudiado la importancia de otros elemen-
tos presentes, englobados dentro del concepto de estructuras de superficie (SAP: Surface
O
Array Proteins), denominadas SAP y EA1.

La superficie del esporo provee la primera interacción entre el microorganismo y la célula
blanco. En algunas especies de Bacillus se ha observado por fuera del exosporio una es-
C
tructura de glicoproteínas con prolongaciones filamentosas en su superficie, que se supone

contribuye a la unión con los receptores celulares. En B. anthracis esta capa no presenta
la organización descrita, es laxa y su importancia sería la de actuar simplemente como una
barrera de protección frente a las enzimas celulares del hospedador.
La cápsula contribuye a que la bacteria evada las defensas del hospedador evitando
la fagocitosis y produciendo una septicemia. Es una estructura delgada, no antigénica,
compuesta por un polímero de ácido d-glutámico cuyas cadenas presentan un PM entre
20 y 55 kDa in vitro y, se estima, que 215 kDa in vivo. A pesar que la cápsula de naturaleza
peptídica no es común en las bacterias, otras especies como B. subtilis, B. megaterium y
B. licheniformis sintetizan polímeros de ácido glutámico que pueden formar una cápsula o
ser secretados al medio. Sólo en B. anthracis se organiza como una estructura compleja
la cual permite la adhesión a los macrófagos por un mecanismo aún no conocido en su
totalidad. A su vez, posee una enzima que va degradando el polímero en ácido glutámico
monomérico lo cual enmascara su presencia ante el sistema inmune.

Bacillus
Esta cápsula está codificada por los genes capB, capC y capA presentes en el Locus cap
de un plásmido, denominado pXO2. Estos tres genes codifican la síntesis de las enzimas
asociadas a la membrana que intervienen en los diversos pasos de la formación del polí-
mero de ácido glutámico. Los tres genes son suficientes para inducir la síntesis de ácido d-
glutámico, lo cual se ha demostrado mediante su inserción experimental en el cromosoma
de E. coli. Un cuarto gen presente en el Locus cap, denominado dep, está asociado a la
despolimerización y se relaciona con el control del tamaño de la cápsula.
Entre las estructuras de superficie B. anthracis presenta una compleja pared con el S-
layer, una capa cristalina bidimensional formada por subunidades proteicas que envuel-
ven completamente la superficie celular. Estas pueden funcionar como cubierta protectora,
como estructuras implicadas en la adhesión celular o como captadores de iones y otras
moléculas. Se caracterizaron 2 proteínas S-layer, Sap y EA1, son proteínas bimodulares
formadas por un dominio de anclaje y un segundo dominio implicado en la cristalización.
R
Además de la protección, se cree que cumplen alguna función en evadir la fagocitosis
y en la formación de la cápsula y de esta forma contribuyen a la virulencia. Constituyen
los antígenos de superficie más importantes. Ambas están codificadas por los genes sap
TO
y eag ubicados en forma consecutiva hecho que permite la expresión de las mismas en
forma simultánea o, de una, si la otra no se ha sintetizado, mostrando una regulación de
tipo interruptor para la expresión de ambas. Existen por lo menos unas 18 regiones que
codifican para estas proteínas, de las cuales quince se encontraron en el cromosoma, dos
en el plásmido pXO1 y una en el plásmido pXO2. En otras bacterias grampositivas se han
encontrado regiones con secuencias similares, lo que confirmaría su función en el meca-
nismo de unión con las células que parasitan.
AU
Toxinas
La toxina de B. anthracis desempeña un papel fundamental en la patogénesis del car-
bunclo. Está constituida por tres fracciones proteicas secretadas en forma separada al
medio. De acuerdo a su actividad in vivo se denominan antígeno protector (PA), factor letal
(LF) y factor edema (EF). Estas tres fracciones no presentan acción tóxica si se inoculan
por separado y su asociación de a dos, conduce a la formación de un complejo denomi-
A
nado toxina binaria (tipo A-B). En los animales de experimentación, ratón o cobayo, la
inoculación de PA junto con LF (LeTx, toxina letal) por vía endovenosa produce la muerte
y la inoculación de PA junto con EF (EdTx, toxina edemática) por vía intradérmica, produce
PI
edema en la piel.
La acción de las toxinas implica un reconocimiento de las células blanco mediado por el
PA, seguido de la endocitosis y el pasaje de EF y de LF al citoplasma. El PA proporciona
el sitio de unión a los receptores celulares y posee la capacidad de interactuar con dos
O
diferentes sistemas enzimáticos, EF y LF, que desencadenan el daño celular. El PA es una

proteína de 735 aminoácidos (aa) que presenta varios dominios funcionales en su interior.
La región C terminal es la responsable de la unión al receptor de membrana de la célula.
La unión PA-receptor es seguida de una proteólisis limitada de la molécula, con la posterior
C
liberación de un fragmento, denominado PA

20. La porción C terminal restante, designa-
da como PA 63 queda asociada al receptor
de membrana de la célula eucariota.
El PA 63 presenta una fuerte afinidad por Figura 3. Esquema estructural del Factor Ede-
EF y por LF, a los cuales se une. Esta unión ma (EF).
continúa la endocitosis, mediada por el re-
ceptor celular, con la internalización de am-
bas fracciones en el citoplasma de la célula
blanco. El clivaje del PA en PA 63 es funda-
mental para expresar la actividad de EF y de
LF y se produce por la acción de una pro-
teasa presente en la membrana de la célula Figura 4. Esquema estructural del Factor Letal
(LF).

Bacillus
blanco, entre los aa Arg 167 y Ser 168. Esto se demuestra por la ausencia total de toxicidad
en las cepas que han sufrido deleción de estos residuos.
El EF es una enzima con actividad de adenilciclasa, acción que depende de la proteína
eucariota calmodulina. Llega al interior celular seguido de la unión al fragmento PA 63. La
actividad de adenilciclasa conduce al aumento del AMPc intracelular y a una actividad des-
controlada de las quinasas dependientes de éste, con lo cual se desencadena el cuadro de
edema tisular. En el EF se identifica una región N terminal de 250 aa implicada en la unión
con el PA 63. Esta región presenta homología estructural con la región del LF que codifica
para idéntica función. Entre los aa 314 y 321 se sitúa una región de unión al ATP y final-
mente el dominio de unión a calmodulina se ubica entre los aa 449 y 532. La actividad de
adenilciclasa depende de la presencia de iones Ca y de calmodulina (Figura 3). Este tipo
de estructura está presente en las toxinas de otros microorganismos y las secuencias ge-
nómicas que los codifican se encuentran altamente conservadas. El EF puede interactuar
R
con lípidos sin dependencia del pH y, contrariamente a LF, permanece asociado a vesícu-
las de la membrana celular luego del pasaje al citosol. Probablemente el EF sea semejante
a las adenilciclasas asociadas a la membrana, presentes en las células eucariotas.
TO
El LF es una metalproteasa de zinc la cual cliva la mayoría de las MAPKs (Mitogen-Ac-
tivaten-Protein-Kinasa-Kinasas) en el citosol celular luego del ingreso por el PA, causando
la muerte de los individuos afectados. Las células blanco de algunas especies animales
como los cérvidos, presentan mayor sensibilidad a su acción. En su extremo C terminal po-
see una secuencia conservada (-His-Glu-X-X-His-) similar a la presente en las secuencias
codificantes de las neurotoxinas tetánica y botulínica. La región N terminal está implicada
AU
en la unión al PA 63 y el C terminal, catalítico, presenta actividad enzimática. Posee 776
aa y entre los aa 293 y 376 se encuentra una región con varias secuencias repetitivas de
7 aa (Figura 4).
Luego de la unión del EF o del LF con el PA 63 se produce la endocitosis del complejo
formado y se desencadenan las lesiones descritas.
El receptor para PA es de naturaleza proteica y se encuentra en muchos tipos de células
eucariotas, pero aún no se ha identificado completamente. In vitro, las células CHO resultan
sensibles al EF. Por el contrario las fracciones EF y LF son activas sólo sobre algunas líneas
A
de macrófagos. Estos se lisan luego de 2 horas de incubación con LeTx.

Como toxinas secundarias que ayudan a difundir la infección, se describen enzimas que
degradan gelatina, caseína, fibronectina, laminina y colágeno.
PI
El genoma de Bacillus anthracis

El genoma de B. anthracis es tripartito formado por un cromosoma circular y 2 plásmi-
O
dos de virulencia. El cromosoma presenta un elevado porcentaje de adenina y timina y su

estructura se encuentra relativamente conservada en los diversos aislamientos. Los plás-
midos son circulares, relativamente grandes, contiene diversos genes diferentes y los más
importantes son los que codifican para la síntesis de la cápsula y de la toxina.
C
En el plásmido pXO1 se encuentran el gen pagA que codifica la síntesis del antígeno
protector y de las proteínas para el transporte intermembrana de la toxina, el gen lef, del
factor letal, que es una endoproteasa dependiente de Zn y el gen cyaA, que codifica el
factor edema, con actividad de adenilciclasa. Este plásmido también transporta genes co-
dificantes de proteínas regulatorias de la síntesis de los anteriores factores.
El plásmido pXO2 transporta en el Locus cap los genes capB, capC, capA y dep que
codifican para la síntesis y degradación de la cápsula y el gen acpA, para proteínas con
actividad regulatoria.
El plásmido pXO1 puede estar en un número variable de copias entre pocas a más de
cien por célula y el pOX2 en un número no mayor de veinte, pero la virulencia depende de
la expresión del complejo tóxico y de la cápsula y no del número de plásmidos constituti-
vos, lo cual tiene como consecuencia es una gran variabilidad en la virulencia de distintas
cepas.

Bacillus
Tanto en el cromosoma como en los plásmidos se encontraron genes con funciones

desconocidas hasta el momento, en forma de repeticiones en tándem en número variable
(VNTR), con una tasa de mutación de alrededor de 10-5. Estas repeticiones resultan en
un número de copias suficiente como para clasificar aislamientos de diferente distribución
mundial en base al análisis de estos VNTR (múltiple locus VNTR análisis).
Un hecho importante de la fisiología de B. anthracis es la alternancia entre la fase vege-
tativa y la de esporulado. La bacteria se encuentra principalmente en el ambiente, sobre
todo en el suelo, como espora, sin actividad metabólica aparente y sin reproducirse. Si bien
puede germinar en el suelo con condiciones ambientales y nutricionales favorables, sus
atributos de virulencia tienen la máxima expresión en el hospedador que infecta, lo cual
también resulta una restricción. Los períodos de replicación en los animales afectados son
cortos debido a la muerte de estos y a la desaparición del bacilo por el sistema inmune o
por una adecuada administración antibiótica. Su evolución genética depende entonces de
R
cortos períodos replicativos donde se estima se producen entre 20 y 40 generaciones de
bacterias, razón por la cual resulta fenotípica y genéticamente homogéneo.
TO
Control genético de la síntesis de los factores de virulencia
La cápsula y las toxinas se sintetizan en el hospedador durante la multiplicación de las
formas vegetativas.
In vitro, la síntesis de la cápsula y de las toxinas se induce por la adición de bicarbonato
y depende de la temperatura de incubación. A nivel de la transcripción, la expresión de los
genes que codifican las toxinas se encuentra regulada por el bicarbonato y por la tempe-
AU
ratura, mientras que la expresión de la cápsula se encuentra regulada solamente por el
bicarbonato. La temperatura sólo se requiere como elemento para la actividad enzimática
y no como regulador genético.
En el plásmido pXO1 se encuentra codificada la proteína regulatoria Atxa (toxina activa-
dora de ántrax), responsable de la transcripción del gen pagA y de estimular la expresión
del gen capB, que codifica para cápsula, presente en pXO2. Tanto in vivo como in vitro la
expresión de Atxa no depende de la presencia de bicarbonato.
A
El plásmido pXO2 codifica un activador transcripcional de capB, denominado AcpA, re-

gulatorio de la síntesis de cápsula, dependiente de existencia de bicarbonato en el medio.
No se requiere la presencia de este regulador AcpA para que Atxa actúe estimulando la
PI
expresión de capB.
Antes del descubrimiento de estos mecanismos genéticos, la atenuación de la virulencia
de B. anthracis con el objeto de elaborar inmunógenos llevó a la eliminación los elementos
descriptos en forma empírica. Las variantes obtenidas por Pasteur por incubación a 42 ºC o
O
posteriormente con el empleo de antibióticos, corresponden con la pérdida de uno o ambos

plásmidos. Las cepas carentes de ellos se denominan “curadas” de plásmidos. Las cepas
tipo Pasteur presentan pXO2 pero carecen de pXO1. Durante el cultivo in vitro ocurre con
mayor frecuencia la pérdida de pXO1. La estabilidad de este último estaría relacionada con
C
la actividad de una topoisomerasa tipo 1, codificada en el plásmido, que se puede perder

al cultivar a 43 ºC.
La pérdida de pXO1 suele ocurrir en condiciones desfavorables para el ciclo bacteriano.
Las cepas curadas de este plásmido esporulan con mayor facilidad y frecuencia, crecen
pobremente en medios de cultivo mínimos y resultan más sensibles a la acción de algunos
bacteriófagos. Se han encontrado varios fenotipos relacionados con la presencia de este
plásmido, además de la producción de toxina.
El pXO2 se pierde con menor frecuencia y se pueden encontrar aislamientos ambien-
tales pXO2(-). El único fenotipo asociado con este plásmido es la formación de cápsula. A
partir de 1980 se obtuvieron en el laboratorio cepas carentes de pXO2 como la Sterne. Ésta
contiene solamente el plásmido pXO1. Su virulencia residual se debe a la producción de la
toxina y la infección experimental con altas dosis de ella provoca dos síntomas caracterís-
ticos: edema y muerte por shock. Las cepas mutantes derivadas de la cepa Sterne se han

Bacillus
empleado para identificar diferentes estadios de la toxicidad sobre las células. La deleción
de genes o las mutaciones puntuales con destrucción de la actividad de EF y LF son su-
ficientes para impedir el edema o la muerte, respectivamente, en animales de laboratorio.
Las cepas EFy LF son menos efectivas para producir edema y muerte que las poblaciones
originales. Estas propiedades evidencian el sinergismo existente in vivo entre EdTx y LeTx,
sugiriendo que ambas toxinas pueden actuar en conjunto en el hospedador.
La síntesis de las toxinas y de la cápsula se produce in vitro en medios complejos y
definidos, con bicarbonato disuelto y a 37 ºC y se detecta el máximo de producción en el
pasaje de la fase de crecimiento exponencial a la fase estacionaria.
En estudios experimentales, además de los genes descriptos en los plásmidos, se en-
contraron otros relacionados con islas de patogenicidad o asociados a proteínas de germi-
nación en fagocitos. Las islas de patogenicidad incluyen también los genes estructurales
R
pagA, lef y cya, un gen regulador de virulencia atxA y bslA de adhesión a proteínas de
superficie. La secuencia de las islas es estable en casi todos los plásmidos pXO1 de los
aislamientos obtenidos. En este plásmido se identificó el origen de replicación ori, los ge-
nes para la replicación del mismo y una región de 5-kb. Esta última, clonada en un vector
TO
de E. coli facilitaría la replicación del plásmido para la obtención de recombinantes.
En aislamientos de otros Bacillus del grupo B. cereus a partir de casos semejantes a
ántrax en humanos y de B. turigiensis en afecciones mortales en abejas, se encontraron
plásmidos con secuencias de ADN y síntesis muy similares a los descriptos antes. Todos
poseen las islas de patogenicidad de pXO1 y la región cap de pXO2, presentan antígeno
protector y cápsula, denominados pXO14 y pXO12 y otros más pequeños como pBC16
AU
asociado a resistencia a tetraciclina. Todos los plásmidos se pueden transmitir intra e inter
especies, puede ocurrir la transferencia conjugativa en la naturaleza y se puede reprodu-
cir a nivel experimental. Se encontraron plásmidos con secuencia de ADN y síntesis muy
similares a los descriptos
Bacteriófagos
Los fagos de B anthracis comprenden un amplio grupo dentro del cual el más estudiado
A
es el fago gamma, empleado actualmente en el diagnóstico. Es un ADN de doble cadena

con un genoma de 37 kb y es una variante lítica del fago W, identificado por primera vez en
un aislamiento de B. cereus. El fago gamma posee actividad lítica frente a cepas capsula-
PI
das y no capsuladas de B. anthracis, mientras que el fago W no lisa cepas capsuladas. El

fago gamma se considera B. anthracis-específico aunque se encontraron aislamientos no
sensibles. Las bacterias susceptibles producen una proteína de anclaje de pared GamR
(receptor gamma) vinculada a la asociación al fago. La secuencia de éste contiene genes
O
codificantes para una proteína, Gp41, que transmite resistencia a fosfomicina y sugiere que
esta resistencia al antibiótico en el suelo puede tener una función importante en la supervi-
vencia de las células vegetativas fuera del hospedador.
Se encontraron otros bacteriófagos con capacidad de transducción que se emplean para
C
desarrollar recombinantes como los fagos CP-51 y CP-54 aislados de B. cereus y el TP-21
de B. thurigiensis. También se postula un mecanismo que ocurre en el suelo donde algu-
nas variedades de lombrices de tierra pueden albergar en su intestino diferentes fagos de
Bacillus y podrían contribuir así al intercambio genético.
Respuesta inmune
En condiciones naturales los gérmenes capsulados sobreviven a la fagocitosis y logran
reproducirse en el animal. Si esta reproducción continúa sin límite, se produce la muerte
séptica, por reproducción e invasión bacteriana de diversos tejidos del hospedador, con
el consecuente colapso de macrófagos. Si la invasión no es tan masiva o se administran
antibióticos que limiten la multiplicación del bacilo y pueden aparecer anticuerpos como
respuesta a la multiplicación bacteriana, los cuales recuperan y dejan inmune al animal.

Bacillus
La cápsula, el esporo y las SAP intervienen como antígenos en la respuesta inmune que
producen las vacunas con gérmenes vivos que se emplean como profilaxis solamente en
Medicina Veterinaria.
Patogenia
El carbunco bacteridiano es principalmente una enfermedad de animales herbívoros,
aunque todos los mamíferos, incluidos los humanos y algunas especies aviares, pueden
contraerlo. La mortalidad puede ser muy alta, especialmente en los herbívoros.
Las vías de ingreso son a través de mucosas como la digestiva o pulmonar o, en forma
transcutánea, como heridas o picaduras de insectos. En el ingreso por mucosas se pos-
tula que el tejido linfoide asociado a ellas capta los esporos mediante células macrofági-
cas, donde estos pueden germinar mediante la acción de las toxinas menores, impedir
R
su destrucción por los sistemas oxidativos celulares y llegar a los linfonódulos. De allí se
diseminan a los tejidos y expresan sus factores de virulencia sobre el hospedador. Si éste
muere o los bacilos se eliminan al exterior, esporulan y el microorganismo se disemina
TO
nuevamente en el ambiente. En los animales la infección se produce generalmente por la
ingestión de las esporas.
En el hombre, según la vía de ingreso del microorganismo se producen diferentes for-
mas de la enfermedad, con distinta gravedad y pronóstico. La forma más frecuente es el
carbunclo cutáneo por la infección accidental a través de picaduras o pequeñas heridas,
generalmente en la cara o en los brazos. Raramente las esporas ingresan por inhalación
y se introducen a través del endotelio pulmonar directamente en el torrente sanguíneo, re-
AU
sultando en una afección generalmente mortal. También pueden ingresar por vía digestiva,
con la ingestión de alimentos contaminados y en casos excepcionales se ha descripto una
meningitis carbunclosa, posterior a una septicemia, de pronóstico fatal.
Aspectos clínicos
La patogenia está mediada principalmente por las exotoxinas. Se han descrito formas
hiperagudas, agudas, subagudas y a veces crónicas de la enfermedad. Los síntomas an-
A
temortem pueden estar virtualmente ausentes en las formas hiperagudas y agudas. La

forma subaguda puede cursar con fiebre progresiva, depresión, inapetencia, debilidad,
postración y muerte. En sus formas subaguda, aguda y crónica, se puede evidenciar una
PI
hinchazón localizada y fiebre. En la forma crónica, el único signo suele ser el aumento de
tamaño de los órganos linfáticos.
Las lesiones observadas con más frecuencia son las de una septicemia generalizada
acompañada muchas veces de un bazo inflamado con consistencia pastosa (barro esplé-
O
nico) y en algunos casos, hemorragia nasal, bucal, vaginal y/o anal.
Diagnóstico microbiológico
C
Recolección y transporte de muestras

Las muestras clínicas y los cultivos de B. anthracis se deben manipular con un nivel 3
de bioseguridad.
La bibliografía clásica indica como muestra ideal una falange desarticulada para abordar
la médula ósea, sobre todo cuando existe mucha contaminación o no se asegura un trans-
porte rápido, pero esta muestra resulta de apertura riesgosa en el laboratorio y no siempre
el bacilo sobrevive en el interior ya que allí no suele esporular. Es útil enviar muestras de
sangre u otros exudados, acompañados de frotis, trozos de piel o cuero.
La recuperación de B. anthracis a partir de reses muertas en descomposición, de mate-
riales procesados (hueso, carne, piel), o de muestras ambientales (suelo contaminado) es
a menudo difícil, requiriendo procedimientos de mucho tiempo y trabajo. No obstante se
pueden recuperar esporas viables de los cornetes nasales de ganado muerto y animales
salvajes muertos durante largos periodos de tiempo tras la muerte.

Bacillus
Los cadáveres de los animales infectados no se deben abrir para evitar la esporulación
del microorganismo. Se deben destruir por incineración o con compuestos cáusticos, como
cal viva y tratar de dejarlos cubiertos de tierra. Es obligatoria la desinfección de todas las
instalaciones y elementos que tuvieron contacto con los individuos infectados.
Protocolo de laboratorio recomendado

La demostración de B. anthracis encapsulado en frotis de sangre o de tejidos de cadá-
veres frescos infectados de carbunco y el crecimiento del organismo en placas de medio
sólido con sangre, no resulta muy complicado y está al alcance de la mayoría de los labo-
ratorios de bacteriología. Puede haber cierta dificultad en el caso de cerdos y carnívoros en
los cuales la bacteriemia terminal no es muy marcada o, en animales con terapia antibiótica
previa a su muerte.
R
Cuando los materiales de necropsia son de recolección reciente la observación directa
y el cultivo no presentan inconvenientes pero, cuando se trata de material contaminado,
esto mismo contribuye a la desaparición la cápsula y a la posterior lisis del bacilo, sumado
al inconveniente de la posible contaminación agregada. En estos casos se pueden aplicar
TO
algunas técnicas de recuperación como:
◊ el calentamiento selectivo de tejidos o secreciones expuestos al aire, para aislar los es-
poros. Como el proceso de esporulación es muy rápido, se pueden calentar las mues-
tras a 80 ºC durante 2, 4 y 6 minutos y cultivar a partir de cada tiempo.
◊ la aplicación de fenol al 0,5 o al 1 %.
AU
◊ el empleo del medio de cultivo PLET, selectivo, con antibióticos y sales de talio que
inhiben los contaminantes. Tiene el inconveniente de su preparación es engorrosa y no
todos los aislamientos de B. anthracis desarrollan en él (polimixina 30.000 unidades/
litro y la lisozima 300.000 unidades/litro).
◊ si se cuenta con un bioterio, las condiciones de bioseguridad adecuadas y la muestra
lo justifique se puede inocular en ratón. Dada la especial sensibilidad de los macrófa-
gos del ratón a la toxina LT de B. anthracis, resulta muy útil para aislarlo y completar el
diagnostico.
A
En muestras de casos de carbunclo no agudo se pueden observar las cadenas de bas-

tones truncados en abundancia en todos los tejidos. Por el contrario en casos de carbunclo
apoplético, con antecedentes de vacunaciones lejanas, ante la falta de signos como el
PI
barro esplénico o la sangre incoagulable, se debe buscar la aparición de escasos bastones

aislados de bordes redondeados en las muestras de bazo, hígado y sangre. Esto último es
una sospecha de enfermedad hasta lograr la identificación del agente aislado.
O
Diagnóstico bacteriológico
La identificación del microorganismo incluye la demostración de bacilos grampositivos
capsulados en extendidos de sangre o tejidos y el desarrollo en medios de cultivo simples,
C
la ausencia de hemólisis sobre agar sangre, las características de las colonias y la ausen-
cia de movilidad. La prueba del collar de perlas y la sensibilidad al fago gamma completan
la identificación.
Como diagnóstico presuntivo se considera en conjunto el desarrollo en medios sólidos de
colonias rizoides, no invasivas, circunscriptas, no hemolíticas en agar sangre, la formación
en medio líquido de una película en la superficie y el resto límpido, la falta de movilidad y la
formación del “collar de perlas” en presencia de penicilina. La inoculación en el ratón, aún
por escarificación intradérmica con material contaminado, produce la muerte entre 24 a 48
horas, con el notorio barro esplénico y pudiéndose reaislar el microorganismo en pureza.

Pruebas de diagnóstico alternativas
Diagnóstico serológico
Se han descripto pruebas de inmunofluorescencia, inmunodifusión, ELISA y aglutina-
ción, pero la metodología de aplicación y validez internacional es la de Ascoli-Valente. Esta
Bacillus
es una prueba de termoprecipitación en medio líquido para detectar B. anthracis como

antígeno a partir de un tejido. La muestra procedente del individuo sospechoso se coloca
en solución salina y se calienta en baño de agua, a 100 ºC durante 5 minutos. Se filtra por
una gasa. Se enfrenta en un tubo de ensayo con un suero inmune, conocido, que posee
anticuerpos capaces de formar un precipitado al unirse con el antígeno específico. La apa-
rición de un anillo blanco en la zona de interfase en un lapso de 15 minutos demostrando
la unión antígeno-anticuerpo, se considera reacción positiva.
El ácido glutámico de la cápsula y el polipéptido del citoplasma serían los antígenos pre-
sentes en los tejidos, responsables de la reacción. Pueden producirse reacciones positivas
débiles frente a otras especies de bacilos similares (B. subtilis o B. cereus).
Diagnóstico experimental
R
Si bien en la actualidad existen metodologías de diagnóstico normatizadas internacio-
nalmente y se desestima el empleo de animales de laboratorio en forma indiscriminada, en
escasas situaciones la inoculación en cobayos o en ratones reproduce perfectamente la
enfermedad y permite fácilmente el aislamiento del microorganismo. (Postulados de Koch).
TO
Se puede inocular ratones o cobayos por vía subcutánea. Los ratones mueren entre las
12 y las 24 horas y los cobayos en no más de 72 horas, según la virulencia de la cepa ino-
culada. La muerte se produce por falla respiratoria y presentan un exudado sanguinolento
por las aberturas naturales. La sangre se encuentra sin coagular. Las muertes producidas
antes de las 24 horas y luego de los 5 días no constituyen una característica específica
en estas especies animales. En la necropsia se detecta un edema gelatinoso subcutáneo
AU
generalizado, sin hemorragias. A partir de las improntas de bazo y de hígado se puede
observar una abundante cantidad de bacilos capsulados y sin esporas.
La dosis letal de cepas con alta virulencia para el ratón es de 5 esporos, para el cobayo
de 50 esporos, para la rata de 1.000.000 (se considera muy poco sensible a este germen)
y para el perro es mayor de 10.000.000 de esporos. La cepa Sterne requiere entre 1 y 10
millones de esporos como DL para el ratón.
A
Diagnóstico molecular
Mediante una técnica de PCR se pueden detectar los genes codificantes para la toxina y
para la cápsula, confirmando así la virulencia. La extracción del ADN se realiza a partir de
PI
un cultivo fresco en medio sólido siguiendo el protocolo correspondiente.
Significado del aislamiento

Todo animal muerto con signología característica se considera sospechoso de carbunclo
O
hasta confirmar lo contrario, excepto ante un rodeo con vacunación sostenida y verificable.
Lo mismo sucede ante la falta de signos patológicos característicos. En ambos casos se
requiere el diagnóstico microbiológico para su confirmación final.
C
En cuanto a otras especies de Bacillus similares, antiguamente denominados “antra-

coides” forman colonias que se expanden sobre el agar, producen hemólisis completa o
incompleta (verdosa) sobre agar sangre, desarrollan turbidez en medios líquidos, al igual
que en caldo tioglicolato, son móviles, no forman el collar de perlas o no son inhibidos por
penicilina. Sólo resultan letales para el ratón inoculando un elevado número de bacterias
por vía subcutánea o intramuscular y sin producir lesión evidente en el bazo.
Tratamiento
B. anthracis es naturalmente sensible a penicilina y la aparición de cepas de campo que
presentan resistencia es escasa. La mayoría de las cepas descritas como resistentes a
este antibiótico son variantes de laboratorio derivadas de manipulaciones genéticas.
En los animales afectados la posibilidad de instaurar un tratamiento antibiótico depende
del curso de la afección y de la rapidez del diagnóstico.

Bacillus
En los casos esporádicos que aparecen en un rodeo en forma “de goteo” se puede
intentar con éxito el tratamiento de los animales sanos o con una signología emergente,
continuando luego el procedimiento con un refuerzo vacunal.
En el humano se emplea como tratamiento penicilina G (1.000.000 UI/ día) por vía intra-
muscular durante 5 días. Se puede reemplazar por tetraciclina o eritromicina en situaciones
de alergia a dicha droga.

Epidemiología
La enfermedad tiene una distribución mundial y es una zoonosis. Bacillus anthracis se
encuentra en el suelo en forma esporulada. Las esporas pueden permanecer viables du-
rante años. De allí se propagan entre los animales herbívoros a través de piensos y agua y
entre carnívoros u omnívoros por la ingestión de carne, harinas o hueso u otros productos
R
contaminados. No hay pruebas de transmisión entre personas.
La presentación regional se debe no sólo a la resistencia de las esporas sino a deter-
minadas características del suelo como la falta de drenaje, aumento de humedad y de
TO
temperatura. Las inundaciones contribuyen a su diseminación al igual que los periodos de
sequía, por su difusión a través del polvo. Las enzootias de carbunco de latitudes templa-
das muestran, por ello, una marcada elevación en verano, desarrollándose por lo general
tras períodos cálidos de sequía que se vieron precedidos por precipitaciones anormalmen-
te abundantes e inundaciones.
AU
Profilaxis
El carbunclo fue la primera enfermedad de los animales donde se aplicó una vacunación
efectiva. En 1881 en la experiencia de campo de Pouilly Le Fort, la cepa de B. anthracis
obtenida por Pasteur resultó ser la primera vacuna viva empleada de manera satisfactoria.
De los trabajos de Pasteur que cultivó este microorganismo a 42 ºC se obtuvieron 4 tipos
de cepas conocidas como Pasteur 1, 2, 3 y 4, de menor a mayor virulencia de acuerdo
al número y especie animal que mataban. Con las cepas Pasteur 1 y 2 se obtuvieron las
primeras vacunas. En 1920 José Lignieres las introdujo en Argentina y partir de allí se em-
A
plearon con cepas derivadas del tipo virulento Pasteur 2. Estas resultaron poco estables
por el riesgo de revertir a estados de mayor virulencia y causaron innumerables accidentes
vacunales, sobre todo en animales jóvenes o en hembras preñadas.
PI
Desde 1950, Max Sterne, en Sudáfrica, trabajó con una variante de B. anthracis cultiva-
da con suero y altas concentraciones de CO2, productora de colonias mucoides que dieron
origen posteriormente a formas R avirulentas. Esta variante acapsulada conocida como
cepa Sterne conserva su poder inmunógeno y mediante estudios moleculares se ha deter-
O
minado que conserva el plásmido codificante para la toxina, pero ha perdido el que media
la formación de cápsula (pXO2). La cepa Sterne ha demostrado ser estable y no revertir en
su patogenicidad, por lo cual se la considera avirulenta y de elección para ser manipulada
en el laboratorio.
C
El empleo de toxina detoxificada, toxoide, ha demostrado ser muy eficaz como inmunó-
geno en humanos. En animales presenta una menor eficacia que las vacunas con cepas
vivas. Su elaboración requiere el empleo de medios de cultivo especiales y una compleja
tecnología y bioseguridad. Este tipo de vacunas “acelulares” está reservado por el momen-
to para administración en situaciones especiales en humanos.
A nivel experimental, se ha logrado la transferencia del plásmido pX01 mediante inge-
niería genética a otras bacterias de menor riesgo, como E. coli, con el objeto de producir
fácilmente cantidades elevadas de toxina para su transformación en toxoide vacunal.
Bacillus cereus
Es un bacilo con esporas subterminales, móvil por flagelos de ubicación perítrica, gram-
positivo, aerobio y anaerobio facultativo, no exigente, productor de catalasa. Se encuentra

Bacillus
ampliamente distribuido en la naturaleza y se puede aislar como patógeno oportunista de

infecciones genitales y articulares y como agente primario en toxiinfecciones alimentarias
(ETA).
Esta toxiinfección se produce en el hombre y sucede por la ingestión de alimentos coci-
dos y mantenidos a temperatura ambiente donde las esporas sobrevivientes a la cocción,
germinan y las formas vegetativas elaboran las toxinas que liberan al medio. Se puede
presentar como un cuadro entérico o como un cuadro emético.
B. cereus produce fosfolipasas las cuales provocan la liberación de enzimas de los liso-
somas de los neutrófilos e impiden la fagocitosis, hemolisinas detectables in vitro y protea-
sas que degradan el tejido colágeno. Pero las toxinas vinculadas con las toxiinfecciones
son las enterotoxinas y la toxina emética. Las enterotoxinas elaboradas por B. cereus
aumentan la permeabilidad capilar y poseen efecto citotóxico sobre el epitelio intestinal
R
provocando un cuadro de enteritis con diarrea. La toxina responsable del cuadro emético
es termoestable, resiste la acción de la tripsina y otras enzimas digestivas y es probable
que se produzca durante el proceso de esporulación.
El diagnóstico se realiza por el aislamiento del microorganismo y/o la detección de sus
TO
toxinas, según el tipo de afección.
Bacillus subtilis
Es un bacilo esporulado, móvil, que puede presentar una cápsula de polímeros de ácido
glutámico, Gram positivo, aerobio y anaerobio facultativo, no exigente. Es una bacteria
AU
ambiental la cual puede actuar como patógeno oportunista y provocar infecciones en los
animales y también intoxicaciones en el hombre. Se ha aislado de septicemias, mastitis y
abortos en ovinos y bovinos. De este microorganismo se obtuvo originariamente el antibió-
tico bacitracina.
Otras especies de Bacillus

Dentro de este género existe una variedad de especies que pueden ser patógenos opor-
A
tunistas en animales superiores o afectar insectos. Comparten la mayoría de las caracte-

rísticas morfo-fisiológicas descritas para los Bacillus y algunos pueden confundirse con B.
anthracis, de donde surge la importancia de un correcto diagnóstico diferencial.
PI
Bacillus licheniformis también es un patógeno accidental en infecciones del hombre y los

animales. Junto con B. megaterium y B. subtilis pueden sintetizar una cápsula de polímeros
de ácido glutámico, similar a la de B. anthracis.
B. thuringiensis y B. fusiformis son patógenos para el estado larvario de una variedad de
O
insectos. En la actualidad se emplean incluidos en compuestos pesticidas, en el control de

algunas plagas (mosquitos, coleópteros, langostas, mariposas).
Bacillus cereus, B. subtilis, B. mycoides (que puede presentar cepas inmóviles) y B.
thurigensis poseen una morfología similar a B. anthracis, con esporas centrales o subter-
C
minales no deformantes y se encuentran antigénicamente relacionados entre sí, por lo que

pueden producir resultados positivos en pruebas serológicas como la de Ascoli-Valente.
Otros Géneros
La taxonomía actual ha incluido en géneros separados algunas especies que anterior-
mente se consideraban dentro de Bacillus.
El género Paenibacillus agrupa agentes que se encuentran principalmente en el suelo y
son patógenos de insectos. Su temperatura óptima de desarrollo es entre 20 y 30 °C. Las
esporas deforman el soma de los bacilos. Durante el proceso de esporulación producen in-
clusiones cristalinas denominadas cuerpos parasporales, que son protoxinas activas sobre
larvas de insectos. Los bacilos penetran por vía oral y por acción de las enzimas digestivas
el cuerpo parasporal se separa de la espora y se transforma en toxina. La toxina posee
una actividad principal de adenilciclasa, alterando la permeabilidad intestinal y provocando
Bacillus
la muerte de las larvas. En el cromosoma de estos bacilos se han identificado los genes
cry, que codifican las toxinas citadas. Estos genes se han clonado para sintetizar toxinas
empleadas como pesticidas en agricultura.
Dentro de este grupo se ubican P. alvei (B. alvei), P. larvae (B. larvae), P. coagulans (B.
coagulans) y P. apiarius (B. apiarius). Otro integrante de este género es P. polymyxa (B.
polymyxa) del cual se aislaron cepas productoras de polimixina o de bacitracina.
Bacillus stearotermophilus, microorganismo termófilo empleado comúnmente en el la-
boratorio para realizar el control biológico de procesos de esterilización, se incluye actual-
mente dentro del género Geobacillus como G. stearothermophilus. Este género agrupa
especies de bacilos Gram positivos, termófilas, residentes en el suelo.
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O
C

Clostridium
CAPITULO 54
Clostridium
Graciela Carloni
R
l género Clostridium comprende un conjunto de microorganismos difundidos en la
naturaleza, cuyo hábitat puede ser el suelo, los sedimentos marinos y lacustres,
las pasturas, los vegetales en descomposición y el tracto digestivo de diversas es-
TO
pecies animales. Debido a su ubicuidad ecológica y al hecho de que algunas especies del
género integran la microbiota residente tanto en el hombre como en los animales, se los
reconoce como causantes de afecciones endógenas y con una presencia ocasional como
contaminantes en algunos materiales clínicos.
Sin embargo, en los animales domésticos los Clostridios se comportan en la mayoría de
los casos, como causantes primarios de enfermedad ya que rara vez actúan como inva-
sores secundarios. Causan patologías definidas las cuales afectan sobre todo a los herbí-
AU
voros y por lo tanto, con importancia en la producción. Constituyen el género de bacterias
anaerobias que más incidencia tiene en sanidad animal.
Taxonomía
El género Clostridium pertenece al Dominio Bacteria, Reino Eubacteria, Filo Firmicutes,
Clase Clostridia, Orden Clostridiales y actualmente está ubicado dentro de la familia Clos-
A
tridiaceae. Incluye, a la fecha, más de 200 especies y subespecies, de las cuales unas 30
se consideran patógenas o se han aislado a partir de muestras clínicas de humanos o de
animales. Esta taxonomía se encuentra en constante actualización.
PI
Características generales
Clostridium comprende un grupo heterogéneo de especies de bacilos Gram positivos,
O
con capacidad de esporulación, anaerobios, no productores de catalasa, con actividad

proteolítica o fermentativa sobre carbohidratos. La mayoría son móviles mediante flage-
los perítricos y algunas especies poseen la propiedad de elaborar cápsula.
C
Morfología
Son bacilos grampositivos aunque algunas especies se pueden observar como gramne-
gativas, especialmente en cultivos envejecidos. No obstante, C. clostridioforme, C. inno-
cuum y C. ramosum se observan así aún en cultivos jóvenes. En caso de duda, se utilizan
discos de colistina (10 mg) y vancomicina (5 mg) ya que las especies de este género son
resistentes al primero y sensibles al segundo.
La detección de esporas es importante en la identificación del género. Pueden ser ova-
ladas o redondas y tener una ubicación terminal o subterminal. En algunas especies como
C. tetani pueden tener un diámetro mayor que el del bacilo y dar al soma bacteriano un
aspecto deformado. Al igual que para Bacillus, las endosporas de Clostridium spp. no se
tiñen con los colorantes habituales y requieren coloraciones especiales como la de Wirtz o
la observación con condensador de contraste de fase. Con la técnica de Gram se observa
el perfil de las esporas sin teñir.
Clostridium
Como organismos grampositivos poseen una pared formada por una diversidad de poli-
sacáridos dentro de los cuales el péptidoglicano mureína, es el principal componente de la
capa que se ubica en forma contigua a la membrana citoplasmática celular. Las cadenas
de péptidoglicano unidas en forma transversal y en varias capas, constituyen una molécula
gigante con un tamaño entre 15 y 80 nm. Esta molécula abarca entre un 80 y un 90 % de
toda la estructura de la pared celular.
Sobre la superficie externa de la mureína se encuentran cantidades considerables de
ácidos teicoicos y telurónicos, los cuales son polímeros hidrosolubles con residuos de ri-
bitol o de glicerol unidos mediante enlaces fosfóricos. De estos ácidos se describen dos
tipos: uno de pared, unido en forma covalente al péptidoglicano y otro, el ácido teicoico de
membrana o lipoteicoico, unido por covalencia al glicolípido de ella, que se concentra en
los mesosomas de las bacterias.
R
Según la especie de clostridio, la pared bacteriana se puede hidrolizar por diversas en-
zimas con diferentes grados de dificultad y muchas veces con la lisis consecutiva de otros
elementos celulares. Este hecho y la inestabilidad a la tinción de Gram, indican la presen-
cia de una estructura de pared más lábil, con mayor tendencia a la autólisis, que la clásica
TO
descripta para otras bacterias grampositivas.
Algunas cepas de C. perfringens pueden formar una cápsula de composición polisacá-
rida compleja la cual se manifiesta con mayor facilidad en aquellas que producen colonias
mucoides.
La mayoría de las especies conocidas son móviles mediante flagelos de ubicación perí-
trica y de composición proteica, que comparten una estructura antigénica similar.
AU
Características culturales
El término anaerobio agrupa microorganismos que generan su energía y sintetizan sus
compuestos sin utilizar oxígeno molecular como receptor final de electrones. El género
Clostridium se define como anaerobio aunque demuestra una singular graduación en la
sensibilidad a este gas y comprende desde especies anaerobias estrictas, hasta otras ae-
rotolerantes como C. tertium y C. histolyticum.
A
La mayoría de las especies de Clostridium crece en los medios de cultivo utilizados

en forma habitual para el aislamiento de bacterias anaerobias. Al cabo de 24 a 72 h de
incubación desarrollan colonias de tamaño, aspecto y forma variables según la especie
PI
y el medio de cultivo y el tiempo de incubación. Es requisito fundamental mantener el pH

neutro de los medios durante el cultivo. Entre los medios no selectivos se pueden emplear
agar anaerobios, agar base Columbia, agar Brucella o agar infusión cerebro corazón, todos
suplementados con 5 % de sangre de ovino desfibrinada (también de equino o de bovino).
O
Como medios selectivos y/o diferenciales se pueden citar el agar fenil etil alcohol, medios
con antibióticos como aminoglucósidos y polimixina B, agar yema de huevo y los medios
agar Tryptose Sulphite Cycloserine (TSC) y agar Shahadi Ferguson Perfringens (SFP)
para C. perfringens.
C
Resistencia
Si bien el contacto con el oxígeno resulta letal para los microorganismos anaerobios, en
el caso de los clostridios la capacidad innata de formar esporas, la cual se produce con
facilidad fuera del hospedador, asegura su supervivencia y diseminación en el medio. Las
esporas presentan una elevada resistencia a condiciones adversas de acidez, tempera-
tura, radiación ultravioleta (UV), cambios osmóticos, desecación, carencia de nutrientes y
también, a la acción de antisépticos y desinfectantes, incluido el alcoho. La cantidad de es-
poras y la velocidad con que estas se producen difiere según la especie. Aún en los cultivos
jóvenes, ya sea in vitro, en fase exponencial de crecimiento, como también en el individuo
infectado, se pueden detectar formas esporuladas.
Las formas vegetativas de los clostridios son sensibles a la mayoría de los agentes fí-
sicos y químicos pero como ya se mencionó la facilidad de esporular, los parámetros de
Clostridium
aplicación de estos agentes se deben dirigir a las formas esporuladas. Como ejemplo se
puede mencionar que las esporas de C. botulinum requieren 121 ºC durante 20 minutos
para su destrucción. Por el contrario, la mayoría de las toxinas, dada su naturaleza proteica
se inactivan a 80 ºC en 30 minutos o a 100 ºC durante 10 minutos.
Como género suelen presentar resistencia a sulfamidas, quinolonas, aztreonam y ami-
noglucósidos pero, resultan sensibles a la mayoría de los antimicrobianos de uso en clínica
para bacterias anaerobias Gram positivas, como penicilina y sus derivados, tetraciclina,
vancomicina, clindamicina y metronidazol. La información sobre la resistencia a antimicro-
bianos de las cepas de Clostridios aisladas a partir de animales en Argentina es escasa y
no se cita resistencia a penicilina en ellas.
La literatura internacional describe genes de resistencia a tetraciclina (tet), a eritromicina
(erm) y a cloranfenicol (cat) en C. perfringens y en C. difficile y la posibilidad de su trans-
R
misión a otras especies. También se encontró el gen nimB, que se asocia con resistencia a
metronidazol en C. bifermentans.
TO
Factores de Virulencia
Toxinas
Los Clostridios elaboran proteínas con actividad biológica, responsables de su patoge-
nicidad, denominadas genéricamente toxinas. La calidad y la cinética de su producción
difieren según la toxina y la especie microbiana.
En la mayoría de los casos se trata de complejos moleculares con actividad enzimática
AU
y con un peso molecular variable entre 22 y 600 kDa. Algunas atraviesan la pared celular
y se vuelcan al medio para detectarse en su máxima concentración durante la fase loga-
rítmica de crecimiento. Otras toxinas se encuentran en el interior de la bacteria ligadas a
estructuras de la pared celular y se evidencian en la fase final de la esporulación, como es
el caso de la enterotoxina elaborada por algunos tipos de C. perfringens. Finalmente un ter-
cer tipo, lo constituyen las toxinas de localización protoplasmática. Estas se acumulan en
el citoplasma y se liberan al medio solamente cuando ocurre la lisis celular. La temperatura
óptima del cultivo para la producción de estas toxinas protoplasmáticas debe ser menor
A
que la habitual, entre 30 y 35 °C. Son ejemplos de ellas la neurotoxina de C. botulinum, la

toxina alfa de C. novyi y la toxina tetánica.
También varían la forma de ingresar y difundirse por el organismo. Algunas toxinas se
PI
pueden ingerir preformadas en un alimento, como ocurre con la toxina botulínica. Otras se
pueden absorber desde el intestino luego de la proliferación anormal del microorganismo
causal en las vías digestivas. Esta situación ocurre en la mayoría de los cuadros de entero-
toxemias. En otros casos, como sucede en el carbunclo sintomático o en las gangrenas ga-
O
seosas, las formas vegetativas del microorganismo elaboran las toxinas cuando las espo-
ras germinan en los tejidos. Estas toxinas ejercen su acción en forma local sobre los tejidos
lesionados, se absorben y se difunden para desencadenar una toxemia generalizada que
induce la muerte del individuo afectado. Por último, otras infecciones se desarrollan con ca-
C
rácter local produciendo lesiones tisulares de menor importancia, pero con la elaboración
de potentes toxinas que actúan a distancia como en el caso de tétanos, de hemoglobinuria
bacilar y también en algunos tipos de enterotoxemias.
La actividad biológica de las toxinas permite la identificación y caracterización de las
especies de clostridios y se evidencia por los efectos producidos en animales de labora-
torio, sobre cultivos de tejidos o, mediante la degradación de diferentes sustratos in-vitro.
Poseen actividades enzimáticas capaces de hidrolizar gradualmente estructuras celulares
eucariotas, desde la membrana citoplasmática hasta la cromatina nuclear. Pueden tener
actividad de neuraminidasa y contribuir a la unión con las células del hospedador; de lipasa
o fosfolipasa, al producir la ruptura de eritrocitos; de hialuronidasa y favorecer la invasión
tisular, o de desoxiribonucleasa (DNAsa), al destruir la estructura genómica de las células
musculares que invaden. Otras, como las toxinas botulínicas y la tetánica son neurotoxinas
y se unen a receptores del sistema nervioso a nivel de las sinapsis neuromusculares y al-
teran la fisiología de la musculatura estriada.
Clostridium
Los genes que codifican la síntesis de las toxinas se pueden ubicar en el cromosoma
bacteriano o fuera de él, en plásmidos o en fagos lisogénicos. En la mayoría de los casos
estos genes comprenden secuencias ubicadas en regiones correspondientes con islas de
patogenicidad, flanqueadas por transposones u otros elementos de inserción. Esto, su-
mado a la codificación en plásmidos o en fagos explicaría los cambios en la capacidad de
producir toxinas, detectados con frecuencia en los aislamientos de laboratorio.
Las toxinas clostridiales de mayor impacto clínico en los animales son las que producen
C. perfringens, C. tetani, C, botulinum y C. septicum, C. chauvoei y C. novyi, entre otros.
Clostridium perfringens produce varias toxinas clasificadas como mayores o menores de
acuerdo a la importancia que posean cada patología. En la Tabla 1 se describen los cinco
toxinotipos reconocidos, A, B, C, D y E, según la elaboración de las cuatro toxinas mayores:
alfa, beta, epsilon e iota. Estas toxinas se secretan al medio durante la fase exponencial de
R
crecimiento y los sobrenadantes de los respectivos cultivos resultan letales para animales
de laboratorio y/o para cultivos celulares. Cada tipo toxigénico se ha asociado a determi-
nadas patologías.
La toxina alfa es una fosfolipasa C que se adhiere y actúa sobre las membranas celu-
TO
lares. La producen en diferentes niveles todos los tipos de C. perfringens. Es una zinc-
metaloenzima con actividad de lecitinasa y esfingomielinasa, se une al colesterol, a la
esfingomielina y a la fosfatidil-colina de las membranas y los degrada. Tiene acción he-
molítica y necrótica y es esencial en el desarrollo de las gangrenas. Activa las plaquetas y
estimula su agregación, así como la de los leucocitos en los capilares y arteriolas. De ese
modo contribuye a la trombosis microvascular, a la necrosis isquémica de los tejidos y a la
AU
inhibición de la diapédesis de los neutrófilos.
La toxina beta incluye dos variantes denominadas b1 y b2. Las mismas se pueden pro-
ducir en forma separada o conjunta. La primera es letal y necrotizante, muy lábil y puede
ser degradada por la tripsina, por lo cual su detección resulta dificultosa. La segunda posee
actividad citotóxica y necrótica y se cree que actúa formando poros en las membranas
celulares.
La toxina epsilon es una proteína secretada en forma inactiva. Con la proteólisis de-
muestra una intensa actividad al unirse a las membranas celulares y alterar su permeabili-
A
dad con la consiguiente producción de edema.

La toxina iota es una toxina binaria formada por dos proteínas independientes, un com-
PI
ponente de unión a la célula (ib) y otro enzimático (ia), los cuales actúan en conjunto. El
componente ib reconoce al receptor de superficie celular, ambos se internalizan por endo-
citosis y la fracción ia se libera, altera la estructura del citoesqueleto y causa destrucción
tisular.
Clostridum perfringens secreta también otras enzimas hidrolíticas las cuales degradan
O
diversos sustratos y contribuyen al daño tisular. En general son denominadas toxinas me-
nores y se han identificado 17 variedades. En la Tabla 2 se enumeran algunas de ellas
junto con su actividad enzimática. Las cepas del toxinotipo A y algunas de los tipos B y
C
E elaboran además una enterotoxina (CPE) la cual se produce solo al finalizar la fase de
esporulación y es la responsable de síndro-
mes gastroentéricos. Es un polipéptido de
35 kDa que produce una respuesta inflama- Tabla 2. Toxinas menores de C. perfringens y
toria exacerbada. Es resistente a la acción su actividad enzimática
Toxina Actividad
Tabla 1. Toxinotipos de C. perfringens theta Hemolisina,
Tipo Toxina mayor kappa Colagenasa, gelatinasa
alfa beta epsilon iota mu Hialuronidasa
A + - - -
nu Dnasa
B + + + -
C + + - - lambda Proteasa
D + - + - Neuraminidasas sialidasas
E + - - + gama Hemolisina

Clostridium
de tripsina y quimiotripsina y, en el intestino delgado, a nivel del ribete en cepillo, se une a

un receptor de membrana e induce una alteración de la permeabilidad celular, como con-
secuencia produce una pérdida de iones y metabolitos. Esto altera la función metabólica,
provoca un daño morfológico y una eventual lisis celular.
El mapa cromosómico de C. perfringens se conoce completamente y la mayoría de los
genes de virulencia están caracterizados. Los genes que codifican para la toxina alfa, the-
ta, kappa y mu se localizan en regiones variables del cromosoma cercanas al origen de
replicación (Ori). Solamente los que codifican para neuraminidasas se localizan en regio-
nes conservadas. Por el contrario los genes codificantes para toxinas beta 1 y 2, epsilon,
iota y lambda se encuentran en plásmidos de diferentes tamaños (entre 55 y 140 kb). El
gen de la enterotoxina (cpe) se ha encontrado en regiones variables del cromosoma en
las cepas aisladas a partir de cuadros de intoxicación en el hombre y en plásmidos gran-
des en las cepas provenientes de enfermedades gastrointestinales en el hombre y en los
R
animales. La localización de algunos de estos genes en elementos extracromosómicos
es probablemente la causa de la diversidad encontrada durante la biotipificación de las
cepas. Se ha detectado la movilización de plásmidos mediante conjugación, transposición
TO
y posiblemente también a través de fagos. La pérdida y la adquisición de estos elementos
explicaría los cambios en la producción de toxinas observados en algunas cepas e implica
a C. pefringens como un reservorio de genes transmisibles a otras especies dentro y fuera
del género Clostridium (Tabla 3).
Clostridum chauvoei elabora un complejo toxigénico dentro del cual se describen cua-
tro toxinas mayores de naturaleza proteica y con una actividad enzimática determinada.
AU
La toxina alfa es una fosfolipasa y contribuye a la lisis de la membrana de las células del
hospedador, incluidos los glóbulos rojos. Resulta letal cuando se inocula en animales de
laboratorio y comparte antígenos con la toxina alfa de C. septicum. La toxina beta posee
actividad de desoxiribonucleasa (DNAsa), es responsable de la degeneración nuclear de
las células musculares y contribuye al proceso de miositis gangrenosa. La toxina gama
actúa como hialuronidasa y se inactiva fácilmente por el calor. La toxina delta es una hemo-
lisina lábil al oxígeno. Además, se describe una sialidasa, con actividad de neuraminidasa,
la cual participa en el proceso de invasión bacteriana y contribuye a la unión con los recep-
A
tores de las células blanco. Esta sialidasa posee una marcada preferencia por las mucinas
y su producción aumenta notablemente en presencia de proteínas de origen animal. Las
secuencias genómicas que codifican la expresión de estas las toxinas se encuentran en
PI
el cromosoma bacteriano pero aún no están completamente identificadas, ni tampoco los

mecanismos moleculares que las regulan.
Clostridium septicum sintetiza varias toxinas proteicas con actividad enzimática. La toxi-
na alfa es una hemolisina que se segrega como protoxina y mediante la acción de la tripsina
se fragmenta en un sitio activo por el cual se
O
Tabla 3. Genes codificantes de las toxinas de une a la bicapa lipídica de la membrana de

C. perfringens y su ubicación las células eucariotas, forma canales en su
Toxina Gen Ubicación
estructura y produce un desbalance osmó-
C
alfa plc Cromosoma tico que conlleva a la lisis celular. La toxina

beta 1 cpb1 Plásmido beta posee actividad de DNAsa y de leuco-
beta2 cpb2 Plásmido cidina. La toxina gama es una hialuronidasa
epsilon etx Plásmido y la toxina delta es una hemolisina lábil al
iota (Ia) Iap Plásmido oxígeno. También produce neuraminidasa,
iota (Ib) Ibp Plásmido
Enterotoxina cpe Cromosoma/ plásmido Tabla 4. Toxinas de C. novyi y de C. haemolyti-
gama - - cum.
theta pfoA Cromosoma
Toxinas
lambda lam Plásmido
mu nagh Cromosoma Alfa Beta
nu - - C. novyi tipo A + +
kappa col A Cromosoma C. novyi tipo B + -
Nueraminidasa nanH, nanI Cromosoma C. novyi tipo C - -
C. haemolyticum - +++

Clostridium
lipasa y fibrinolisina. Todo el conjunto ocasiona un aumento de la permeabilidad capilar y

mionecrosis y desencadena un cuadro de toxemia generalmente mortal. Los genes que
codifica la síntesis de la toxina alfa se ubican en el cromosoma bacteriano.
Clostridum novyi comprende los toxinotipos A, B y C (Tabla 4). El factor de virulencia
más importante de esta especie bacteriana es la toxina alfa; su codificación genética se
encuentra mediada por un fago. La toxina beta es una fosfolipasa con actividad hemolítica,
necrotizante y letal. No se conoce completamente la función de las restantes toxinas, deno-
minadas gama, la cual es una fosfolipasa con actividad necrotizante, delta, una hemolisina
lábil al oxígeno y epsilon. Clostridium haemolyticum es semejante a C. novyi B, pero produ-
ce toxina beta en mayores cantidades que éste y no elabora toxina alfa (Tabla 4).
Clostridium sordellii produce fosfolipasas, una hemolisina lábil al oxígeno, una toxina le-
tal (TL) y una hemorrágica. La TL posee un alto peso molecular y presenta una secuencia
R
de aminoácidos similar a la toxina B de C. difficile y a la toxina alfa de C. novyi, pero difiere
en los receptores celulares a los cuales se une. Mediante su actividad de glicosiltransfera-
sa todas estas toxinas alteran la estructura de los filamentos de actina y con ello el citoes-
queleto de las células blanco. La TL es antigénica y su antisuero da reacción cruzada con
TO
la citotoxina de C. difficile.
La toxicidad de C. difficile resulta de la acción de TcdA (308 kDa), con acción de en-
terotoxina y TcdB (269 kDa) citotóxica y de potencia 1.000 veces mayor. Cada una de
ellas está formada por una cadena única con una fuerte homología entre sí. Poseen tres
dominios: el N terminal presenta la actividad tóxica, el C terminal es el responsable de la
fijación a los receptores celulares y en el medio de ambos, existe una región implicada en
AU
la internalización de la toxina. Según su capacidad de elaborar una o ambas toxinas las
cepas se clasifican como A+ /B+ o A/B+. Las toxinas se internalizan por endocitosis y en
el citoplasma de la célula hospedadora provocan despolimerización de la actina, pérdida
del citoesqueleto y muerte celular. Se altera la barrera epitelial, aumenta la permeabi-
lidad de la mucosa del colon y se produce diarrea. Algunas cepas elaboran una toxina
binaria, Cdt que se une en forma irreversible a la actina e induce la formación de largas
protuberancias de microtúbulos en la célula hospedadora, favoreciendo la adherencia
A
bacteriana. Ambas toxinas se encuentran codificadas en el cromosoma en un locus de

patogenicidad PalLoc (19,6 kb) junto a los genes reguladores tcdC, tcdR (anteriormente
tcdD) y tcdE. El gen tcdC actúa como regulador negativo y las cepas que producen altos
niveles de toxinas presentan una alteración en el mismo. La toxina CDT también está
PI
codificada en el cromosoma por los genes cdtA y cdtB, ubicados en el locus CdtLoc, el
cual codifica además el gen regulador positivo cdtR.
Clostridium tetani produce una hemolisina denominada tetanolisina sin significancia
patogénica importante y una neurotoxina denominada tetanopasmina, responsable de la
O
signología de la enfermedad. La toxina se sintetiza como un precursor inactivo ligado a

la pared bacteriana. Con la lisis del microorganismo se libera y se fragmenta por las pro-
teasas bacterianas en una cadena pesada y una liviana. Esta toxina tiene como blanco a
C
las neuronas reguladoras de la médula espinal y llega a las mismas a través de los axones
de las neuronas motoras o por vía sanguínea. El extremo C terminal de la cadena pesada
es el responsable de la adherencia al receptor proteico de la membrana de las neuronas
motoras periféricas. La región N terminal dirige la penetración de la toxina y la cadena livia-
na es la responsable del bloqueo de los neurotransmisores. La presencia de anticuerpos
Tabla 5: Características de los grupos de C. botulinum.

Temperatura óptima Produción de Fermentación de
Grupo Toxinas Actividad proteolítica
de desarrollo (ºC) lipasa glucosa
I A,B,F + 3540 + +
II B,E,F - 1825 + +
III C,D - 40 + +
IV G + 37 - -

Clostridium
puede bloquear este paso. La toxina tetánica no se une a proteínas celulares formando
complejos, como ocurre con la toxina botulínica. Esta aparente desprotección es la causa
de no presentar actividad tóxica por vía oral, ya que resulta expuesta a las enzimas del
tracto digestivo. Los genes codificantes de esta toxina se encuentran en un fago en estado
lisogénico.
Con respecto a C. botulinum se conocen toxinotipos denominados con letras, desde A
hasta F, todos productores de una neurotoxina con idéntica actividad, pero diferente en
su estructura antigénica, potencia y distribución (Tabla 5). C. botulinun G se denomina
actualmente C. argentinense. Estas toxinas son las responsables del cuadro de parálisis
flácida característico del botulismo. Son las toxinas bacterianas más potentes que se co-
nocen: la dosis letal para un humano adulto está estimada entre 0,1 a 1 mg para la toxina
botulínica A. Un ejemplo teórico muestra que 1 gramo de toxina diseminado o inhalado
puede ser mortal para más de un millón de personas. De hecho esta extrema toxicidad
R
ha convertido a las toxinas botulínicas en una de las principales armas biológicas que
se conocen. Por el contrario, se emplean puntualmente en diluciones elevadas para el
tratamiento de afecciones caracterizadas por una hiperactividad muscular o trastornos
TO
musculares espásticos o también, con fines estéticos.
Las toxinas botulínicas se sintetizan como un precursor inactivo en una cadena polipep-
tídica de 150 kDa. Es necesaria la lisis bacteriana para que se liberen. Una vez liberadas
se fragmentan por las proteasas de la bacteria o por enzimas digestivas como la tripsina,
a nivel del N terminal dando origen a dos cadenas, una pesada y una liviana, unidas por
un puente disulfuro. Se asocian a proteínas no tóxicas para formar complejos de mayor
AU
tamaño, llegando a los 300 kDa. Esta asociación permite el pasaje por el tracto intestinal
evitando la acidez gástrica y la acción de las enzimas digestivas.
La porción C terminal es la responsable de la unión a un receptor de la membrana
celular de las neuronas, la región N terminal regula la penetración y la cadena liviana es
la responsable del bloqueo de la liberación del neurotransmisor. Las vesículas que con-
tienen la neurotoxina botulínica se ubican en la extremidad presináptica de la neurona
(contrariamente a lo que sucede con las vesículas que contienen la toxina tetánica).
Cuando se produce la endocitosis de la toxina, ésta ya no se puede neutralizar con
A
anticuerpos. Dentro del citosol la cadena liviana inhibe la liberación de acetilcolina. El

músculo no se contrae dando como resultado una parálisis flácida. Los genes codifi-
cantes para las toxinas de C. botulinun A, B, E y F se encuentran a nivel cromosómico,
PI
para la toxina G, en plásmidos y para las toxinas C y D se encuentran en fagos.

Clostridium spiriforme produce una toxina necrótica y letal, que es neutralizada con anti-
cuerpos anti toxina iota de C. perfringens. Es una toxina binaria con actividad sobre las fi-
bras de actina, a las que destruye. Se puede detectar por su efecto sobre cultivos celulares.
O
Otros factores de patogenicidad

Como se mencionó, las especies patógenas como C perfringens, poseen la caracterís-
C
tica de elaborar una cápsula de composición polisacárida que evade la fagocitosis.

Algunos autores incluyen la presencia de flagelos como otro factor de patogenicidad
pero, en el caso de los clostridios resulta un elemento menor en comparación con la agre-
sividad que presentan sus toxinas.
También se describe una estructura de glicoproteínas con prolongaciones filamentosas
en la superficie del esporo, por fuera del exosporio, que se supone contribuye a la unión
con los receptores celulares. Si bien provee la primera interacción entre el microorganismo
y la célula blanco, no se considera un auténtico factor de patogenicidad.
Respuesta inmune
En el género Clostridium la integridad estructural de su compleja pared bacteriana, en
especial de las proteínas de superficie y de los ácidos teicoicos, constituye un componente
antigénico importante, en conjunto con las toxinas. Estas son inmunógenas y generan, si el
Clostridium
tiempo de invasión lo permite, una respuesta humoral importante y protectora. Su actividad

principal se puede neutralizar por antisueros específicos.
Los animales suelen tener un nivel basal de anticuerpos contra especies de clostridios
residentes de su organismo o habitantes del ambiente circundante. La respuesta inmune
natural se puede detectar en los herbívoros, especialmente en bovinos y en ovinos, en
los cuales se han encontrado anticuerpos circulantes dirigidos a componentes de la pared
celular y en algunos casos a las toxinas. De hecho, en animales adultos sin antecedentes
de vacunaciones, criados a campo, se detectan anticuerpos contra diferentes especies de
Clostridios.
En los herbívoros se ha demostrado la importancia de la inmunidad calostral. En los
rumiantes los anticuerpos calostrales contra los Clostridios permenecen en niveles consi-
derados protectores aproximadamente hasta los 2 a 3 meses de edad, etapa que coincide
R
con la aplicación de inmunógenos o, con la formación de sus propios anticuerpos contra
las bacterias de su entorno.
TO
Patogenia
El desarrollo de las infecciones clostridiales es el resultado del efecto combinado de la
acción local del microorganismo y de la actividad de las toxinas que elabora.
Las esporas de los clostridios presentes en el suelo o en las pasturas ingresan a los
animales por vía oral y pueden continuar en esta forma o germinar en el tracto intestinal y
eliminarse por materia fecal y contaminar el suelo, donde permanecen viables por extensos
AU
períodos de tiempo, para repetir su ciclo. En algunos casos, del intestino pueden emigran a
otros órganos y tejidos y se ubican en forma particular en algunos, como músculo e hígado,
donde encuentran las condiciones adecuadas para su desarrollo y para la producción de
las toxinas.
En otros casos como en las enterotoxemias, suelen existir factores predisponentes de
trastornos digestivos, como son el cambio brusco de la alimentación, situación que ocurre
en sistemas de cría intensivos (feed lot) o una desparasitación inadecuada o ausente.
Aquí los gérmenes se multiplican en forma rápida y producen un elevado nivel de toxinas
A
que aumentas la permeabilidad intestinal, se absorbe, pasa a la circulación y produce sus

efectos letales.
PI
El sinergismo con otros microorganismos puede aumentar la invasividad de los clostri-

dios. La relación parásito bacteria se pudo comprobar por ejemplo en infecciones de C.
haemolyticum, donde la invasión y el daño hepático por formas inmaduras de Fasciola
favorecen el desarrollo de la enfermedad.
Clostridium chauvoei se suele encontrar como residente en el intestino, hígado, músculo
O
y materia fecal de los herbívoros, especialmente en rumiantes. Es patógeno exclusivo de

los animales y produce una miositis gangrenosa que afecta principalmente a bovinos y a
ovinos en general de menos de tres años de edad, denominada carbunclo sintomático,
C
pierna negra (blak leg) o mancha. En el intestino, algunas esporas son captadas por los
macrófagos de la mucosa intestinal que las transportan al hígado y al músculo estriado,
donde permanecen latentes. Ante un trauma o una herida con lesión de tejidos, se produce
un ambiente anaerobio favorable, las esporas germinan y elaboran toxinas. Las toxinas
aumentan las condiciones para la multiplicación bacteriana, la lesión se incrementa y los
productos tóxicos se diseminan vía sanguínea provocando la muerte del individuo afecta-
do. Los pastos o el agua contaminados con las esporas suelen ser fuente de infección de
otros animales y así continuar su ciclo en la naturaleza.
Clostridium septicum se encuentra comúnmente en el suelo y en pasturas y puede residir
en el intestino. Es un agente primario de gangrenas gaseosas en el hombre y en diversas es-
pecies animales. La infección se adquiere a través de heridas, por transmigración intestinal,
por contaminación quirúrgica o por contaminación del cordón umbilical. En los rumiantes, es-
pecialmente en ovinos, la infección se asocia a heridas en el tracto digestivo causadas por la
ingestión de pastos congelados, en zonas de clima muy frío, los cuales producen heridas en
Clostridium
el abomaso. Esta afección se conoce como bradsot o braxy. También puede ser un invasor
post mortem en distintos tejidos. Su aparición como contaminante en las muestras, el rápido
desarrollo y la invasividad suele confundir los diagnósticos y a veces se lo asigna como agen-
te causal de patologías, cuando en realidad es un invasor secundario.
Clostridium novyi se encuentra diseminado en el suelo en estado esporulado y puede
residir en el intestino y vísceras de los animales. C. novyi A es agente de gangrenas en el
hombre y en los animales y se asocia con infecciones necróticas agudas y edematosas de
los tejidos subcutáneo y muscular. C. novyi B causa hepatitis necrótica en herbívoros, a
veces asociado a parasitosis donde el estado larvario, en su migración por el hígado des-
truye el tejido hepático, genera necrosis y las condiciones adecuadas para su desarrollo
y posterior producción de toxinas. C. novyi C, raramente aislado, se asocia a osteomielitis
en los búfalos.
R
Las esporas de C. haemolyticum (anteriormente denominado C. novyi D) se encuentran
en el suelo e ingresan a los animales por vía digestiva. Pueden residir en el intestino o
migrar al hígado. Esto ocurre generalmente en animales jóvenes y también, con antece-
dentes de parasitosis de alojamiento hepático. La producción local de toxina beta provoca
TO
necrosis hepática y su diseminación por vía sanguínea, hemólisis intravascular y hemorra-
gias, con la muerte del animal.
Clostridium sordelli se encuentra en el suelo e intestino de animales. Se aísla junto con
otras especies de gangrenas gaseosas en animales y de contaminantes de heridas quirúr-
gicas en humanos. Puede causar enterotoxemias sobre todo en animales estabulados o
hacinados.
AU
Clostridium perfringens es un microorganismo residente en el intestino grueso del hom-
bre y de la mayoría de los animales. De allí puede pasar al suelo y las pasturas y también
se puede transmitir por contaminación fecal al agua y a ciertos alimentos. Es agente de
gangrenas y de enterotoxemia en el hombre y en los animales. También se incluye como
productor de intoxicaciones alimentarias por acción de la enterotoxina que elabora.
Clostridium difficile se puede encontrar en el intestino del hombre y de algunas especies
de herbívoros y carnívoros. Se elimina por materia fecal. Se discute si el perro puede ac-
A
tuar como transmisor al hombre. Produce una colitis pseudomembranosa consecutiva a la

administración de determinados antibióticos, generalmente macrólidos, que inhiben otros
agentes microbianos presentes en el intestino. Para que se desarrolle el cuadro patológico
PI
es necesario este terreno, más la presencia de cepas productoras de toxinas. El cuadro

suele remitir al suspender la terapia antibiótica y mantener la homeostasis del individuo.
Clostridium botulinun posee amplia distribución en el suelo, vegetales en descomposi-
ción y en ambientes acuáticos y, también suele estar presente en el intestino de rumiantes,
sobre todo en el bovino. En condiciones óptimas las esporas germinan con el desarrollo
O
de las células vegetativas y la producción de las toxinas, contaminando peces, vegetales o

granos ensilados y carcasas de animales muertos.
El botulismo se puede originar como una intoxicación, la mayoría de las veces por in-
C
gestión de toxina preformada o como una toxiinfección, por ingestión de esporas que ger-
minan en el tubo digestivo y producen la correspondiente toxina. Son muy raros los casos
donde el microorganismo o la toxina penetran a través de heridas. El ingreso de toxinas por
inhalación se puede producir en forma accidental o por acciones de bioterrorismo. En los
animales la intoxicación se puede originar por contaminación de heno ensilado o en zonas
con suelos deficientes en minerales, donde se produce la ingesta de esqueletos de bovinos
muertos y con ellos, el ingreso de las toxinas.
En Argentina se describió por primera vez el botulismo en los bovinos en la provincia de
Corrientes, departamento de Santo Tomé, cercano al río Aguapey, de donde tomó la deno-
minación de “Mal del Aguapey”, como se lo conoce localmente. Otra forma de afección, que
ocurre principalmente en las aves acuáticas, resulta de la ingestión de toxina a partir de
aguas estancadas, contaminadas con el microorganismo. En todos los casos se caracteri-
za por una parálisis fláccida, simétrica y descendente. La misma comienza por los pares de
nervios craneales, desciende hacia los músculos del tórax y de las extremidades y puede
Clostridium
causar la muerte del individuo por falla respiratoria. En las aves un signo característico es
el “cuello colgante” debido a la falta de tonicidad de la musculatura intervertebral.
Clostridium tetani se encuentra en el intestino de los animales y excepcionalmente del
hombre. Los herbívoros contribuyen a la diseminación de las esporas a través de la materia
fecal. Las esporas viables pueden o no germinar en el tubo digestivo y la toxina formada,
así como la que puede ingresar por vía oral, no resulta tóxica, ya que se degrada por las
enzimas intestinales. Las esporas ingresan por heridas profundas o con destrucción de
tejidos, por el cordón umbilical en recién nacidos o por maniobras quirúrgicas sin asepsia.
En el ambiente adecuado el microorganismo se multiplica y sintetiza una neurotoxina que
se une a los gangliósidos en las membranas sinápticas impidiendo la exportación de neu-
rotransmisores liberadores de la sinapsis. Las neuronas reguladoras de la médula espinal
son las células blanco. El resultado es una hiperexitabilidad de las neuronas motoras con
una contractura generalizada y permanente de la musculatura estriada. Finalmente se pro-
R
duce la muerte por parálisis espástica de los músculos respiratorios.
Clostridium spiriforme se encuentra en el ambiente y en el intestino de conejos y otros
roedores, en especial de laboratorio, donde puede causar patologías al alterar el equilibrio
TO
microbiano luego de la administración de quimioterápicos o por fallas de higiene o alimen-
tación. Causa enteritis necrótica. La prevención y el tratamiento se basan en un manejo
sanitario adecuado y en la administración de antibióticos como penicilina o metronidazol.
Clostridium colinun puede residir en el intestino de aves silvestres y domésticas. Produce
un cuadro de enteritis asociada a antibióticoterapia en las aves, similar al causado por otras
especies de Clostridios.
AU
Diagnóstico microbiológico
Recolección y transporte de muestras
La rápida recolección, el transporte adecuado y la conservación de la muestra son pro-
cesos de importancia primaria para la posterior recuperación de los clostridios. La muestra
seleccionada para el estudio bacteriológico se debe extraer en condiciones higiénicas y lo
más rápido posible después de la muerte del animal. Se coloca en recipientes estériles o
A
bolsas de polietileno y se envía al laboratorio refrigerada a 4 ºC, en forma inmediata a su

obtención. La congelación a -20 ºC no se recomienda debido a que es perjudicial para al-
gunos anaerobios y la absorción del oxígeno por los tejidos es mayor a bajas temperaturas.
PI
También se pueden enviar dentro de placas de Petri, en el interior de bolsas especiales,

selladas, con generadores de anaerobiosis.
En caso de tejidos se recomienda trozos de 5 cm como mínimo. Las muestras líquidas
se pueden aspirar con jeringa e introducir el contenido en tubos estériles, con preferencia
O
de material plástico, formando una columna de por lo menos 5 cm. También se pueden
introducir directamente en recipientes tipo frasco ampolla, que se obtienen en el comer-
cio con un medio pre reducido.
C
Las muestras destinadas a la investigación toxicológica se pueden obtener a partir de

contenido intestinal, líquidos tisulares o exudados serosos. Se colocan en recipientes es-
tériles y se mantienen entre 2 y 7 ºC, hasta su procesamiento. Al contenido intestinal se
pueden agregar gotas de cloroformo, para reducir la multiplicación de contaminantes.
Para estudios histopatológicos se envían los tejidos afectados y los adyacentes aparen-
temente sanos, en trozos no mayores de 0,5 cm, en frascos de boca ancha con formol (10
partes de formol al 10 % con 1 parte de muestra).
Es conveniente agregar extendidos de sangre, de líquidos tisulares, de improntas de
órganos lesionados y frotis de contenido intestinal para el examen directo. Los extendidos
tienen un valor diagnóstico importante dado que evidencian la proporción en que se hallan
los distintos microorganismos en el momento de obtención de la muestra y el grado de
contaminación, si la hubiera. La observación de los extendidos al microscopio puede sumi-
nistrar información de interés para orientar el trabajo posterior e incluso en muchos casos
dar una respuesta rápida si se dispone de anticuerpos fluorescentes específicos.
Clostridium
El envío de la muestra se debe acompa- Tabla 6. Características de las especies de

ñar siempre de una historia clínica detallada Clostridium de importancia clínica.
indicando la fecha de toma de los materia-
les, la especie animal, raza, edad, sexo y
Crecimiento aeróbico
Hidrolisis de gelatina
Esporos
número de animales sanos y afectados en el
establecimiento y/o lote donde se presenta
Lecitinasa
Lipasa
el problema. Es interesante mencionar otras
Indol
Ubicación
Especie
Forma
enfermedades anteriores y los antecedentes
de vacunaciones y tratamientos recibidos
hasta el momento y cualquier otra informa-
ción considerada de interés. C. aldenense * - - - - +
C. argentinense s/d ST - + - - -
C. baratii s/d ST - - + - -
R
Identificación C. bifermentans O ST - + + - +
Para llegar a un correcto diagnóstico el C. bolteae s/d ST - - - - -
criterio es realizar el aislamiento y la identifi- C. botulinum
cación de cada especie, la detección de sus
TO
Tipo A, B, F O ST - + - + -
toxinas o, según el caso, de estructuras ge- Tipo B, E, F O ST - + - + -
néticas características. Para ello es irreem- Tipo C, D O T - + -+ + -+
plazable el uso de técnicas de laboratorio C. butyricum O ST - - - - -
adecuadas y normatizadas. C. cadaveris O T - + - - +
C. carnis s/d ST + - - - -
El desarrollo se puede detectar entre las +
C. chauvoei O ST - - - -
24 y las 72 horas de cultivo a 37 °C en at- -
AU
mósfera anaerobia. En medios sólidos las C. citroniae * - - - - +
C. clostridioforme O ST - - - - -
colonias varían según la especie, pero en
C. difficile O STT - + - - -
general son pequeñas y transparentes o li-
C. glycolicum s/d ST - - - - -
geramente grisáceas. Al tomar contacto con C. haemolyticum O ST - + - + +
el oxígeno se tornan opacas. Algunas espe- C. hastiforme s/d T - + - - -
cies pueden formar colonias redondas y cre- C. hathewayi s/d ST - - - - -
mosas, mucoides. C. histolyticum O ST +- + - - -
A
Para diferenciar las especies se conside- C. indolis s/d T - - - - +

ran las características morfológicas como C. innocuum O T - - - - -
tamaño, agrupación, ubicación de la espora, C. limosum O ST - + + - -
movilidad, presencia de cápsula, aerotole- C. novyi A O ST - + + + -
PI
rancia, actividad proteolítica (gelatinasa) y/o C. novyi B O ST - + + - -

sacarolítica y el resultado de pruebas com- C. paraputrificum s/d T ST - w
- - -
C. perfringens O ST - + + - -
plementarias como la detección de lecitina-
C. putrificum O T ST - + - - -
sa, lipasa, ureasa, la producción de SH2 y de
O
C. ramosum O T - - - - -
indol y la fermentación de otros carbohidra-
C. septicum O ST - + - - -
tos (Tabla 6). C. sordellii O ST - + + - +
C. sphenoides R STT - - - - +
C
Flujograma de marcha bacteriológica C. sporogenes O ST - + - + -

C. subterminale O ST - + -+ - -
En la Figura 1 se detalla un flujograma
C. symbiosum s/d ST w
- - -
modelo para el aislamiento e identificación C. tertium O + T - - - -
de un clostridio a partir de una muestra clíni- C. tetani R - T + w
- v
ca. En algunos casos, para realizar un diag-
nóstico presuntivo o cuando existe urgen- O: oval; T: terminal; ST: subterminal; (+): reacción positiva; (-):
cia por el riesgo de vida de los individuos, reacción negativa; v: variable; w: débil; s/d: sin dato. U: ureasa;
se indica directamente la detección de la/s Pro: prolina aminopeptidasa; L: lactosa; bNAG: beta-N-Acetilglu-
toxina/s específicas mediante técnicas de cosaminidasa.
rulados.
*: Bacilos gram negativos en general no espo-
neutralización o moleculares, las cuales se

mencionarán más adelante.
Una forma rápida y práctica de identificación para los aislamientos clínicos es el em-
pleo de métodos automatizados o semi automatizados. Entre ellos se encuentran galerías
miniaturizadas como API 20 A, API-ZYM 20A y RapID 32 A (bioMérieux, Marcy, l’Etoile,
Clostridium
Tabla 6 cont. Características de las especies de Clostridium de importancia clínica.
Hidrólisis de esculina
Reducción de nitrato
Fermentación de
Otras
Arabinosa
Celobiosa
Melibiosa
Sacarosa
Fructosa
Especie
Glucosa
Manosa
Lactosa
Maltosa
Salicina
Manitol
Ribosa
Xilosa
β-Gal+ βGal+
C. aldenense V - + V - V + - + s/d s/d V + +
Rham-
C. argentinense - - - - - - - - - - - - - - -
+ w w +
C. baratii + - + - + + + + - + w
w -
- + -
+
R
C. bifermentans - - + - - w
- w -
- w
- - - - - U-
C. bolteae -+ - + + s/d + - + - + s/d - +
+ + βNag -
C. botulinum
+
TO
Tipo A, B, F + - - - - w
- w
- - - - - - -
w +
Tipo B, E, F - - + - - + w
- + - w
w
w
v - + w
-
Tipo C, D - - + - - v - v - v w
v - - -
+ +
C. butyricum + - + - + + + + w
+ + w
+ w
w + +
C. cadaveris - - + - - v - - - w
- - - - -
w w
C. carnis + - + - +w v v + - + - - w w+ -
AU
+
C. chauvoei + v + - - w
+ + - w - v - + v
β-Gal βGal-
C. citroniae - - + V - s/d V + - + s/d s/d - + +
Rha+
+ β-Gal+ βGal+
C. clostridioforme + - + + + +w + + - + v v + +w w
βNag-
+ w
C. difficile + - w - v + w
- - + v - w w
- w
Pro +
+
C. glycolicum - +
- + - - + w
- v - - - - - - -
+
C. haemolyticum - - + - - - - - - - - - - -
A
C. hastiforme - -+ - - - - - - - - - - - - -
+
C. hathewayi w - + v + + + + - + + + + + + βNag -
PI
C. histolyticum - - - - - - - - - - - - - - -
+ w w w w
C. indolis + - + - +w v+ + +
w w
-w w
- v v
+ +
C. innocuum + - + -+ + + w
- w + - v w +w w
Pro-
C. limosum - - - - - - - - - - - - - - -
O
C. novyi A - - + - - w
- v - - w
v w
- -
C. novyi B - - + - - - - + - - v - - -
C. paraputrificum + -+ + - + +w + + - + - w- + + -
C. perfringens v v + - + + + - + v v +
+ -
+
C
C. putrificum - +
- w - w w
- w
- - - - - - -
+
C. ramosum + - + - + + + + - + + -
v + + w
C. septicum + v + - +w + + + - + - v v - -
C. sordellii -+ - + - - v - w - w
- w
- - - U+
+ w + w +
C. sphenoides + - + w
+w +w + w + w v w
v w- v ADNsa+
C. sporogenes + - + - w
- - w
- - - - - - -
C. subterminale -+ - - - - - - - - - - - - - -
+
C. symbiosum - - w v - + -+ - - v - - - - -
+ w + +
C. tertium + - + - + w
+ + + + w + w
+ w
w + v
C. tetani - - - - - - - - - - - - - - -
O: oval; T: terminal; ST: subterminal; (+): reacción positiva; (-): reacción negativa; v: variable; w: débil; s/d: sin dato. U: ureasa; Pro:
prolina aminopeptidasa; L: lactosa; bNAG: beta-N-Acetilglucosaminidasa. *: Bacilos gram negativos en general no esporulados.

Clostridium
Muestra clínica
Observación microscópica con Gram

Bacilos grandes Gram positivos (o desteñidos)
Observación de cápsula y esporas (según especie)
Siembra en agar sangre

Incubación a 37 ºC, hasta 72 horas en atmósfera
Aerobia Anaerobia
R
colonias
Sin desarrollo
según especie
hemólisis
TO
incubación con CO2 Observación microscópica con Gram
Desarrollo (-) Bacilos grandes Gram positivos, esporulados
AU
Producción de catalasa (-)
Agar yema de huevo Medio líquido Movilidad
Lecitinasa/Lipasa
Producción de indol Fermentación de H de C
A
SH2 Glucosa
ureasa Lactosa
Sacarosa
Maltosa
PI
Salicina
Glicerol
Inulina
Detección de toxinas (según la especie)
Determinación de toxinotipo (según la especie)
O
Figura 1: Esquema básico de identificación bacteriológica a partir de muestras clínicas.

France) y RapID ANA II (Remel, Inc., Lenexa, KS); tarjetas con pruebas cinéticas de lec-
tura automatizada como Vitek 2 (bioMérieux, Marcy, l’Etoile, France) y paneles de lectura
C
directa o automatizada como MicroScan (Siemens-Alemania). Estos equipos proporcionan

resultados de lectura rápida de una cantidad considerable de pruebas y evitan la prepara-
ción de los medios de cultivo específicos, por lo cual pueden ser de utilidad en los labora-
torios de microbiología clínica. Sin embargo, la exactitud de los resultados, según distintos
autores, varía de acuerdo a la especie en cuestión.
La interpretación de sus resultados se realiza en forma conjunta a través de una base de
datos proporcionada por cada fabricante. Estas bases de datos no siempre consideran las
características morfológicas y tintoriales de la bacteria y además, en lo referente al género
Clostridium no incluyen algunas pruebas diferenciales como son la producción de leciti-
nasa y lipasa. Por estos motivos, se debe proceder con precaución para la validación del
resultado. Desde la práctica se recomienda que las pruebas se lean en forma individual y
que los resultados obtenidos se complementen con los ensayos metabólicos faltantes, con
las características morfológicas, tintoriales y culturales y, que la interpretación conjunta se
efectúe mediante datos o tablas actualizadas.
Clostridium
Significado del aislamiento

Debido a la ubicuidad ambiental de estos microorganismos y a sus exigencias de cultivo,
se deben seguir determinadas pautas de diagnóstico para no identificar especies invasoras
como agentes etiológicos primarios y, por el contrario, para no perder aquellas de cultivo
dificultoso o extremadamente lábiles por la acción del oxígeno ambiental.
La valoración requiere el procesamiento de especímenes adecuados y la integración de
los hallazgos microbiológicos sobre todo con los datos clínicos y también con los epide-
miológicos.
Características diferenciales
Las especies patógenas de clostridios de importancia en medicina veterinaria poseen
R
características diferenciales.
Clostridium chauvoei es un bacilo pleomórfico, móvil, con espora deformante de ubica-
ción subterminal. Esporula con facilidad dado que es altamente sensible al oxigeno. La
TO
espora presenta una elevada resistencia a los agentes ambientales. Se define como Gram
positivo en cultivos jóvenes pero pierde la afinidad por los colorantes de anilina cuando ha
superado la fase exponencial de crecimiento.
Para su cultivo requiere proteínas y una atmósfera con estricta anaerobiosis. Posee una
alta demanda de cisteína que resulta un factor limitante para su desarrollo. También requie-
re biotina, piridoxina y ácidos pantoténico y nicotínico.
AU
En medios de cultivo sólidos con el agregado de sangre, durante 48 horas a 37 ºC en at-
mósfera anaerobia forma colonias pequeñas, de 2 a 4 mm de diámetro, con una depresión
central, rodeadas de una estrecha zona de hemólisis completa, de 1 a 2 mm, la cual se
intensifica si se expone el cultivo al frío (4 ºC). Posee actividad fermentativa sobre diversos
carbohidratos.
Clostridium septicum es un bacilo pleomórfico, que presenta esporas ovales, subtermi-
nales y deformantes. Es muy móvil, in vitro tiende a diseminarse por los medios de cultivo
sólidos y forman una película o swarming, algunas veces homogénea, que puede cubrir la
A
superficie del agar y ser difícil de detectar; para aislarlo se deben emplear medios de con
mayor concentración de gelificantes que la usual. Desarrolla en forma rápida, en 24 horas
se pueden observar las colonias irregulares o rizoideas, que presentan hemólisis completa
PI
sobre agar sangre.

Clostridium novyi es un bacilo esporulado, con espora deformante, móvil. Pierde con
rapidez la afinidad por los colorantes de anilina. Es extremadamente exigente en cuanto
a nutrientes y anaerobiosis para su desarrollo. Las colonias se pueden evidenciar entre
O
las 48 y 72 horas de incubación anaerobia. Es muy móvil y tiende a diseminarse sobre la

superficie de los medios sólidos.
Clostridium haemolyticum, anteriormente designado como C. novyi tipo D. Fenotípica-
C
mente es semejante a C. novyi tipo B, con la excepción que produce toxina beta en ma-
yores cantidades y no produce toxina alfa. En agar sangre produce una zona de hemólisis
completa muy evidente.
Clostridium sordelli se observa como bacilos rectos, en general agrupados de a 2 o 3 en
paralelo, con esporas cilíndricas, no deformantes, Gram positivos. Es muy poco móvil y no
es tan exigente en nutrientes y anaerobiosis como otras especies. Sobre placas con agar
sangre puede desarrollar en 24 horas a 37 ºC, presentando una zona evidente de hemólisis
completa. Como actividad bioquímica diferencial produce indol y ureasa.
Clostridium perfringens se presenta como un bacilo de extremos rectos. Posee espo-
ras ovales de ubicación subterminal, pero en los medios de cultivo usuales raramente se
detectan. Carece de flagelos. Algunas cepas pueden formar una cápsula de composición
polisacárida compleja que se evidencia con mayor facilidad en aquellas que producen co-
lonias mucoides.
Clostridium
No es muy exigente en cuanto a nutrientes y anaerobiosis. Desarrolla con facilidad en

24 horas a 37 ºC en medios con sangre, produciendo colonias de 3 a 4 mm de diámetro,
con hemólisis generalmente evidente. Algunos tipos, en especial el toxinotipo A producen
un halo de hemólisis doble, característico. Posee una actividad metabólica sacarolítica in-
tensa que facilita su identificación bioquímica. Otra característica de fácil demostración en
los laboratorios clínicos es la reacción de CAMP reversa que se realiza sobre agar sangre
ovina frente a una cepa de Streptococcus agactiae.
Clostridium botulinun, es un bacilo grueso de 0,9 a 1,2 por 4 a 6 mm, con esporas ovales
deformantes, de ubicación subterminal, móvil y muy exigente de nutrientes y de anaerobio-
sis. Requiere un pH neutro para su desarrollo.
Las cepas de C. botulinun son heterogéneas fenotípica y genéticamente y se han reuni-
do en cuatro grupos. (Tabla 5)
R
El grupo I incluye cepas proteolíticas, que desarrollan con una temperatura óptima de
35 a 40 ºC, con las esporas más resistentes al calor, productoras de toxina A, B, F o una
mezcla de A+B, A+F y B+F.
TO
El grupo II comprende cepas sacarolíticas, sin actividad proteolítica, con una temperatu-
ra óptima de desarrollo entre 18 y 25 ºC, con esporas no resistentes al calor y que sinteti-
zan toxinas B, E o F.
El grupo III incluye cepas no proteolíticas que cultivan a 40 ºC como temperatura óptima,
con esporas moderadamente resistentes al calor y que producen toxinas C o D. La toxina
C es binaria presentando dos fracciones, C1 y C2. Los tipos toxigénicos C se denominan C
AU
alfa o C beta según la fracción predominante. El tipo toxigénico D presenta la fracción C2
en pequeñas cantidades.
El grupo IV comprende cepas proteolíticas, que no producen lipasa, pueden o no espo-
rular, cultivan con un óptimo de 37 ºC y elaboran toxina G.
El diagnóstico de botulismo se basa en la detección de toxina involucrada en alimentos,
heces, suero y tejidos de los individuos afectados y en el caso de animales. La identifi-
cación de la toxina botulínica se realiza en laboratorios de referencia mediante técnicas
de neutralización en animales de laboratorio con las antitoxinas específicas de tipo o por
A
enzimo inmuno análisis (EIA), pero su sensibilidad es menor que la de la prueba biológica.
Clostridium tetani presenta una forma característica de bacilo largo y fino, de 0,4 a 0,6 por
2 a 5 mm con la espora terminal (palillo de tambor). La mayoría de las cepas son móviles.
PI
Es muy exigente en cuanto a nutrientes y anaerobiosis, por lo que su cultivo es dificultoso.

En agar sangre desarrolla colonias pequeñas de bordes irregulares con un pequeño halo
de hemólisis completa a su alrededor. Posee actividad proteolítica. El diagnóstico de labo-
ratorio demora entre 72 y 96 horas por lo cual ante una sospecha de tétanos se realiza en
O
primer lugar un diagnóstico clínico para instaurar en forma rápida el tratamiento adecuado.
Clostridium difficile es un bacilo grande de 0,5 a 1,5 por 3 a 6 mm, generalmente agru-
pado en cadenas de 2 a 6 células, móvil, con espora deformante y una cubierta cristalina
C
de proteínas de superficie (S-layer). Es muy exigente en cuanto a nutrientes y requiere el

agregado de vitamina K, hemina y cisteína a los medios de cultivo y una anaerobiosis es-
tricta. Desarrolla en 48 horas a 37 ºC. Las colonias son grisáceas con bordes irregulares y
de los cultivos se desprende característico olor “a establo”.
Clostridium spiriforme, denominado así por la forma característica que presenta cuando
desarrolla en agar sangre, como un bacilo helicoidal, Gram positivo. En los extendidos a
partir de contenido intestinal aparece como un bacilo curvo con espora terminal. En agar
sangre forma colonias grises y circulares, no hemolíticas.
Pruebas de diagnóstico alternativas

Cromatografía gaseosa
Se basa en la detección de ácidos grasos volátiles a partir de un cultivo, ya que cada
especie posee un perfil cromatográfico determinado que contribuye a su identificación.
Clostridium
Se ha empleado con frecuencia en laboratorios de investigación para confirmar las es-

pecies aisladas pero tiene muy poca aplicación clínica por el equipamiento requerido y
su complejidad. En la actualidad se reemplaza por técnicas moleculares más precisas y
rápidas.
Inmunofluorescencia
Este método se ha utilizado en el diagnóstico de infecciones tisulares en animales. Re-
quiere de un equipamiento y de reactivos específicos normatizados. Además, la presencia
de clostridios residentes en algunos tejidos, como por ejemplo en hígado y músculos, afec-
ta el valor predictivo positivo de esta prueba, motivos por los cuales esta metodología se
encuentra en desuso en la actualidad. Se puede realizar un diagnóstico presuntivo a partir
de improntas de tejidos, pero recordando que su sola presencia no indica que sea el agente
R
etiológico de la afección producida.
Identificación serológica y/o biología molecular
TO
Para la determinación de toxinotipos o para la detección de las toxinas se emplean téc-
nicas de seroneutralización en animales de laboratorio, o técnicas de detección in vitro
como enzimo inmuno ensayo (EIA) o métodos moleculares. Algunas toxinas clostridiales
producen efectos definidos sobre cultivos de líneas celulares, pero estas metodologías no
se encuentran aún normatizadas o validadas internacionalmente.
La investigación de toxinas sobre animales de laboratorio se realiza en ratones blancos,
AU
de 20 a 25 g, por vía intraperitoneal o endovenosa. El cultivo a tipificar se centrifuga o se
filtra, para separar la masa bacteriana y se inocula con o sin aplicación previa de tripsina,
según la toxina a detectar. Una alternativa es la aplicación de EIA para la detección de
toxina/s de C. perfringens, de C. difficile o de otras especies, como también para detectar
anticuerpos contra fracciones antigénicas de otros clostridios. Si bien existen equipos co-
merciales, estos no se encuentran disponibles en nuestro medio en la actualidad, por lo
cual en algunos laboratorios se emplean métodos artesanales avalados por la bibliografía
A
correspondiente.
La detección de los genes codificantes para algunas de las toxinas mediante técnicas
moleculares resulta una metodología de utilidad aplicable en estudios epidemiológicos o de
PI
caracterización de las cepas aisladas.

Los métodos de amplificación genética (PCR) presentan una alta sensibilidad, permi-
ten acortar los tiempos de diagnóstico y detectar elementos de gérmenes inviables o no
relacionados a la patología en estudio, por tales motivos sus resultados siempre se deben
O
integrar con el contexto clínico y epidemiológico. Se cuenta con una variedad de protocolos
desarrollados para la detección de genes codificantes de toxinas de C. septicum, C. novyi,
C. haemolyticum, C. tetani, C. sordelli, C. chauvoei, C. perfringens y C. difficile.
MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization-time off light) es un sistema au-
C
tomatizado que se basa en la aplicación de espectrometría de masa y compara los espec-

tros obtenidos con una base de datos. En pocos minutos se obtienen resultados compa-
rables a la secuenciación de ARNr 16S de cada microorganismo. Debido a la complejidad
para identificar bacterias anaerobias en los laboratorios clínicos y al tiempo que demanda,
Maldi-Toff es una herramienta con un gran potencial en esta área aunque, aún las bases
de datos no incluyen todas las especies de importancia patógena.
Epidemiología
Es frecuente la recuperación de clostridios, incluidas las especies patógenas, a partir
de los suelos ricos en humus. La larga supervivencia de las esporas en el suelo y en las
pasturas resulta un factor condicionante del estado endémico con que se instalan algunas
patologías, las cuales suelen tener una aparición regular, con las mismas premisas en de-
terminadas zonas.
Clostridium
Las enfermedades clostridiales tienen una distribución mundial, pero existen áreas y
regiones en las que varias especies patógenas tienen mayor prevalencia. Una clostridiosis
específica puede expandirse de un área determinada a otras más alejadas a través del
movimiento de los animales.
Por el sistema y las condiciones de la cría del ganado en nuestro país las especies mi-
crobianas que presentan mayor importancia son C. chauvoei, C. septicum, C. haemolyti-
cum, C. novyi, C. perfringens, C. tetani y C. botulinum. Este perfil endémico se repite en el
resto de los países de América y en Sudáfrica, Australia, Nueva Zelanda, todas regiones
con condiciones de explotación ganadera similares a las nuestras y en menor escala, por
razones de dimensión territorial, en Japón. El denominador común de estos países es un
predominio de la cría extensiva o semiextensiva de ganado.
En Europa por el contrario y en otras zonas donde se desarrollan sistemas de cría inten-
R
sivos, las mayores incidencias se encuentran en las enterotoxemias por C. perfringens y
C. sordelli.
En la región mesopotámica de Argentina y en Brasil el botulismo en los bovinos ha adqui-
rido mayor importancia en los últimos años, debido a la expansión de las zonas ganaderas
TO
hacia regiones con suelos pobres y climas tropicales.
En la última década se citan aislamientos de C. difficile a partir de criaderos de cerdos,
equinos deportivos y también de animales de compañía como caninos.
Profilaxis y tratamiento
AU
La característica ubicuidad de los microorganismos del género Clostridium y el hecho
de integrar la microbiota residente en muchas especies animales, implican que su erra-
dicación es prácticamente imposible. Resulta entonces obligada la adopción de medidas
profilácticas y programas de inmunización activa para prevenir las diversas enfermedades
que producen, tanto en el área de explotación pecuaria como en la salud humana, como
ocurre con afecciones como el tétanos y el botulismo.
El empleo de vacunas mixtas a partir de cultivos de diferentes especies de clostridios
se ha convertido en una práctica habitual en la producción animal. Estas vacunas se ela-
A
boran teniendo en cuenta la integridad estructural de la compleja pared bacteriana, que

constituye una fracción antigénica importante y, la cinética de producción de las toxinas de
cada especie. Resultan eficaces y se recomiendan como inmunógenos para prevenir las
PI
afecciones que originan.

Cada región o país aplica un plan de vacunación acorde a su situación y a la patología
prevalente en ella. En forma muy general se recomienda la vacunación de animales jóve-
nes, entre 3 y 6 meses de edad y su revacunación anual y, la inmunización de las hembras
O
en el último tercio de su gestación.

Como tratamiento antibiótico de las infecciones clostridiales en Veterinaria se recomien-
da la aplicación de penicilina G. Hasta el momento resulta la droga de elección por su
eficacia, facilidad de manejo y costo.
C
La prevención de la infección por C. tetani se basa en la vacunación mediante la aplica-

ción de toxina detoxificada (toxoide) que resulta un excelente inmunógeno. La neurotoxina
con el agregado de formol y mantenida durante una semana a 38 ºC se transforma en
toxoide vacunal. El tratamiento consiste en administrar suero antitetánico homólogo en
los animales y gammaglobulina purificada en el hombre. Se pueden emplear antibióticos
como penicilina o tetraciclina en forma local o por vía general para frenar la multiplicación
del germen en el sitio de la lesión.
En el caso de botulismo la profilaxis se basa en medidas de higiene alimentaria y en la
vacunación en zonas endémicas. Las toxinas botulínicas tratadas con formol y mantenidas
a 42 ºC, pierden el componente tóxico transformándose en toxoides para uso vacunal. El
empleo de suero antibotulínico o de gammaglobulina purificada puede neutralizar la toxina
no fijada a las neuronas, pero no, la que se ha internalizado.

Clostridium
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Zhang J, Sun L, Nie Q. Botulism, where are we now? . Clin Toxicol 2010;48:867-79.
AU
A
PI
O
C

Bacillus y Clostridium

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Bacillus

y transmisible accidentalmente al hombre, es decir una zoonosis, denominada carbunclo.

El género Bacillus pertenece al Dominio Bacteria, Reino Eubacteria, Phylum Firmicutes,

agrupación y a la inclusión de algunas especies en otros géneros como son Brevibacillus,

Microbiología Veterinaria 657

B. anthracis forma esporas elipsoidales, de ubicación central, que no se detectan en el

Es una bacteria aerobia y anaerobia facultativa. No es exigente y desarrolla en medios

res, blanco grisáceas de 2 a 3 mm de diámetro. Observadas con lupa o microscopio de

658 Microbiología Veterinaria

La identificación bioquímica rara vez resulta

presentan resistencia es escasa. La mayoría de las cepas descritas como resistentes a

Array Proteins), denominadas SAP y EA1.

tructura de glicoproteínas con prolongaciones filamentosas en su superficie, que se supone

Microbiología Veterinaria 659

diferentes sistemas enzimáticos, EF y LF, que desencadenan el daño celular. El PA es una

liberación de un fragmento, denominado PA

660 Microbiología Veterinaria

de macrófagos. Estos se lisan luego de 2 horas de incubación con LeTx.

El genoma de Bacillus anthracis

dos de virulencia. El cromosoma presenta un elevado porcentaje de adenina y timina y su

Microbiología Veterinaria 661

Tanto en el cromosoma como en los plásmidos se encontraron genes con funciones

El plásmido pXO2 codifica un activador transcripcional de capB, denominado AcpA, re-

posteriormente con el empleo de antibióticos, corresponden con la pérdida de uno o ambos

la actividad de una topoisomerasa tipo 1, codificada en el plásmido, que se puede perder

662 Microbiología Veterinaria

es el fago gamma, empleado actualmente en el diagnóstico. Es un ADN de doble cadena

das y no capsuladas de B. anthracis, mientras que el fago W no lisa cepas capsuladas. El

Microbiología Veterinaria 663

temortem pueden estar virtualmente ausentes en las formas hiperagudas y agudas. La

nico) y en algunos casos, hemorragia nasal, bucal, vaginal y/o anal.

Recolección y transporte de muestras

664 Microbiología Veterinaria

Protocolo de laboratorio recomendado

En muestras de casos de carbunclo no agudo se pueden observar las cadenas de bas-

barro esplénico o la sangre incoagulable, se debe buscar la aparición de escasos bastones

es una prueba de termoprecipitación en medio líquido para detectar B. anthracis como

un cultivo fresco en medio sólido siguiendo el protocolo correspondiente.

Significado del aislamiento

En cuanto a otras especies de Bacillus similares, antiguamente denominados “antra-

666 Microbiología Veterinaria

Microbiología Veterinaria 667

ampliamente distribuido en la naturaleza y se puede aislar como patógeno oportunista de

Otras especies de Bacillus

tunistas en animales superiores o afectar insectos. Comparten la mayoría de las caracte-

Bacillus licheniformis también es un patógeno accidental en infecciones del hombre y los

insectos. En la actualidad se emplean incluidos en compuestos pesticidas, en el control de

minales no deformantes y se encuentran antigénicamente relacionados entre sí, por lo que

anthracis. Ann Agric Environ Med. 2012; 19 (4): 613-8.

Microbiología Veterinaria 669

con capacidad de esporulación, anaerobios, no productores de catalasa, con actividad

La mayoría de las especies de Clostridium crece en los medios de cultivo utilizados

y el medio de cultivo y el tiempo de incubación. Es requisito fundamental mantener el pH

que la habitual, entre 30 y 35 °C. Son ejemplos de ellas la neurotoxina de C. botulinum, la

dad con la consiguiente producción de edema.

Microbiología Veterinaria 673

de tripsina y quimiotripsina y, en el intestino delgado, a nivel del ribete en cepillo, se une a

el cromosoma bacteriano pero aún no están completamente identificadas, ni tampoco los

Tabla 3. Genes codificantes de las toxinas de une a la bicapa lipídica de la membrana de

alfa plc Cromosoma tico que conlleva a la lisis celular. La toxina

674 Microbiología Veterinaria

lipasa y fibrinolisina. Todo el conjunto ocasiona un aumento de la permeabilidad capilar y

bacteriana. Ambas toxinas se encuentran codificadas en el cromosoma en un locus de

signología de la enfermedad. La toxina se sintetiza como un precursor inactivo ligado a