Biopharmaceutical Processing Development Design and Implementation of Manufacturing Processes Compress 144 160

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Capítulo 6
Células huésped
Eva K. Lindskog*, Simon Fischer† , Hasta Wenger† , Patricio Schulz†

* †
Lonza Pharma & Biotech, Basilea, Suiza, Boehringer Ingelheim, Biberach, Alemania
6.1 CÉLULAS EN PRODUCCIÓN BIOFARMACÉUTICA
6.1.1 Introducción
El cultivo celular se ha utilizado durante miles de años en procesos como la fermentación de la soja, pero las aplicaciones biofarmacéuticas tal
como las conocemos hoy en día no se desarrollaron hasta hace poco tiempo. Los primeros cultivos de células animales in vitro se realizaron a
principios del siglo XX [1]. En ese momento, las enfermedades virales como la poliomielitis y la rubéola eran una preocupación mundial y la
comunidad científica se vio impulsada a desarrollar procesos para la producción de vacunas. En la década de 1950, se descubrió que las células
primarias de riñón de mono cultivadas eran excelentes anfitriones para la multiplicación viral. Este avance sentó las bases para el desarrollo de la
vacuna contra la poliomielitis de Salk en 1955, seguida de la vacuna Sabin en 1962. Paralelamente, se observaron avances en el área de vacunas
veterinarias donde se utilizaron células de riñón de hámster bebé (BHK) para producir una vacuna contra la fiebre aftosa. y enfermedad de la boca
(FMD).
La primera cepa de células humanas utilizada con fines biofarmacéuticos, WI-38, se aisló de tejido pulmonar embrionario en 1961. WI-38 es
una línea de células diploides no transformadas con una vida finita. Muchos virus se replicaron bien en WI-38, y se utilizó para desarrollar una
vacuna atenuada contra la rubéola autorizada por primera vez en Europa en 1970. En 1965, se desarrolló otra línea de células diploides humanas
para la producción de vacunas, MRC-5, a partir de células pulmonares fetales. Sin embargo, la falta de barrera de especie entre las células
huésped y los pacientes humanos se consideró una limitación importante en ese momento debido a la preocupación por la transferencia potencial
de agentes adventicios. En la siguiente fase de la biofabricación, se prefirieron los sistemas de producción no humanos.
El número de organismos huéspedes utilizados con fines biofarmacéuticos creció rápidamente después de estos primeros días. Esto fue
impulsado en parte por la revolucionaria aprobación en 1982 del primer fármaco de proteína recombinante Humulin (Eli Lilly), una insulina para el
tratamiento de la diabetes. El proceso Humulin fue desarrollado conjuntamente por Lilly y Genentech, y se utilizó E. coli como organismo huésped [2].
Otro gran avance fue la tecnología de hibridoma, ganadora del premio Nobel, desarrollada por Koehler y Milstein, quienes fusionaron con éxito
linfocitos productores de anticuerpos mortales con células de mieloma inmortales [3]. La tecnología de hibridoma se usó en el primer anticuerpo
terapéutico autorizado Orthoclone OKT3 (Janssen-Cilag), que recibió la aprobación de la FDA en 1985. Orthoclone era un anticuerpo totalmente
murino producido en la ascitis1 de ratones. Poco después, en 1986, el interferón alfa de Wellferon (Wellcome Foundation2 ) fue la primera proteína
recombinante derivada de un cultivo celular aprobada en el Reino Unido. Wellferon se produjo en células Namalwa, linfocitos de una mujer
africana que murió de linfoma de Burkitt. El proceso Wellferon se amplió a 10 000 l, pero incluía componentes de origen animal y, posteriormente,
se retiró en 1999 y se reemplazó por productos de interferón más modernos y seguros producidos en fermentaciones de E. coli . Las células de
ovario de hámster chino (CHO) se autorizaron por primera vez en 1987 para fabricar Activase, un activador del plasminógeno tisular (t-PA)
desarrollado por Genentech. El primer producto biofarmacéutico de levadura recibió la aprobación de la FDA en 1991. El producto era insulina
humana producida por Novo3 en un proceso de Saccharomyces cerevisiae , como reemplazo de su insulina humana derivada enzimáticamente
de una fuente porcina. El producto pionero de células de insecto Cervarix, una vacuna contra el VPH producida por GSK, fue aprobado por la FDA
en 2009, y el primer biofarmacéutico de origen vegetal Eleyso (taliglucerasa alfa), desarrollado por Protalix y fabricado y comercializado por Pfizer,
fue aprobado por la FDA en 2014 Elelyso se utiliza para tratar la enfermedad de Gaucher, un raro trastorno de almacenamiento lisosomal. Se
produce en una línea de células de raíz de planta de zanahoria modificada, que se cultiva en un sistema de biorreactor desechable (ProCellEx).
En la Tabla 6.1 se muestra una descripción general de los productos biofarmacéuticos seleccionados y sus respectivos sistemas de producción .
1. La ascitis es una acumulación de líquido en la cavidad peritoneal.

2. Wellcome se fusionó con Glaxo en 1995 y Glaxo Wellcome se fusionó con SmithKline Beecham para formar GSK en 2000.
3. Actualmente Novo Nordisk.
Procesamiento biofarmacéutico. https://doi.org/10.1016/B978-0-08-100623-8.00006-2

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112 SECCIÓN | II Procesos Upstream Principios y Métodos
TABLA 6.1 Una selección de productos recombinantes que han sido aprobados en los EE. UU. o la UE y los
correspondientes sistemas hospedantes pioneros
Sistema anfitrión Producto Marca Compañía Año de aprobación
E. coli Insulina humulina Eli Lilly 1982 EE. UU.
Hibridomaa Muromonab-CD3 Ortoclon OKT-3b Janssen Cilag 1986 Estados Unidos
Namalwa interferón-alfa Wellferón fundación de bienvenida 1986 Reino Unido
CHO t-PA activasa Genentech 1987 EE. UU.
S. cerevisiae Insulina Novolina nuevo 1991 EE. UU.
SP2/0 Abciximab ReoPro Centocore 1994 EE. UU., 1995 UE
BHK Factor VIIa NovoSeven Novo Nordisk 1996 UE, 1999 EE. UU.
NS0f Daclizumab Zenapax Hoffman-La Roche 1997 EE. UU., 1999 Unión Europea
293 HEK Proteína C Activada Xigris Eli Lilly 2001 EE. UU., 2002 UEh
HT-1080 Alfa galactosidasa humana Replagal Productos farmacéuticos de la comarca 2001 UE
T ni vacuna contra el VPH Cervarix GSK 2009 EE. UU.
S. frugíperda Multinacionales autólogas de sangre periférica provenza dendreon 2010 EE. UU., 2013 UE
activadas con sipuleucel-Ti
Células de zanahoria Taliglucerasa alfa eleliso Protalix 2014 EE. UU.
a
Hibridomas crecidos en la ascitis de ratones.
B
La interrupción mundial se anunció en 2010.
C
El producto fue aprobado previamente en Francia y Suiza.
D
Retirado en 1999.
mi
Fabricado por Janssen, distribuido por Eli Lilly.
F
El material para uso en ensayos clínicos se preparó a partir de células Sp2/0. Debido a los rendimientos de producción limitados, el anticuerpo se volvió a expresar posteriormente en una línea
celular de mieloma murino GS-NS0.
g Retirado en 2006.
h
Retirado 2011.
I
Células mononucleares activadas con factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos de fosfatasa ácida prostática.
No se incluyen en la tabla los productos de diagnóstico y los sistemas de producción específicos de vacunas, como tejido animal y células primarias, MRC-5 y WI-38
(introducidos en la década de 1960), Vero (introducido en la década de 1980) y MDCK (Optaflu, Novartis, aprobación de la UE en 2009).
Los sistemas de producción microbiana dominaron las primeras etapas de la producción biofarmacéutica, a pesar de los avances en el
campo del cultivo de células animales. El medio de cultivo para células animales era mucho más costoso y complejo que el medio para
fermentaciones, y el suero se agregaba comúnmente a los cultivos celulares, lo que generaba problemas de seguridad. Los rendimientos de
los productos de cultivo celular eran bajos y las plantas de fabricación tenían que ser muy grandes para acomodar los volúmenes de cultivo
necesarios para satisfacer las demandas del mercado. Sin embargo, las cosas estaban a punto de cambiar. De 1984 a 2004, la densidad
celular típica de un cultivo de células de mamífero aumentó cinco veces, la duración del cultivo aumentó tres veces y el título del producto
aumentó 100 veces [4]. Entre 2008 y 2016, el título del producto de los procesos de anticuerpos en producción comercial aumentó un 6,4 %,
y el título de los procesos de anticuerpos en la etapa clínica tardía aumentó un 8,5 % (fig. 6.1). El título de anticuerpos promedio en la
producción comercial en 2015 fue de 3,2 g/L [5]. Estos desarrollos han llevado a un cambio de enfoque, hasta el punto de que un mayor
aumento en la densidad celular o la productividad volumétrica de los cultivos de células animales ya no es un objetivo principal. En cambio, la
atención se centra en cómo ganar eficiencia en el proceso general y cómo hacer coincidir mejor el flujo descendente con lo que se entrega
desde el flujo ascendente. Se necesita más trabajo para mejorar el control de la calidad del producto, minimizar la agregación y reducir la
actividad proteolítica en el proceso anterior. Otra área de enfoque es maximizar el rendimiento del espacio-tiempo, por ejemplo, al acortar el
tiempo en el biorreactor de producción para que el título del producto objetivo se alcance más rápido. La duración de un proceso de producción
de anticuerpos aguas arriba suele ser de unos 10 a 14 días [7–9], pero si se puede acortar el proceso, se pueden producir más lotes, lo que
conduce a una mayor productividad anual y una mejor utilización de las instalaciones. Esto se puede hacer, por ejemplo, inoculando el
biorreactor a una alta densidad celular inicial, seleccionando un clon de crecimiento rápido u optimizando los parámetros del medio de cultivo y del biorreactor pa
Los procesos animales se utilizan cada vez más en relación con otros tipos de procesos (Fig. 6.2A) [10] (Fig. 6.2B) [5]. Entre 2004 y 2013,
el 56 % de los productos aprobados por la FDA y la EMA se produjeron en sistemas de mamíferos, en comparación con el 37 % para
Capítulo de células huésped | 6 113
3.5
2.5
1.5
Producción comercial
Producción clínica en etapa tardía
1
2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016
Año
HIGO. 6.1 El título de producto promedio informado en procesos de anticuerpos entre 2008 y 2016. El título de anticuerpos en procesos comerciales aumentó un
63 % durante este tiempo, y el título en procesos en etapa clínica mostró un aumento de 91 %. Si los títulos continúan creciendo a las mismas tasas respectivas,
entonces el título de una producción clínica en etapa tardía en 2020 será de casi 5,5 g/l, y el título promedio para los procesos de producción comercial en general
será cercano a los 3,5 g/l. Datos de E. Langer, 13.° informe anual y encuesta sobre capacidad y producción de fabricación biofarmacéutica, 2016, n.º 259.
sistemas microbianos (24% E. coli, 13% levadura) (Baeshen, [11]). En 2014, la cantidad acumulada de productos biológicos aprobados en los Estados Unidos
y Europa se distribuyó casi por igual entre cultivos celulares y sistemas microbianos (51 % frente a 49 %).
[5] (Fig. 6.3), sin embargo, esto probablemente cambiará hacia los sistemas de mamíferos en los próximos años. Las expansiones de capacidad estimadas
para los sistemas microbianos están en su punto más bajo y la utilización de la capacidad de las instalaciones microbianas existentes está disminuyendo,
mientras que la utilización de las instalaciones de cultivo celular está aumentando [5]. Está claro que el interés general en los sistemas de mamíferos está
creciendo en relación con otros sistemas, pero los microbios seguirán siendo una opción de proceso fundamental para las clases de productos en los que no
se requieren células animales, como la hormona del crecimiento, la insulina y los fragmentos de anticuerpos.
Una explicación importante del aumento del uso del cultivo de mamíferos es el crecimiento de la clase de productos de anticuerpos.
Los anticuerpos requieren modificaciones postraduccionales complejas para una funcionalidad adecuada y, en la actualidad, los sistemas de mamíferos son
la única opción de producción viable. Los anticuerpos solo representaban el 10 % de todos los medicamentos biológicos a fines de la década de 1980, pero
representaron el 27 % de todas las aprobaciones entre 2010 y abril de 2014 [10]. En 2016, nueve de los quince productos biológicos aprobados por la FDA
eran anticuerpos y uno era una proteína de fusión de anticuerpos. Se estimó que más del 90% de la capacidad de cultivo de células de mamíferos del mundo
en 2015 se utilizó para la producción de anticuerpos [5]. El mismo año, los productos de anticuerpos generaron aproximadamente $50 000 000 000 en
ingresos totales, el 25 % de los ingresos totales del segmento biofarmacéutico. Sin embargo, el tipo de producto no es el único factor que impulsa el uso de
sistemas de mamíferos. La infraestructura existente de las instalaciones y los laboratorios, combinada con los conocimientos técnicos y las experiencias
previas, puede conducir a la decisión de utilizar células de mamíferos para productos que podrían producirse en microorganismos. Las estrategias de la
plataforma de cultivo celular son un punto a favor del cultivo celular, al igual que la disponibilidad de tecnología de un solo uso. La mayor flexibilidad de la
tecnología de un solo uso es atractiva, en comparación con los procesos de fermentación microbiana que dependen casi exclusivamente de la infraestructura
de acero inoxidable.
En resumen, el cultivo celular está en aumento cuando se consideran los ingresos, el uso actual y los productos en proceso.
Sin embargo, las nuevas clases de productos, como fragmentos de anticuerpos, conjugados de fármacos de anticuerpos, vacunas novedosas y péptidos,
podrían generar un mayor interés en los sistemas de producción microbiana, especialmente en combinación con los avances en la tecnología de expresión
microbiana y una tecnología madura de un solo uso para la fermentación microbiana. Además, los sistemas microbianos persisten cuando se trata de la
cantidad total de ingrediente farmacéutico activo que se produce. La capacidad global de biofabricación en 2010 fue estimada por BioProcess Technology
Consultants en 26,4 toneladas métricas de ingrediente farmacéutico activo. De esta cantidad, se estimó que el 68 % procedía de sistemas de producción
microbianos, mientras que el 32 % restante procedía de procesos que utilizaban células animales [10]. Una última reflexión es que las nuevas clases de
productos, como los fragmentos de anticuerpos, los conjugados de anticuerpos y fármacos, las vacunas novedosas y los péptidos, podrían generar un mayor
interés en los sistemas de producción microbianos, especialmente en combinación con los avances en la tecnología de expresión microbiana y una tecnología
madura de un solo uso. para la fermentación microbiana.
70
60
50
aprobados
biológicos
Cantidad
relativa
(%)
de
40
30
Sistemas de mamíferos
Sistemas no mamíferos
20
Hasta 1989 1990–1994 1995–1999 2000-2004 2005–2009 2010–2014
(A) Periodo de tiempo
100
90
80
relativo
Uso
(%)
70
Células mamíferas
60
Sistemas microbianos
50
Sistemas de levadura
40
Células de insecto
30
Células vegetales
20
10
0
2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016
(B) Año
HIGO. 6.2 (A) La proporción de sistemas de expresión de mamíferos versus no mamíferos en productos biológicos aprobados durante los períodos indicados. Cada conjunto
de datos se expresa como un porcentaje de las aprobaciones totales para el período en cuestión. Los sistemas de no mamíferos dominaron en las primeras etapas, pero la
proporción relativa de los sistemas de mamíferos está aumentando. (B) La distribución de los sistemas de expresión actualmente en uso para la producción de productos
biofarmacéuticos. Como puede verse en la figura, el uso de los sistemas de mamíferos está aumentando ligeramente, mientras que el uso de todos los demás sistemas
permanece constante o está disminuyendo. Datos extraídos de G. Walsh, Biopharmaceutical benchmarks 2014. Nat. Biotecnología. 32(10) (2014) 992–1000, y (B) de E. Langer,
13.º informe anual y encuesta sobre capacidad y producción de fabricación biofarmacéutica, 2016 n.º 259.
6.1.2 Abastecimiento de cultivos

Los cultivos autenticados y con control de calidad pueden obtenerse de colecciones comerciales de cultivos. Las colecciones de
cultivos más conocidas son ECACC (Colección europea de cultivos de células animales) y ATCC (Colección americana de cultivos
tipo). Aquí todo tipo de cultivos; se pueden obtener líneas celulares, cultivos bacterianos, levaduras, hongos y virus. Las líneas
celulares y los cultivos bajo licencia, por ejemplo, CHO-S, PER.C6, EB.66, CAP y expresSF+ , están disponibles en empresas o
laboratorios con derechos de propiedad intelectual específicos respectivos. Estas líneas celulares disponibles en el mercado suelen
estar muy bien documentadas y la información de apoyo está disponible para los clientes interesados en la fabricación clínica y
comercial. Al obtener cultivos de laboratorios menos establecidos, se debe tener cuidado para garantizar la documentación adecuada
y los cultivos correctamente identificados. Los cultivos celulares mal identificados son un problema y, en 2012, se fundó el Comité
Internacional de Autenticación de Líneas Celulares (ICLAC, iclac.org) para aumentar la conciencia sobre los cultivos mal identificados
y mejorar el control de calidad. Una línea celular que ha estado bajo escrutinio es HeLa, donde se han identificado varios linajes contaminados.
45
40
35
productos
(%)
30
25
comercializados
productos
Cantidad
relativa
UU./
EE.
UE
en
de
20
15
10
0
bacterias Levadura Células de insecto Mamífero Humano
no humano
HIGO. 6.3 La distribución de organismos huéspedes utilizados en la fabricación de productos biofarmacéuticos comercializados en EE. UU./UE en 2014. El 49 % de los productos se
produjeron en sistemas microbianos (bacterias y levaduras), el 4 % en sistemas de células de insectos, el 40 % en sistemas no humanos sistemas de mamíferos y 9% en sistemas de
células humanas ([5] #259). Los sistemas basados en huevos y los animales transgénicos no están incluidos en esta compilación.
identificado. Otro problema emergente es el posible agotamiento de las líneas celulares que se depositaron en colecciones de cultivo hace muchos
años, como MDCK, MDBK y Vero. Estas líneas celulares se almacenaron originalmente en la década de 1960 o antes, y todavía se usan en la
producción comercial de vacunas virales. La expansión para producir bancos de células adicionales es potencialmente problemática debido a la deriva
genética con un mayor número de pases.
6.2 CULTIVO DE CÉLULAS ANIMALES
6.2.1 Tipos de cultivo

El cultivo de células animales se puede dividir en diferentes tipos de cultivo, cada uno con características específicas que son importantes para un
biofabricante. Los cultivos primarios se originan a partir de tejido animal normal y se pueden cultivar como un cultivo de explante o, después de la
digestión enzimática, como una suspensión de una sola célula. Las células primarias aisladas pueden ser de dos tipos diferentes: células adherentes
que requieren unión a la superficie para crecer, y células en suspensión que crecen libremente en suspensión. Las células adherentes se derivan
principalmente de tejido de órganos donde están inmóviles e incrustadas en tejido conectivo. Las células en suspensión se originan en el sistema
sangre/plasma. Cuando un cultivo primario se subcultiva (se transfiere a un recipiente nuevo con nutrientes frescos), se denomina línea celular. Las
líneas celulares primarias solo se pueden mantener in vitro durante un período limitado y, durante este tiempo, las células suelen conservar la mayoría
de las características de las células in vivo. En la producción biofarmacéutica, las líneas celulares primarias, por ejemplo, los fibroblastos de embrión
de pollo, se utilizan en la producción de vacunas virales. Un campo emergente de líneas celulares primarias es el de las aplicaciones de terapia celular.
Las líneas celulares primarias también se utilizan ampliamente en aplicaciones de investigación y descubrimiento, y para ensayos biológicos. Los
ejemplos de líneas celulares primarias comunes incluyen queratinocitos, melanocitos, células epiteliales, fibroblastos, células endoteliales, células
musculares, células hematopoyéticas y células madre mesenquimales.
Las células normales generalmente se dividen solo un número limitado de veces antes de perder su capacidad de proliferar. Sin embargo, algunas
células se vuelven inmortales a través de un proceso llamado transformación, que puede ocurrir espontáneamente o por inducción química o viral.
Cuando una línea celular finita se transforma, se convierte en una línea celular continua. Las líneas celulares continuas perderán gran parte de sus
características in vivo originales durante el proceso de transformación, pero obtendrán el beneficio de ser accesibles a largo plazo. En la literatura, las
líneas celulares continuas se denominan principalmente "líneas celulares". Las líneas celulares continuas pueden crecer en suspensión como células
individuales o pequeños grupos flotantes, o bien adheridas a una superficie. En la fabricación biológica a gran escala, las líneas de células en
suspensión son la opción preferida debido a su manejo más conveniente y su escalado más fácil en comparación con las células adherentes. Siempre
que sea posible, el cultivo de producción se adapta al crecimiento en suspensión. En general, la característica de crecimiento de una línea celular
continua refleja el tejido del que se deriva. Las líneas celulares derivadas de la sangre tienden a crecer en suspensión (por ejemplo, las células NS0
que se originan en el mieloma de ratón), mientras que las células derivadas de tejido sólido tienden a crecer de forma adherente. Dos de las líneas
celulares de producción más utilizadas, CHO y HEK 293, son adherentes por naturaleza; sin embargo, ambas están disponibles comercialmente
adaptadas al crecimiento en suspensión en medio de cultivo celular sin suero.
6.2.2 Sistemas de mamíferos no humanos

CHO es el sistema de producción dominante para la fabricación de proteínas recombinantes de células animales [12]. En 2015, más de la
mitad (55 %) de todos los productos recombinantes aprobados por la FDA/EMA producidos en células animales se produjeron en CHO [5].
La dominancia de CHO puede explicarse por una combinación de éxitos tempranos en la producción de proteínas recombinantes, fácil
manejo, aceptación regulatoria y altos niveles de expresión [4,13]. Otras líneas celulares de mamíferos utilizadas para la producción
farmacéutica a gran escala incluyen las líneas celulares de mieloma de ratón NS0 y Sp2/0, células de riñón de hámster bebé (BHK), células
Vero del mono verde africano y células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) de perro. Las dos últimas (Vero y MDCK) se usan
predominantemente para la producción de vacunas, mientras que las otras líneas celulares se usan principalmente para la producción de
proteínas recombinantes. Además de estas líneas celulares establecidas, los cultivos no transformados se utilizan para procesos
biofarmacéuticos específicos, por ejemplo, en la producción de vacunas y la terapia celular.
CHO
La primera línea celular de ovario de hámster chino (CHO) fue desarrollada por T. Puck en 1957 para el estudio de la genética celular [14], y
las células recibieron una atención creciente como huéspedes de producción de proteínas heterólogas a principios de la década de 1980
[15]. La línea celular CHO original se ha subclonado varias veces, y las líneas celulares parentales de biofabricación más comúnmente
utilizadas (CHO-K1, CHO DG44 y CHO-S) se originan cada una de diferentes linajes CHO respectivos, como se puede ver en la Fig. 6.4.
CHO se caracteriza por la inestabilidad genética y fenotípica que conduce a un alto grado de diversidad [15]. Diferentes condiciones de
cultivo darán como resultado una selección natural de células CHO con atributos funcionales únicos en términos de, por ejemplo, proliferación
[16], capacidades de glucano y productividad de proteína recombinante [17,18]. Esto implica que, debido a su alto nivel de dinámica
genómica, la mayoría de las líneas de células CHO empleadas industrialmente muestran variaciones considerables en la productividad
celular máxima, el comportamiento de crecimiento y la actividad metabólica, así como tipos de modificaciones postraduccionales [19–22]. .
Sin duda, esto tiene implicaciones importantes para el uso de células CHO como huéspedes de expresión en la industria biofarmacéutica
[15]. Por ejemplo, esto podría conducir a resultados inesperados cuando se seleccionan clones de producción que sostienen procesos
largos, transferencia de tecnología o escalamiento a la fabricación de gran volumen [23,24].
Por naturaleza, las células CHO crecen de forma adherente y dependen del suero, pero se pueden adaptar al crecimiento en suspensión
sin suero con relativa facilidad. Las líneas de células CHO que se adaptan al crecimiento en suspensión sin suero están disponibles
comercialmente. Este hecho, en combinación con la robustez de las células CHO, ha facilitado el desarrollo de procesos CHO a gran escala.
CHO también se considera una plataforma de producción muy segura [6,25]. Los virus patógenos que se dirigen a los humanos, como los
adenovirus, el herpes, la hepatitis, el VIH, el sarampión y la influenza, no se replican en las células CHO [8,9,26]. Además, varias rondas de
mutagénesis genética allanaron el camino para la generación de sublíneas de CHO que carecían de enzimas metabólicas clave. Estas
sublíneas podrían explotarse para establecer nuevas fábricas de células CHO que muestren propiedades favorables para la expresión de
proteínas heterólogas [27, 28]. Las tecnologías de selección que utilizan dihidrofolato reductasa dhfr- o glutamina sintetasa son sistemas
comúnmente utilizados para la producción de proteínas recombinantes. Estos sistemas se describen con más detalle en el Capítulo 7.
chino Tipo salvaje

Hámster Sistema de selección DHFR
Sistema de selección GS
disco, 1957
Original
CHO
pedernal, 1976 Toby, 1962
Kao y Puck, 1968
CHO-pro3- CHO-K1 CHO-Toronto
Urlaub y Chasin, 1983 Cóctel, 1990 Thompson, 1971
CHO-MTXRIII CHO-DXB11 CHOK1SV CHO-S
Urlaub et al. 1986
CHO-DG44 CHO-GS-/-
HIGO. 6.4 Genealogía de CHO. Resumen de la historia de las diferentes sublíneas de CHO empleadas hoy en día para la biofabricación.
En 2011, se puso a disposición el genoma de la línea celular CHO-K1 [29] y, más recientemente, el genoma del hámster chino C. griseus y
varias otras líneas celulares CHO, incluidas CHO-K1, DG44 y CHO-S. publicado [30]. Los genomas brindan más información sobre las
características de las células CHO y resaltan las diferencias entre los diferentes linajes de CHO. Sin embargo, las implicaciones para un clon de
producción específico aún deben evaluarse de forma individual dada la diversidad mencionada anteriormente y la inestabilidad de las células
CHO. De hecho, incluso dentro de un cultivo clonal de CHO, el nivel de expresión puede variar hasta un 70 % entre diferentes células [22]. En
líneas celulares CHO no clonales, como CHO-K1SV, las diferencias pueden ser aún más pronunciadas, con implicaciones para el crecimiento y
la capacidad de producción de proteínas [18].
Un enfoque particular para los procesos de CHO es optimizar el patrón de glicanos, ya que se ha demostrado que las variaciones en el
coperfil de gly pueden afectar la estabilidad y función del producto, y las glicoformas no humanas pueden ser inmunogénicas [4,31]. Esto ha sido
objeto de un escrutinio específico recientemente como resultado de la tendencia de los biosimilares y el desarrollo de biomejores. En el caso del
biosimilar, el desafío es hacer coincidir el patrón de glicanos con el patrón del producto original. Para los biomejoradores, el desafío puede ser, en
cambio, minimizar las glicoformas subóptimas para mejorar la eficacia y minimizar los efectos secundarios. Las células CHO carecen de ciertas
glicosiltransferasas4 que se encuentran en las células humanas y, en consecuencia, no pueden producir todas las glicoformas humanas.
En cambio, las células CHO pueden producir glicanos de tipo murino que no se encuentran en los humanos, a saber, el terminal ÿ-Gal5 y NGNA6.
epítopos ([32,32a]), pero por lo general en niveles muy bajos [21]. Esa es una de las razones por las que las glicoproteínas producidas por las
células CHO generalmente se consideran seguras. Sin embargo, tanto los epítopos de ÿ-Gal como los de NGNA son capaces de inducir una
respuesta inmunitaria en humanos [32]. El patrón de glicanos se puede cambiar con la optimización de las condiciones del proceso, pero las
limitaciones básicas de los CHO siempre permanecerán a menos que la célula se modifique genéticamente. Por lo tanto, si el producto depende
de tener un patrón de glicano humano, entonces una línea celular humana podría ser una mejor opción que CHO. Se sabe que ciertos
componentes en los medios de cultivo celular tienen un impacto específico en la glicosilación. Estos pueden ser, por ejemplo, oligoelementos
necesarios para la función de glicosiltransferasas específicas. La optimización de los parámetros del biorreactor, como el pH y el OD, también
puede ser eficaz para maximizar la producción del perfil de glicano deseado.
CHO-K1
La línea celular CHO-K1 representa una de las líneas celulares clonales establecidas muy tempranamente derivadas del aislado de tejido ovárico
original, y aún es explotada por la industria biofarmacéutica, así como en la investigación biomédica. En 2000, Lonza adaptó la línea celular
original CHO-K1 para crecer en cultivo en suspensión y en medio sin suero, y luego desarrolló una sublínea denominada CHO-K1SV [15]. La línea
celular CHOK1SV se usa principalmente en combinación con el exclusivo sistema de selección de glutamina sintetasa (GS), donde el gen de
interés (GOI) se entrega a las células junto con una copia del gen GS [33–35].
Las células estables se seleccionan en un medio libre de glutamina que también se puede complementar con el inhibidor específico de GS
metionina sulfoximina (MSX) para aumentar el rigor de la selección y elevar la productividad [36]. Sin embargo, un estudio realizado por Jun y
colaboradores sugirió que la inestabilidad clonal puede ser un problema en la producción de clones amplificados por MSX debido a reordenamientos
cromosómicos [37]. Esta observación también se ha hecho con frecuencia en líneas celulares de producción de CHO-DG44 deficientes en
dihidrofolato reductasa (DHFR) amplificadas con metotrexato (MTX) [38–40].
CHO-S
A principios de la década de 1960, Theodore Puck notó que las subpoblaciones de células CHO pueden crecer como un cultivo en suspensión no
adherente [41]. Unos diez años más tarde, Larry Thompson y Raymond Baker mencionaron y describieron por primera vez el cultivo en suspensión
de la línea celular CHO-S [42], que representaba un descendiente de la línea celular CHO pro-5 [15]. Cabe señalar que la adaptación de las
células CHO para crecer en cultivo en suspensión marcó un cambio de paradigma en la tecnología de cultivo de células animales y finalmente
allanó el camino para la fabricación a gran escala de terapias de proteínas recombinantes hasta una escala de 20 000 l utilizando biorreactores
de tanque agitado (STR). ). Hoy en día, las células de producción de CHO-S en crecimiento en suspensión almacenadas en cGMP pueden
obtenerse comercialmente. Sin embargo, una de las principales desventajas de las células CHO-S es que la línea celular tiende a formar grandes
agregados en cultivo en suspensión.
CHO-DXB11
La explotación comercial de las células CHO para la producción de productos biofarmacéuticos comenzó después del establecimiento de una
línea de células CHO que era deficiente en la expresión funcional de DHFR, una enzima necesaria para la síntesis de timidina e hipoxantina [27].
En consecuencia, las células CHO deficientes en DHFR son auxótrofas triples para la glicina, la hipoxantina y la timidina.
4. ÿ[2-6] sialiltransferasa y ÿ[1-3/4] fucosiltransferasas.

5. Galactosa-ÿ-1,3-galactosa.
6. Ácido N-glicolilneuramínico.
y por lo tanto requieren la adición de estos nutrientes al medio de cultivo [8,9]. Para obtener esta línea celular, que más tarde se denominó CHO-
DXB11, las células CHO-K1 se mutagenizaron mediante irradiación gamma, creando una línea celular mutante que carecía de actividad DHFR [15].
En particular, las células CHO-DXB11 tienen una deleción física de un locus DHFR, mientras que el otro alelo porta una mutación de sentido erróneo
(T137R) del gen DHFR [15]. La falta de actividad de DHFR hace que las células CHO-DXB11 sean muy adecuadas para la transfección estable con
vectores de administración de genes que además albergan un transgén en combinación con una copia funcional del gen DHFR [43,44]. Las células
transfectadas se pueden seleccionar de forma estable en medio de cultivo sin hipoxantina ni timidina (HT), ya que la expresión de DHFR hace que las
células sean capaces de sintetizar ADN en ausencia de los desoxirribonucleósidos mencionados anteriormente [43]. CHO-DXB11 también fue la
principal línea de células huésped CHO recombinante utilizada para la producción comercial del primer activador del plasminógeno tisular humano
(tPA, comercializado con el nombre comercial Activase) de la primera proteína recombinante terapéutica aprobada por Genentech [4].
CHO-DG44
Debido a una mutación sin sentido en uno de los alelos DHFR de las líneas celulares CHO-DXB11, todavía existe un riesgo bajo pero latente de
reversión de la actividad DHFR. Por lo tanto, Urlaub y Chasin decidieron realizar rondas adicionales de mutagénesis utilizando la línea celular CHO
original para obtener células CHO que exhibieran una desactivación bialélica del gen DHFR [28]. Estos esfuerzos finalmente condujeron al
establecimiento de otra línea celular CHO deficiente en DHFR denominada CHO-DG44, en la que ambos loci del gen DHFR se eliminaron físicamente
[28]. Desde entonces, las células CHO-DG44 se han convertido en la línea de células huésped derivadas de CHO empleada con más frecuencia para
la producción industrial de productos biofarmacéuticos en todo el mundo. Una ventaja importante de las células CHO deficientes en DHFR que
contribuyó a su éxito es su capacidad para amplificar un transgén cuando las células transfectadas se tratan con el análogo de folato metotrexato
(MTX). El MTX inhibe la actividad de DHFR al unirse competitivamente al sitio catalítico de la enzima DHFR, lo que evita la conversión de dihidrofolato
en tetrahidrofolato activo, que se requiere para la síntesis de ADN. Un aumento gradual en la concentración de MTX en el medio de cultivo de células
CHO deficientes en DHFR transfectadas de manera estable con un vector, que codifica un gen de interés (GOI) además de DHFR, agrega más
presión de selección a las células. En consecuencia, esto conduce a la amplificación genómica tanto de DHFR como de GOI, lo que da como resultado
un número elevado de copias transgénicas y, por lo tanto, los grupos de células supervivientes suelen mostrar una mayor productividad celular de la
proteína recombinante [4,45]. Sin embargo, la amplificación génica mediada por MTX con el aumento concomitante en la producción de proteínas
viene inevitablemente acompañada de importantes reordenamientos genómicos [15,46], y muy probablemente también con cambios en la expresión
génica. Además, entre otros factores, se supone que las aberraciones genómicas inducidas por MTX son una de las fuerzas impulsoras de la
inestabilidad clonal, que presenta un grave problema en la biofabricación.
Sin embargo, además de CHO-K1, las líneas celulares derivadas de CHO-DG44 todavía se usan con frecuencia en un gran número de compañías
farmacéuticas en todo el mundo.
mieloma
Las células de mieloma han sido un caballo de batalla en la producción de anticuerpos desde el desarrollo de la tecnología de hibridomas en la
década de 1970 (Apéndice I). Hoy en día, el mieloma solo es superado en número por los CHO cuando se trata de sistemas de células animales
utilizados para la fabricación de productos bioterapéuticos aprobados. Las células de mieloma se utilizan como socios de fusión en la creación de
líneas celulares de hibridoma y como células huésped de producción por sus propios méritos. Los beneficios del mieloma incluyen el crecimiento en
suspensión y la facilidad de escalabilidad, la capacidad de proliferar bien en condiciones sin suero y una predisposición para la producción de
anticuerpos. Sin embargo, el interés en el uso de sistemas de mieloma para la producción es actualmente modesto, principalmente debido al atractivo
de los sistemas de CHO plug-and-play más fácilmente disponibles descritos en la sección anterior. Además, las células de ratón suelen tener niveles
bastante altos de retrovirus/VLP endógenos, lo que hace que los estudios de validación de eliminación/inactivación de virus sean bastante engorrosos.
Las células de mieloma tienen la capacidad de producir estructuras de glicano no humanas. Esto incluye galactosa terminal-ÿ-1,3-
epítopos de galactosa (ÿ-Gal) y residuos de ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc o NGNA). El epítopo ÿ-Gal puede reaccionar con anticuerpos IgE ÿ-
Gal en humanos [47] y las observaciones clínicas indican una relación entre la estructura ÿ-Gal y los efectos adversos de los bioterapéuticos. Por
ejemplo, las reacciones de hipersensibilidad en pacientes tratados con Erbitux (cetuximab), que se produce en las células de mieloma Sp2/0, se
atribuyeron a la presencia de anticuerpos IgE ÿ-Gal preexistentes [48]. Históricamente, los residuos de Neu5Gc (NGNA) no han recibido mucha
atención, pero los hallazgos recientes de anticuerpos anti-Neu5Gc circulantes en humanos han planteado preocupaciones potenciales sobre un riesgo
elevado de la terapia con estructuras Neu5Gc [49]. Para mitigar los riesgos potenciales con los glicanos no humanos, se puede realizar una detección
dirigida en etapas tempranas para identificar clones que producen niveles bajos de estas estructuras.
Las líneas celulares de mieloma más utilizadas, NS0 y Sp2/0, se originan a partir de las mismas células tumorales de plasmocitoma de ratón
BALB/c7. Estas células se tomaron a través de varias selecciones y pasos de clonación, y el resultado es una producción no productora.
7. Cepa albina del ratón doméstico Mus musculus.

TABLA 6.2 Productos biofarmacéuticos producidos en las líneas celulares de mieloma
Marca de producto anfitrión de producción Empresa de proteínas recombinantes Aprobación
Sp2/0 ReoPro Abciximab Centocora 1994 (EE. UU.), 1995 (UE)
NS0b Zenapax Daclizumab Roche/Laboratorios de diseño de proteínas 1997 (EE. UU.), 1999 (UE)
retirado en la UE 2009
Sp2/0 Simulecto Basiliximab Novartis 1998 (EE. UU., UE)
Sp2/0 Remicade infliximab Centocor Orto Biotecnología 1998 (EE. UU.), 1999 (UE)
NS0 milotarg Gemtuzumab zogamicina Wyeth 2000 (EE. UU.) c
Sp2/0 Erbitux Cetuximab ImClone Systems (Nueva York), Brístol 2004 (EE. UU., UE)
Meyers Squibb (BMS, Nueva York)
(EE. UU.), Merck Serono (UE)
NS0 Soliris eculizumab Alexión 2007 (EE. UU., UE)
Sp2/0 Iliaris Canakinumab Novartis 2009 (EE. UU., UE)
NS0 Arzerra ofatumumab Novartis/Genmab 2009 (EE. UU.), 2010 (UE)
NS0 Benlysta Belimumab grupo glaxo 2011 (EE. UU., UE)
Sp2/0 Inflectra/Remsima Infliximabd Celltrion/Hospira 2013 (UE, 2016 (EE. UU.)
NS0 ABthrax Raxibacumab GSK/Ciencias del Genoma Humano 2012 (EE. UU.)
NS0 ciramza Ramucirumab Eli Lilly 2014 (EE. UU.)
a
Fabricado por Janssen, distribuido por Eli Lilly.
B
El material para uso en ensayos clínicos se preparó a partir de células Sp2/0. Debido a los rendimientos de producción limitados, el anticuerpo se volvió a expresar posteriormente en un
mieloma murino GS-NS0.
C Retirado 2010.
DBiosimilar a Remicade.
Biofarmacéuticos producidos por Sp2/0 o mieloma que han recibido aprobación de comercialización en los Estados Unidos o Europa. Los productos de diagnóstico no están
incluidos en esta compilación.
líneas celulares con buenas características fisiológicas. Las líneas celulares Sp2/0 se han utilizado en la fabricación de varios superventas (Tabla
6.2). La mayoría de estos productos fueron aprobados en la década de 1990, con la excepción de Erbitux, que fue aprobado en 2004, e Inflectra,
un biosimilar de Remicade, que fue aprobado por la EMA en 2013.
La línea celular NS0 se usó originalmente como un compañero de fusión en la generación de hibridoma, pero más recientemente también se
usó para la producción por sus propios méritos en combinación con el sistema de selección de glutamina sintetasa (GS) (ver Capítulo 7). Las
células NS0 tienen una expresión endógena muy baja de GS y las células no transfectadas son auxotrofas de glutamina. Por lo tanto, no se
requiere ninguna alteración genética de NS0 para tener un sistema de selección basado en GS completamente funcional. Las células se
transfectan con un vector que codifica el producto y GS, y se usa un medio de selección sin glutamina para identificar los transfectantes. En
cuanto a las células GS-CHO, la presión de selección y el número de copias del gen se pueden aumentar mediante la adición del inhibidor de GS
metionina sulfoximina (MSX). Sin embargo, el nivel de MSX requerido en los cultivos NS0 suele ser mucho más bajo que el nivel requerido en los
cultivos CHO-GS, de 10 a 100 ÿM en comparación con 250 a 500 ÿM [50]. El metabolismo de las células NS0 cambiará tras la transfección con
un vector que contiene GS, y se necesitarán más componentes básicos de glutamina como la asparagina y el glutamato [51]. Las células GS-NS0
producen niveles bajos de lactato y niveles muy bajos de amoníaco [52].
La mayoría de las líneas celulares NS0 son auxótrofas de colesterol y requieren colesterol exógeno en el medio de cultivo para un crecimiento
y una producción óptimos [53]. La suplementación con colesterol es un proceso complicado debido a su baja solubilidad en solución acuosa. Lo
más común es que el colesterol se administre a través del suero o de suplementos que utilicen vehículos como la ciclodextrina [54]. El colesterol
a menudo se produce a partir de fuentes animales como la lana de oveja [55]. La presencia de componentes derivados de animales en los medios
de cultivo no es deseable y aunque el colesterol sintético está disponible, su alto costo es una preocupación para los procesos a gran escala. Se
han desarrollado clones de NS0 independientes del colesterol para resolver este problema [55,56]. Sin embargo, la sensibilidad al cizallamiento
de los clones NS0 independientes del colesterol ha sido reportada [57] con preocupaciones relacionadas sobre la robustez y la idoneidad para
procesos a gran escala. En 2008, se creía que todos los clones de producción de NS0 utilizados en procesos comerciales dependían del colesterol
[58]. Al comparar NS0 con CHO, el rendimiento y la funcionalidad del producto diferirán según la molécula que se produzca. Bajo ciertas
condiciones, estos dos sistemas han dado una producción equivalente y NS0 puede producir rendimientos de al menos 2–3 g/L ([55], #377).
BHK
BHK-21 es un subclon de una línea celular que se estableció en 1961 a partir del riñón de hámsteres de un día [59]. BHK es una de las pocas líneas
celulares de mamíferos que se pueden cultivar fácilmente tanto de forma adherente como en suspensión. El crecimiento es modesto en comparación con
otras líneas celulares de mamíferos utilizadas en procesos industriales, y se ha informado que la densidad máxima de células viables en lotes en
condiciones óptimas está en el rango de 4 × 106 células/mL [60]. Las células BHK-21 han sido un estándar de laboratorio para el crecimiento de muchos
virus diferentes, incluidos el virus de la fiebre aftosa y el virus de la rabia [60,61], y la línea celular también se ha utilizado en el estudio de procesos
biológicos. Las líneas celulares BHK-21 se utilizan en la producción de los factores sanguíneos NovoSeven (Factor VIIa) de Novo Nordisk, Helixate
(Factor VIII) de Aventis Behring y los productos de Factor VIII Kogenate y Kovaltry de Bayer [62,63]. Las proteínas Kogenate y Kovaltry tienen la misma
secuencia de aminoácidos, pero los procesos y las respectivas líneas celulares de producción de BHK-21 difieren. En el proceso de Kovaltry, la célula
BHK-21 original utilizada en la fabricación de Kogenate se modificó introduciendo el gen de la proteína de choque térmico humano 70 (HSP70). HSP70
es una chaperona que se cree que aumenta la expresión de FVIII al facilitar el plegamiento adecuado de proteínas y mejorar la supervivencia celular al
inhibir la apoptosis. Tanto Kogenate como Kovaltry se producen en procesos de perfusión utilizando volúmenes de biorreactor de hasta 500 l [62,64]. La
mayoría de los procesos BHK-21 aprobados actualmente se aprobaron antes o alrededor del cambio del milenio, con la excepción de Kovaltry, que se
aprobó en 2016. Hoy en día, los sistemas de producción como CHO o HEK tienden a preferirse en lugar de las celdas BHK-21 en el desarrollo de nuevos
productos.
6.2.3 Células humanas

El uso de cultivos humanos en la biofabricación ha sido limitado, a pesar de que hay varias opciones de líneas celulares disponibles. La primera línea
celular humana HeLa se origina a partir de un cáncer de cuello uterino y se estableció en 1951 [64a]. En la década de 1960, se utilizaron células diploides
humanas para la fabricación de vacunas, pero la preocupación por los virus oncogénicos impidió el uso generalizado de células humanas en ese momento.
Las células de otros organismos de mamíferos se convirtieron en la opción preferida en los continuos esfuerzos de desarrollo. La mayoría de las
proteínas biofarmacéuticas hasta la fecha se han producido utilizando líneas celulares de mieloma murino y de hámster, y solo tres líneas celulares
humanas se han utilizado en la fabricación de productos bioterapéuticos recombinantes aprobados: células de linfoma de Namalwa, células HEK 293 de
riñón embrionario humano y la línea celular de fibrosarcoma. HT-1080 (Tabla 6.3). Las líneas celulares humanas establecidas más recientemente, como
Per.C6 derivadas de la retina y las células amnióticas CAP, se han utilizado para la producción de candidatos terapéuticos en ensayos clínicos, pero en
el momento de escribir este artículo, ninguno de estos productos ha recibido una aprobación de licencia biológica. Otras líneas celulares humanas que
se han investigado para la producción de proteínas recombinantes incluyen HKB-11, un híbrido de HEK 293 y linfoma humano [65] y HuH-7, una línea
celular de hepatocarcinoma [66]. Las ventajas de HKB-11 incluyen la producción de proteínas de alto nivel sin la formación de agregados, y ha mostrado
resultados prometedores en la expresión del factor VIII humano, en comparación con BHK-21 y HEK 293 [65]. HuH-7 ha sido investigado para la
producción de Faxtor XI recombinante [67].
TABLA 6.3 Productos bioterapéuticos producidos por líneas celulares humanas
Producción Producto
Anfitrión Marca Proteína recombinante Compañía Aprobación
Namalwa Wellferón interferón alfa Fundación Wellcome 1986 (retirada en 1999)
293 HEK Xigris Drotrecogin alfa (Proteína C Activada) Eli Lilly y compañía 2001 (EE. UU.) (retirado en 2011)
HT-1080 Replagal Alfa galactosidasa humana Condado 2001 (UE)
HT-1080 Dynepo eritropoyetina Condado 2002 (UE) (retirado en 2009)
HT-1080 Elaprasa idursulfasa Condado 2006 (EE. UU.) 2007 (UE)
HT-1080 privado INN-velaglucerasa alfa Condado 2010 (EE. UU., UE)
293 HEK Alprolix factor IX rh fusionado con un dominio Fc de IgG1 humana Biogen Idec 2014 (EE. UU.)
293 HEK eloctate Proteína de fusión Fc del factor VIII con dominio B rh eliminado Biogen Idec 2014 (EE. UU.)
293 HEK Nuwiq simoctocog alfa; factor VIII rh en la sangre Octafarma 2014 (UE)
Productos bioterapéuticos producidos en líneas de células humanas que han recibido aprobación de comercialización en los EE. UU. o la UE. El sistema PER.C6 se ha utilizado para la producción en
ensayos clínicos de última etapa, pero en el momento de escribir este artículo, ningún producto biofarmacéutico producido en PER.C6 ha recibido aprobación de comercialización. Esta compilación no
incluye productos de terapia celular (autólogos y alogénicos) ni productos de sangre de cordón umbilical.
El principal beneficio de las líneas celulares humanas es una maquinaria de producción de proteínas totalmente humana, lo que conduce a
modificaciones postraduccionales correctas y un patrón de glucano humano. Sin embargo, las comparaciones directas han demostrado que el uso de una
línea celular humana no conduce necesariamente a una forma completamente endógena del producto. Además, no se ha demostrado de manera
concluyente que la forma humana recombinante de una proteína sea más segura o más eficaz que la contraparte derivada de CHO recombinante [68].
HEK
La línea celular de riñón embrionario humano 293 (HEK 293) es un sistema versátil que se utiliza para producir proteínas de grado de investigación,
vectores virales y proteínas recombinantes en procesos de biofabricación. La primera línea celular HEK 293 se estableció en 1977 mediante la
transformación de células HEK con fragmentos cortados de ADN de adenovirus tipo 5 [69]. Esta fue la primera vez que se obtuvo la inmortalización por
transformación con los genes E1A y E1B. Las células HEK se cultivan fácilmente en cultivos en suspensión sin suero, y están disponibles comercialmente
varios clones de HEK adaptados al crecimiento en suspensión sin suero. En la actualidad, HEK se usa ampliamente en la producción transitoria de
proteínas recombinantes en investigación y para estudios preclínicos, gracias a una transfección eficiente de ADN plasmídico en combinación con
capacidades de procesamiento postraduccional humano. Las células HEK 293 se usan ampliamente para la producción de vectores virales, por ejemplo,
para producir adenovirus, lentivirus, retrovirus y virus adenoasociados. Varios vectores virales producidos utilizando líneas celulares HEK se encuentran
actualmente en ensayos clínicos de fase II y fase III. En la producción biofarmacéutica, se han utilizado transfectantes HEK estables desde 2001. En 2015,
se produjeron cuatro proteínas terapéuticas autorizadas Alprolix, Eloctate, Nuwiq y Xigris en células HEK. Xigris, por ejemplo, se fabrica en HEK 293 porque
las modificaciones postraduccionales esenciales para una funcionalidad adecuada no fueron adecuadas cuando el producto se produjo en células CHO.
El ADN desnudo no puede ingresar a las células sin ayuda, y se han utilizado una variedad de métodos de transfección en la expresión transitoria con
células HEK. Entre los agentes químicos de transfección más utilizados se encuentran la polietilenimina (PEI) [70], el fosfato cálcico, la lipofectamina y el
metafecteno. Las últimas alternativas son costosas y, en consecuencia, se utilizan principalmente en pequeña escala. El fosfato de calcio y el PEI son
alternativas menos costosas que se han utilizado en una escala de al menos 100 l [71,72]. Se han informado rendimientos de anticuerpos en el nivel de g/
L de transfección transitoria con HEK utilizando PEI como agente de transfección [73]. Los métodos de transfección física, como la electroporación, también
se han planteado como una alternativa potencial para la expresión transitoria a mayor escala. Se han investigado varios parámetros para maximizar los
rendimientos en procesos transitorios con HEK. Los ejemplos incluyen la optimización de la cantidad de ADN que se transfecta, la proporción de ADN a
agente de transfección, el tiempo y las condiciones de solución para la formación del complejo, el medio de transfección, la suplementación del medio
después de la transfección y la densidad celular en el momento de la transfección . 72,74].
PEr.C6
El sistema de expresión PER.C68 se estableció en 1998 a partir de células de retinoblastos embrionarios humanos no tumorigénicos inmortalizados con
secuencias de codificación de adenovirus Ad5 E1A y E1B [75]. PER.C6 se generó de conformidad con las buenas prácticas de laboratorio, y la línea celular
se ha documentado ampliamente desde la primera etapa para garantizar que se cumplan todos los requisitos reglamentarios para la fabricación clínica y
comercial. Las células han sido ampliamente probadas y limpiadas de virus adventicios. PER.C6 se desarrolló inicialmente para la producción de vectores
adenovirales utilizados en el desarrollo de vacunas y con fines de terapia génica, pero el sistema también ha encontrado uso en la producción de proteínas
recombinantes. Varios proyectos con células PER.C6 han alcanzado el estado de ensayo clínico, pero ninguno de estos proyectos ha obtenido la
aprobación del mercado en el momento de escribir este artículo. PER.C6 está protegido por una amplia cartera de patentes y la línea celular está disponible
bajo licencia de Patheon.
Los beneficios de las células PER.C6 incluyen el crecimiento en suspensión en medios sin suero, buenos rendimientos sin amplificación génica,
capacidades postraduccionales humanas y la capacidad de alcanzar densidades celulares extremadamente altas de más de 100 millones de células/
ml. El sistema PER.C6 atrajo la atención mundial cuando Crucell y Percivia anunciaron en 2008 un título de anticuerpos de nivel récord de 27 g/L con
PER.C6 utilizando el proceso patentado XD. Este resultado fue de un experimento en escala de investigación.
Las productividades volumétricas a este nivel extremadamente alto no suelen buscarse en la biofabricación, ya que pueden provocar agregaciones de
proteínas no deseadas, degradación del producto y otros problemas en el proceso de purificación posterior. Sin embargo, este experimento mostró lo que
estaba al alcance, al menos teóricamente, y esto condujo a una mayor atención a las células PER.C6 posteriormente. PER.C6 tiene excelentes capacidades
de crecimiento celular, pero cuando se trata de la productividad celular específica, los sistemas CHO establecen el estándar para muchos productos. Los
beneficios con una alta productividad específica de celda incluyen que se requiere una cantidad relativamente baja de celdas para una determinada
productividad volumétrica. Por el contrario, si la productividad específica de la célula es baja, se requiere una mayor cantidad relativa de biomasa para el
mismo rendimiento volumétrico. Una gran cantidad de biomasa puede generar desafíos aguas abajo, en términos de eliminación de subproductos celulares
como membranas celulares, ADN y proteínas de la célula huésped.
8. Fosfoglicerato quinasa-E1 Retina Clon 6.

GORRA
La producción de amniocitos (CAP) de CEVEC es una línea celular humana que se origina a partir del líquido amniótico. La línea celular ha sido
inmortalizada a través de la transformación con un gen E1 de adenovirus tipo 5 [76]. CAP se desarrolló para resolver la necesidad de una
generación rápida de líneas celulares de producción humana capaces de secretar altos niveles de proteínas sin necesidad de seleccionar
antibióticos. Las células CAP crecen en suspensión en un medio sin suero y pueden realizar modificaciones postraduccionales completamente
humanas. La línea celular es capaz de expresar al menos 30 pg/célula/día de proteínas totalmente glicosiladas y sialiladas. Se demostró que la
expresión del gen de interés es estable durante más de 90 pases en ausencia de cualquier selección de antibióticos [76]. Las células CAP
alcanzaron el primer hito en humanos con la finalización exitosa de un estudio clínico de fase I en 2013. En el momento de escribir este artículo,
ningún producto producido con células CAP ha obtenido aún la aprobación de la licencia biológica.
CAP-T es una variante de esta línea que expresa constitutivamente el antígeno T grande de SV40. CAP-T se ha desarrollado para permitir la
expresión génica transitoria con plásmidos que portan el origen de replicación SV40. Se plantea la hipótesis de que el origen similar a las células
madre de las células CAP podría permitir una producción más eficiente de productos difíciles de expresar, presumiblemente debido a la expresión
de enzimas y chaperonas particulares [77]. Los rendimientos superiores de las proteínas de prueba a escala de investigación parecen indicar que
las células CAP/CAP-T son capaces de una producción transitoria a niveles similares o incluso mejorados a los de las células HEK-293. CEVEC
también ofrece una tercera variante del sistema de producción de CAP, CAP-GT, que se desarrolla con fines de terapia génica.
6.3 SISTEMAS MICROBIANOS

La producción microbiana es una opción de producción para productos bioterapéuticos menos complejos donde no se requieren modificaciones
postraduccionales para la funcionalidad del fármaco. En cuanto a los sistemas de cultivo de células animales, no existe una sola plataforma
microbiana que se ajuste a las necesidades de todos los productos o todos los biofabricantes. Las consideraciones incluyen, por ejemplo, la
biomolécula a producir, la cantidad de producto requerida, si el producto debe secretarse, si la endotoxina es una preocupación y si se necesita
glicosilación para un producto final completamente funcional. Los sistemas microbianos en general ofrecen la ventaja de un crecimiento rápido,
robusto y predecible, un medio de crecimiento simple y de bajo costo, una clonación rápida y un potencial para rendimientos de productos muy
altos. Sin embargo, los rendimientos dependen del producto y están sujetos a variaciones considerables. Los problemas comunes en la producción
microbiana incluyen baja productividad, impurezas relacionadas con el producto e inestabilidad del plásmido o del organismo huésped. Para
mejorar los procesos microbianos y abordar estos desafíos, las empresas han desarrollado cajas de herramientas de expresión microbiana,
donde diferentes elementos se pueden combinar rápidamente para permitir la detección del organismo y la cepa de producción más adecuados
en poco tiempo. Usando un enfoque racional, la detección se puede completar en aproximadamente dos meses. Entre los sistemas microbianos
domina Escherichia coli , seguido de levaduras como Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Pseudomonas y Bacillus son otras dos clases
de bacterias que han ganado el interés de la comunidad de biofabricación. Se utilizan algunos sistemas microbianos adicionales para productos
de nicho en el área de vacunas: Vibrio cholerae para la producción de la vacuna Dukoral (Crucell) y Bordetella pertussis en la producción de la
vacuna Triacelluvax (Chiron/Novartis).
6.3.1 Bacterias
Escherichia coli ha sido el caballo de batalla número uno en biotecnología desde la aprobación del primer producto recombinante Humulin, insulina
humana, en 1982. E. coli sigue siendo la opción preferida para proteínas pequeñas y péptidos sin modificaciones postraduccionales. Esto se debe
a su seguridad, facilidad de manejo, buena escalabilidad y alta productividad, entre otras razones. Se utilizan diferentes cepas de E. coli para la
biofabricación, y dos cepas de uso común se denominan K12 y B. Las cepas tienen diferentes características de crecimiento, por ejemplo, las
cepas B producen mucho menos ácido acético que las cepas K12 [78].
Por lo general, la producción no es continua, pero la inducción se realiza en una etapa predeterminada del proceso utilizando inductores como
azúcar, IPTG,9 o agotamiento de nutrientes. Los sistemas de producción de E. coli están completamente modelados y caracterizados, y hay
menos incógnitas en este sistema en general, en comparación con los sistemas que utilizan cultivos de células animales. E. coli es el sistema de
producción elegido para pequeñas proteínas y péptidos sin modificaciones postraduccionales. Los fragmentos de anticuerpos más pequeños,
incluidos los anticuerpos biespecíficos sin ninguna glicosilación, se producen con éxito en bacterias y han avanzado a las pruebas clínicas [79]. E.
coli también es una herramienta estándar utilizada durante la investigación.
Los organismos de E. coli se dividen en tres compartimentos: el citoplasma, el periplasma y el espacio extracelular.
Las proteínas recombinantes pueden dirigirse a cualquiera de estos destinos, pero en la producción biofarmacéutica, el citoplasma es el
compartimento objetivo más común. Cuando el producto se dirige al espacio citoplásmico o periplásmico, la producción de alto nivel puede
conducir a una acumulación de intermediarios de plegamiento llamados cuerpos de inclusión. Es probable que los mecanismos detrás de la
formación de cuerpos de inclusión dependan de las moléculas, pero los detalles no se comprenden por completo [80].
9. IPTG = isopropil ÿ-D-1-tiogalactopiranósido.

La desnaturalización y el replegamiento de cuerpos de inclusión es a menudo un proceso complejo y costoso que involucra múltiples pasos, y el rendimiento final
del producto replegado activo puede ser muy bajo para ciertas moléculas. En esos casos, los métodos de producción alternativos son una opción más factible. Sin
embargo, los cuerpos de inclusión también pueden traer ventajas. La proteína que se produce en los cuerpos de inclusión se puede acumular en más del 25 % de
la cantidad total de proteína en la célula, mucho más que las proteínas solubles. Los cuerpos de inclusión se pueden aislar y concentrar fácilmente mediante
centrifugación, lo que simplifica el proceso posterior para eliminar las proteínas y los péptidos nativos. Finalmente, la proteína en los cuerpos de inclusión es inactiva
y esto es beneficioso en la producción de productos tóxicos.
En la producción periplásmica o extracelular, están presentes menos moléculas nativas derivadas de células huésped, lo que facilita el proceso posterior y
disminuye el riesgo de degradación proteolítica. Un beneficio con la producción periplásmica es que es un entorno oxidativo, lo que permite la formación de enlaces
disulfuro. Sin embargo, las capacidades secretoras de E. coli no están muy bien desarrolladas, y los rendimientos en los compartimentos periplásmico y extracelular
suelen ser inferiores en comparación con la producción intracelular. Esto es especialmente cierto para la producción extracelular, que también conduce a la dilución
de la proteína diana. Aunque tienden a preferirse otros sistemas microbianos como Bacillus o levaduras para la producción secretora de proteínas, E. coli
todavía puede ser una opción que vale la pena investigar, y se están realizando investigaciones para mejorar aún más sus capacidades secretoras.
Los sistemas de E. coli son muy rentables debido a las altas tasas de crecimiento, los requisitos simples de nutrientes y la capacidad de producir altos
rendimientos. El límite teórico de densidad celular de un cultivo de E. coli se estima en aproximadamente 200 g de peso celular seco/L [81]. En la práctica, la
densidad máxima es mucho más baja, pero el sistema aún tiene el potencial de alcanzar más de 100 g/L de peso de celda seca [82]. Este alto nivel de productividad
puede ser un desafío para mantener en la escala de producción. En condiciones ambientales óptimas, el tiempo de duplicación de E. coli es de unos 20 minutos.
Es fundamental para el resultado exitoso de una fermentación de E. coli un buen control del pH, la temperatura y el oxígeno disuelto, una mezcla completa y
estrategias de alimentación de nutrientes que minimicen la formación de subproductos. El medio de crecimiento no es tan complejo como los medios de cultivo de
células animales. El medio de sales minerales contiene simplemente una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, un tampón, sales, vitaminas y oligoelementos.
Sin embargo, algunas cepas de E. coli pueden necesitar suplementos para un buen crecimiento y una alta producción. Las mezclas de nutrientes altamente
complejas, como LB, se utilizan en la investigación, pero normalmente se evitan a mayor escala debido a la naturaleza indefinida de estas mezclas y los desafíos
posteriores relacionados con el control de lote a lote y el control del proceso.
Algunos desafíos generales relacionados con la producción de E. coli se ven en la Tabla 6.4. La falta de capacidades de modificación postraduccional limita el
uso de fermentaciones de E. coli , la inestabilidad del plásmido puede conducir a una caída de la productividad, la actividad proteolítica puede disminuir el
rendimiento del proceso y las endotoxinas pueden generar desafíos en el proceso de purificación posterior. La investigación está en curso para abordar los desafíos.
Por ejemplo, se puede utilizar la selección auxotrófica10 para mejorar la estabilidad del plásmido durante la fermentación. Esto se puede lograr mediante la
eliminación de un gen esencial en la cepa huésped de E. coli e introduciendo el mismo gen en el esqueleto del plásmido. Otra opción es utilizar la integración
genómica del gen del producto [83].
TABLA 6.4 Una compilación de ventajas y desafíos con los sistemas de producción de E. coli
Ventajas Desafíos
A salvo Inestabilidad del plásmido
Genética simple Sesgo de codóna
Facilidad de manejo Formación de cuerpos de inclusión
Escalabilidad Replegamiento inadecuado de proteínas
Altas tasas de crecimiento Falta de modificaciones postraduccionales
Tiempo de proceso corto Dificultades para expresar proteínas de alto peso molecular
Requisitos de medios simples Proceso complejo aguas abajo
Sistema bien caracterizado Contaminación por endotoxinas
Potencial para altos rendimientos de producto Sin secreción extracelular
expresión rápida digestión proteolítica
Limitaciones en la tecnología de un solo uso disponible
a
Los genes de muchas proteínas humanas contienen codones que son raros en E. coli y esto puede disminuir el nivel de expresión de una proteína recombinante.
La evaluación de la idoneidad del sistema, como para todos los sistemas de producción biofarmacéutica, debe hacerse caso por caso, comenzando por la molécula a producir.
10. La auxotrofia es la incapacidad de un organismo para sintetizar un compuesto particular requerido para su crecimiento.
Un sistema de expresión microbiana desarrollado más recientemente es Pfÿnex Expression Technology, un sistema microbiano basado en
Pseudomonas con un enfoque sistemático para identificar cepas de Pseudomonas fluorescens de alto rendimiento y mejorar aún más estas cepas a
través de una variedad de herramientas de ingeniería genética. P. fluorescens es un organismo aeróbico obligado, lo que significa que no puede cambiar
a un crecimiento anaeróbico cuando los niveles de oxígeno son bajos (como lo hace E. coli ). La plataforma fue lanzada por Dow en 2004, para la
producción de proteínas terapéuticas y antígenos de vacunas. P. fluorescens puede crecer en matraces de agitación hasta una biomasa de
aproximadamente OD 30 a 50A595 unidades, lo que permite la producción de una cantidad relativamente alta de proteína expresada, incluso a pequeña
escala. Los vectores de expresión se desarrollan a través de un enfoque de biología combinatoria utilizando dos plásmidos, cuatro o más promotores,
tres sitios de unión a ribosomas y 25 o más péptidos líderes de secreción. Esto conduce a la creación de más de 100 vectores listos para usar que están
disponibles para la clonación y posterior identificación de cepas altamente productivas.
El enfoque sistemático permite la construcción, selección y fermentación de cepas para identificar cepas altamente productivas en unas ocho semanas.
La tecnología está disponible mediante licencia.
6.3.2 Levadura
La levadura se ha utilizado para hornear y elaborar cerveza durante siglos, y las cepas de levadura ahora también se utilizan en la producción
biofarmacéutica. Las dos cepas de levadura más comunes con fines de biofabricación son Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris.
Las ventajas de la levadura incluyen un rápido crecimiento, fácil manejo, capacidad de producción extracelular, ausencia de endotoxinas y la capacidad
de realizar modificaciones postraduccionales y de plegado correctos, incluido el procesamiento proteolítico de péptidos señal, la formación de enlaces
disulfuro, el ensamblaje de subunidades, la acilación y la glicosilación. Las células de levadura tienen capacidades elementales para la cosilación de
glicosilación y pueden sintetizar estructuras básicas de Man9GlcNAc2. Sin embargo, las estructuras básicas no se procesan más para generar glicanos
complejos. En cambio, se agregan carbohidratos de manosa para dar como resultado glucanos hipermanosilados que provocan respuestas inmunitarias
en humanos y pueden consistir en más de 100 entidades de manosa. La hipermanosilación es común en S. cerevisiae pero menos frecuente en P.
pastoris [84]. La levadura también carece de capacidades de chaperona humana, lo que puede conducir a una incapacidad para producir proteínas
humanas más complejas. Para compensar las incapacidades, la ingeniería genética se ha utilizado para crear capacidades más similares a las humanas
en la levadura. Más de 400 genes de levadura se han humanizado hasta la fecha [85] y se ha intentado la humanización de rutas completas [86]. Existen
cepas de levadura modificadas que pueden producir glicanos biantenarios [87] y la ingeniería genética también se ha utilizado para minimizar la actividad
proteolítica en los procesos de levadura. La presencia de proteasas que pueden degradar la proteína recombinante es un desafío común en los procesos
de levadura.
La levadura de panadería Saccharomyces cerevisiae se ha utilizado durante mucho tiempo como organismo modelo para el estudio de la biología
humana. Se han expresado más de 40 proteínas recombinantes diferentes en S. cerevisiae [88]. Los productos biofarmacéuticos dominantes producidos
por S. cerevisiae son los péptidos de insulina, la albúmina sérica humana, las vacunas contra la hepatitis y las partículas similares a virus. S. cerevisiae
se utiliza, por ejemplo, en el proceso de vacunas de Gardasil (Merck) contra la infección por el virus del papiloma humano.
P. pastoris es un sistema de levadura bien conocido por su crecimiento a densidades celulares muy altas, por la disponibilidad de promotores
fuertes y estrictamente regulados, y por las opciones para producir cantidades de gramos de proteína recombinante tanto intracelular como secretora.
Pichia es una levadura metilotrófica capaz de metabolizar metanol como única fuente de carbono. Esta característica se utiliza en el sistema de
producción de Pichia más utilizado, donde el producto de interés se clona bajo el control del promotor del gen de la alcohol oxidasa 1 (AOX1), el primer
gen en la ruta de utilización del metanol.
Entonces se puede inducir la producción de proteína recombinante mediante una alimentación de metanol. Sin embargo, el metanol es un solvente y el
manejo de grandes volúmenes de metanol requiere medidas de seguridad adecuadas para líquidos volátiles. En algunos casos, las ventajas de títulos
más altos superan los problemas relacionados con el metanol. En otros casos, los sistemas de expresión alternativos o los procesos de Pichia con otros
promotores que AOX1 son opciones. Los productos recombinantes que se producen en P. pastoris incluyen insulina humana (Insugen, Biocon), albúmina
sérica humana (Medway, Mitsubishi Tanabe Pharma), vacuna contra la hepatitis B (Shanvac, Shantha/Sanofi), microplasmina (Ocriplasmin,
ThromboGenics) y ÿ -Fragmento de anticuerpo de dominio único del receptor IL6 (Nanobody ALX-0061, Ablynx) entre otros productos.
Otra levadura metilotrófica que ha ganado el interés de los biofabricantes es Hansenula polymorpha [89]. El beneficio de este sistema de expresión
radica en la capacidad de expresar múltiples proteínas dentro de la misma célula. Se puede diseñar un vector con dos o más casetes de expresión en
una disposición en tándem, y las células transformadas siempre tendrán los genes presentes en proporciones equimolares. H. polymorpha se encuentra
naturalmente en el jugo de naranja, la harina de maíz, los insectos y el suelo en mal estado.
6.4 OTROS SISTEMAS DE PRODUCCIÓN

Además de los sistemas de producción de mamíferos y microbianos, vienen los sistemas bien establecidos de células de insectos/baculovirus y sistemas
basados en células vegetales. Estos sistemas son eucariotas y las células pueden realizar modificaciones postraduccionales complejas, aunque estas
modificaciones no son completamente de mamíferos. La velocidad y la comodidad asociadas con las células de insecto
La producción ha hecho que estos sistemas sean populares en las etapas de descubrimiento y desarrollo temprano, por ejemplo, cuando se requieren
pequeñas cantidades de proteína para la caracterización bioquímica inicial de un fármaco. La producción recombinante basada en células vegetales incluye
procesos en los que se utiliza la planta completa y procesos en los que solo se cultiva una parte de la planta. Tanto los sistemas de células de insectos como
los de plantas se utilizan actualmente para productos que han obtenido la aprobación del mercado.
6.4.1 Células de insecto
Los sistemas de expresión de baculovirus de células de insecto se desarrollaron en la década de 1990 como una alternativa simple y segura a los sistemas
de expresión de mamíferos, mientras que tenían capacidades de glicosilación más avanzadas en comparación con levaduras y bacterias. Se ha producido
con éxito una amplia variedad de proteínas en células de insectos, incluidas enzimas citosólicas y proteínas unidas a la membrana [90]. La expresión de
células de insecto es popular en las primeras etapas del desarrollo de fármacos, como un medio rápido para expresar cantidades de mg a g de un candidato
a fármaco para estudios estructurales, ensayos de detección y otros experimentos. Los sistemas de baculovirus de células de insecto también se utilizan en
procesos a gran escala para la producción de productos aprobados. Las limitaciones incluyen un patrón de glicanos no mamíferos y dificultades para
aumentar los rendimientos por encima de cierto nivel [91].
El sistema de expresión de células de insecto más popular es transitorio y consta de dos partes: una célula huésped de insecto y un vector del virus de
la polihedrosis nuclear múltiple de baculovirus Autographa californica (AcMNPV). AcMNPV solo se dirige a los insectos, y esto hace que el sistema sea muy
seguro para los humanos. El gen de interés se inserta detrás de un promotor fuerte, generalmente polihedrina o p10, en el esqueleto del baculovirus. La
transducción de los genomas de baculovirus en las células de insectos da como resultado la expresión tanto de genes virales como de genes de productos.
Nuevas partículas virales brotan de las células infectadas y posteriormente infectan nuevas células, mientras que las células infectadas eventualmente se
lisarán. La producción de proteínas continúa hasta la lisis, aproximadamente 48 horas después de la infección.
Las líneas de células huésped de insectos más utilizadas se originan a partir del gusano cogollero Spodoptera frugiperda (Sf9, Sf21, expresSF+) y Trichoplusia
ni (BTI-TN-5B1-4 High five). También está disponible un sistema de insectos estable e inducible basado en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster
(D.Mel-2).
Las células de insecto crecen en suspensión como células individuales o pequeños grupos a una temperatura de 27 °C a 28 °C. Esta es una temperatura
óptima más baja en comparación con las células de mamíferos, y las incubadoras y los biorreactores pueden necesitar capacidades de enfriamiento
adicionales para controlar con precisión la temperatura de los cultivos de insectos. El tiempo de duplicación de las líneas celulares de insectos varía según el
clon específico y el medio de cultivo, pero suele ser de alrededor de 24 h. Las células crecen bien en un medio sin suero ni proteínas. Sin embargo, a menudo
se requieren suplementos complejos de levadura o similares para altas productividades. Las células de insectos tienden a ser más sensibles al cizallamiento
que las células de mamíferos, y los protectores de cizallamiento como Pluronic F-68 se incluyen típicamente en el medio de cultivo de células de insectos [92].
La producción a gran escala con sistemas de expresión de células de insecto normalmente incluye dos trenes de aumento de escala separados: uno
para el cultivo de células huésped y otro para el stock de virus. El cultivo de células huésped de producción se cultiva hasta una densidad celular específica
y luego se agregan baculovirus en un punto de tiempo predeterminado (momento de infección, TOI) con un número definido de virus por célula (multiplicidad
de infección, MOI). Si la MOI es baja, no todas las células se infectarán al mismo tiempo y se producirán varias rondas consecutivas de infecciones. Si el
MOI es 5 o superior, la infección será sincrónica [93] y el proceso será breve. Sin embargo, una infección síncrona puede requerir una reserva de virus muy
grande y esto puede resultar poco práctico en la escala de producción. Se ha demostrado que tanto las estrategias de MOI alta como baja tienen éxito en la
producción y, por lo tanto, la estrategia elegida depende de factores como la estabilidad del producto, la toxicidad y si se dispone de una reserva de virus
alta. Independientemente de la MOI, la infección requiere mucha energía, y esto se refleja en un alto consumo de oxígeno en esta etapa del proceso [94].
Una limitación en los sistemas basados en células de insectos es un patrón de glicanos no mamíferos. Las células de insectos pueden realizar los
mismos pasos iniciales que las células de mamíferos para producir N-glicanos, pero muchas especies de insectos carecen de la capacidad para alargar el
núcleo del pentasac charide Man3GlcNac2. Otro desafío es la dificultad de aumentar la productividad por encima de cierto nivel. El rendimiento del producto
depende de múltiples factores, incluida la fisiología celular en el momento de la infección, la calidad de la reserva de baculovirus y el medio de cultivo celular.
Una observación común es una disminución repentina de la productividad en un punto de tiempo específico o concentración celular. Esto se conoce
comúnmente como "el efecto de densidad celular".
En 2015, había tres productos fabricados con células de insecto aprobados en el mercado: vacuna trivalente contra la influenza (Flublok, Protein
Sciences Corp) fabricada con células expresSF+, vacuna divalente contra el VPH (Cervarix, GSK), fabricada en Hi-5 Rix4446 derivado de Trichoplusia ni y
sipuleucel-T, una inmunoterapia para el tratamiento del cáncer de próstata (Provenge, Valeant11). La terapia Provenge consiste en la transfusión de células
mononucleares autólogas de sangre periférica entera activadas ex vivo con una proteína de fusión recombinante producida en células de insecto Sf21. Esta
es una terapia de alto costo y ha provocado una discusión sobre cuál es un costo razonable para la bioterapia en general.
11. Valeant adquirió Dendreon, que desarrolló Provenge, en 2015.

6.4.2 Células vegetales

El cultivo de células vegetales es una opción de producción interesante para productos biofarmacéuticos. Las células vegetales pueden realizar
modificaciones postraduccionales complejas, y los sistemas se consideran seguros ya que no albergan ningún patógeno humano conocido ni
endotoxinas bacterianas [95]. Los productos recombinantes se acumulan principalmente en la vacuola de la planta, pero las proteínas más
pequeñas pueden atravesar la pared celular hacia el entorno extracelular. Las células vegetales son totipotentes, lo que significa que cada
célula tiene el potencial de formar una nueva planta completa y/o formar todos los tipos de células. El tamaño de una célula vegetal puede ser
de hasta 100 ÿm de diámetro, que es muchas veces más grande que las bacterias y las células animales. A modo de comparación, el diámetro
de E. coli es de 2 ÿm y el diámetro de las células de mamíferos es de aproximadamente 10 a 15 ÿm. Muchas células vegetales crecen con
bastante lentitud, y el tiempo de duplicación de las células vegetales puede ser de varios días. La temperatura óptima de crecimiento suele
estar entre 23 °C y 29 °C, y el pH óptimo entre 5 y 6 [96]. Un ciclo periódico de luz y oscuridad (16:8 h/h) promueve el crecimiento y aumenta la
productividad de las células vegetales. La cantidad óptima de luz es específica de la cultura, pero se han informado valores de 0,6 a 10 lux en
la literatura [93]. Los medios de cultivo de células vegetales suelen incluir una fuente de carbono, suplementos inorgánicos y orgánicos,
fitohormonas y una matriz de soporte, si es necesario [93]. No se incluyen componentes de medios sensibles a la luz, a diferencia de muchos
medios de cultivo de células animales. A pequeña escala, las células vegetales se pueden cultivar en matraces de agitación convencionales y,
a mayor escala, se han empleado varios diseños de biorreactores. Los ejemplos incluyen modificaciones de tanques agitados convencionales,
biorreactores oscilantes de un solo uso y biorreactores desechables diseñados a medida [95,97]. El primer producto producido en cultivo vegetal
Elelyso (taliglucerasa alfa, Protalix BioTherapeutics), fue aprobado por la FDA en mayo de 2012. Elelyso es una enzima producida en células
de zanahoria modificadas genéticamente, para tratar la enfermedad de Gaucher tipo 1.
6.5 PERSPECTIVA Y PERSPECTIVA

En teoría, cualquier célula que pueda mantenerse en cultivo puede manipularse para expresar proteínas heterólogas. A pesar de este hecho,
desarrollar una nueva célula huésped para biofabricación no es una tarea fácil. En primer lugar, el organismo huésped debe ser capaz de
sintetizar el producto de interés, con los atributos de calidad correctos y un rendimiento adecuado. Segundo, la cultura debe ser robusta y
escalable y el resultado del proceso consistente. En tercer lugar, el sistema debe ser seguro y esto debe demostrarse exhaustivamente. Deberá
proporcionarse documentación de la historia completa del organismo de producción, desde la primera etapa de desarrollo hasta los pasajes que
se utilizarán para la producción. Esto incluye detalles de células madre, fusiones y métodos de inmortalización. Esta puede ser una tarea
desafiante, si no imposible, a menos que el proceso de desarrollo de la célula huésped se haya realizado de manera bien documentada y
controlada. Llevar al mercado un nuevo organismo huésped de producción lleva muchos años, si no décadas, y una cantidad considerable de
recursos. En cambio, gran parte de los esfuerzos de desarrollo actuales se centran en mejorar las plataformas existentes, que han demostrado
ser compatibles con las instalaciones comerciales de producción a gran escala. Esto se puede hacer mediante la ingeniería dirigida del genoma,
la evolución dirigida o forzada para generar nuevas variantes de células existentes, o la clonación de una sola célula para seleccionar los rasgos
más apropiados en una población específica [18].
Los sistemas de producción que se utilizan actualmente para la biofabricación a gran escala probablemente seguirán siendo caballos de
batalla en el futuro previsible. Esto significa que los CHO seguirán dominando la fabricación de productos biofarmacéuticos más complejos y
los sistemas de E. coli seguirán siendo la primera opción en la producción microbiana. Además de la complejidad de traer un nuevo organismo
huésped al mercado, como ya se mencionó, tres aspectos principales abogan por un alto uso continuo de CHO y E. coli. En primer lugar, gran
parte de la infraestructura existente que se requiere para los procesos de fabricación ya está instalada. En segundo lugar, hay disponibles
tecnologías plug-and-play que simplifican y aceleran el desarrollo de nuevos procesos con estos organismos huéspedes. Tercero, la cantidad
de conocimiento disponible sobre E. coli y CHO es enorme, y esto facilita la toma de decisiones y la aprobación regulatoria cuando se desarrolla
un proceso para una nueva molécula terapéutica. Todos los aspectos mencionados anteriormente pueden contribuir a un proceso de desarrollo
rápido que resulte en una operación de fabricación robusta y segura con una productividad que cumpla con los requisitos del negocio. Además,
los largos ciclos de desarrollo de los productos biofarmacéuticos contribuyen a una adopción lenta de las nuevas tecnologías. En consecuencia,
el umbral para que las tecnologías emergentes ingresen al mercado es considerable.
Aunque E. coli y CHO dominan en sus respectivas categorías, tienen varias debilidades que crean vacíos, donde se utilizan y se seguirán
utilizando organismos de producción alternativos. Esto es específicamente para productos que no encajan bien con estos dos sistemas. Para
CHO, las principales debilidades inherentes incluyen un patrón de glicano no humano y un genoma plástico con reordenamientos cromosómicos
frecuentes. El patrón de glucanos de CHO no es una preocupación para la mayoría de los productos, pero en casos críticos, una línea celular
humana podría ser una mejor opción. Los reordenamientos genómicos frecuentes pueden crear desafíos para el biofabricante. Con una célula
huésped más predecible y genéticamente estable, el proceso de desarrollo se puede acortar y el proceso de ampliación puede volverse más
sencillo. Para E. coli, las deficiencias en el organismo bacteriano (p. ej., desafíos con la producción extracelular) son una limitación importante.
El hecho de que el umbral para un nuevo organismo huésped sea alto no significa que las cosas vayan a permanecer siempre como están actualmente. Los
disruptores potenciales para el dominio de CHO y E. coli incluyen tecnologías de un solo uso y nuevos formatos de terapia. Con los sistemas desechables, se requiere
menos inversión inicial en comparación con la tecnología de reutilización tradicional, y esto facilita el desarrollo de procesos y formatos emergentes. En consecuencia,
una nueva estrategia de producción se puede probar más fácilmente y con menos riesgo financiero en un entorno de un solo uso, en comparación con una instalación
de reutilización. Esto crea oportunidades para nuevos procesos y organismos huéspedes. Un buen ejemplo es el primer Elelyso bioterapéutico elaborado a base de
plantas aprobado y desarrollado por Protalix. Elelyso se fabrica en células huésped de zanahoria utilizando la plataforma ProCellEx con biorreactores de un solo uso
diseñados específicamente para satisfacer las necesidades de las células de zanahoria. Los nuevos formatos de terapia y fármacos tienen el potencial de crear un
cambio de paradigma en toda la industria biofarmacéutica, especialmente cuando se trata de productos biológicos completamente diferentes, como la terapia génica o
los virus oncolíticos, que también tienen que ser producidos por cultivos de células (animales). Además, la tendencia mundial actual es hacia medicamentos
personalizados con mayor eficacia para poblaciones de pacientes más pequeñas. Queda por ver qué sistema de producción cumple con los requisitos para este tipo de
terapias. A veces, el organismo huésped provendrá de los propios pacientes, como en la terapia celular autóloga. En otros casos, los sistemas de producción existentes
podrían encajar muy bien, como en la producción de fragmentos de anticuerpos y bioconjugados.
APÉNDICE I LA TECNOLOGÍA DE HIBRIDOMA Y HUMANIZACIÓN DE ANTICUERPOS
Las células de hibridoma se desarrollan artificialmente mediante la fusión de una célula de mieloma inmortal (como Sp2/0 o NS0) y un linfocito productor de anticuerpos
mortales [3]. Las células híbridas se seleccionan en medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) donde solo pueden sobrevivir las células fusionadas. La tecnología
del hibridoma revolucionó la biotecnología moderna cuando se desarrolló en la década de 1970. Antes de ese momento, los anticuerpos se aislaron del suero sanguíneo
de animales inmunizados. Estos anticuerpos eran policlonales, con baja especificidad y variaciones en la calidad. Con la tecnología de hibridoma, se podrían producir
anticuerpos monoclonales altamente específicos en cantidades prácticamente ilimitadas.
Los primeros anticuerpos derivados de hibridomas fueron murinos. Como tales, contenían epítopos inmunogénicos que causan problemas de seguridad y una
eficacia disminuida. Esto se denomina respuesta de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) [98]. Para mejorar el perfil de seguridad de los fármacos de anticuerpos,
se desarrollaron anticuerpos quiméricos y humanizados . Los anticuerpos quiméricos se producen mediante la fusión de regiones variables murinas (VL+VH) en un
esqueleto Fc humano. Los anticuerpos quiméricos son menos inmunogénicos en comparación con los anticuerpos murinos, pero los Fab murinos aún contienen algunas
secuencias que pueden causar efectos secundarios no deseados [98].
Los anticuerpos humanizados consisten en CDR de ratón injertadas en una estructura humana. Los anticuerpos humanizados son significativamente menos
inmunogénicos en comparación con los anticuerpos quiméricos y de ratón, pero el procedimiento de humanización requiere mucho trabajo.
La mayoría de los anticuerpos que ingresan a los ensayos clínicos en la actualidad son humanizados o completamente humanos [99], y la estrategia preferida es
usar anticuerpos completamente humanos (desarrollados a través de métodos como la exhibición de fagos) y ratones transgénicos diseñados para producir anticuerpos
humanos [99,100 ]. Los ratones transgénicos han permitido el uso de tecnología de hibridoma sin ningún riesgo de respuestas HAMA. Los anticuerpos monoclonales
completamente humanos no solo tienen un mejor perfil de seguridad, sino que también tienen la ventaja adicional de ser muy específicos para sus dianas terapéuticas.
REFERENCIAS
[1] JA Witkowski, Alexis Carrel y el misticismo del cultivo de tejidos, Med. hist. 23 (3) (1979) 279–296.
[2] MR Ladisch, KL Kohlmann, Insulina humana recombinante, Biotechnol. prog. 8 (6) (1992) 469–478.
[3] G. Kohler, C. Milstein, Cultivos continuos de células fusionadas que secretan anticuerpos de especificidad predefinida, Nature 256 (5517) (1975) 495–497.
[4] FM Wurm, Producción de productos terapéuticos de proteína recombinante en células de mamífero cultivadas, Nat. Biotecnología. 22 (11) (2004) 1393–1398.
[5] E. Langer, 13.° informe anual y encuesta sobre capacidad y producción de fabricación biofarmacéutica, 2016.
[6] JY Kim, YG Kim, GM Lee, Células CHO en biotecnología para la producción de proteínas recombinantes: estado actual y potencial adicional, Appl.
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[8] KP Jayapal, KF Wlaschin, W. Hu, MG Yap, Terapias de proteína recombinante de células CHO-20 años y contando, Chem. Ing. prog. 103
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[9] K. Jayapal, KF Wlaschin, MGS Yap, WS Hu, Terapéutica de proteínas recombinantes de células CHO: 20 años y contando, Chem. Ing. prog.
103 (2007) 7.
[10] G. Walsh, Puntos de referencia biofarmacéuticos 2014, Nat. Biotecnología. 32 (10) (2014) 992–1000.
[11] NA Baeshen, MN Baeshen, A. Sheikh, RS Bora, MMM Ahmed, HAI Ramadan, KS Saini, EM Redwan, fábricas de células para la producción de insulina
ción, Microb. Fábricas de células 13 (1) (2014) 141.
[12] A. Rita Costa, M. Elisa Rodrigues, M. Henriques, J. Azeredo, R. Oliveira, Directrices para la ingeniería celular para la producción de anticuerpos monoclonales, Eur.
J. Pharm. Biofarmacia 74 (2) (2010) 127–138.

Biopharmaceutical Processing Development Design and Implementation of Manufacturing Processes Compress 144 160

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Eva K. Lindskog*, Simon Fischer† , Hasta Wenger† , Patricio Schulz†

6.1 CÉLULAS EN PRODUCCIÓN BIOFARMACÉUTICA

1. La ascitis es una acumulación de líquido en la cavidad peritoneal.

Procesamiento biofarmacéutico. https://doi.org/10.1016/B978-0-08-100623-8.00006-2

112 SECCIÓN | II Procesos Upstream Principios y Métodos

Sistema anfitrión Producto Marca Compañía Año de aprobación

E. coli Insulina humulina Eli Lilly 1982 EE. UU.

Hibridomaa Muromonab-CD3 Ortoclon OKT-3b Janssen Cilag 1986 Estados Unidos

Namalwa interferón-alfa Wellferón fundación de bienvenida 1986 Reino Unido

CHO t-PA activasa Genentech 1987 EE. UU.

S. cerevisiae Insulina Novolina nuevo 1991 EE. UU.

SP2/0 Abciximab ReoPro Centocore 1994 EE. UU., 1995 UE

HT-1080 Alfa galactosidasa humana Replagal Productos farmacéuticos de la comarca 2001 UE

T ni vacuna contra el VPH Cervarix GSK 2009 EE. UU.

Células de zanahoria Taliglucerasa alfa eleliso Protalix 2014 EE. UU.

Capítulo de células huésped | 6 113

114 SECCIÓN | II Procesos Upstream Principios y Métodos

6.1.2 Abastecimiento de cultivos

Capítulo de células huésped | 6 115

6.2 CULTIVO DE CÉLULAS ANIMALES

6.2.1 Tipos de cultivo

116 SECCIÓN | II Procesos Upstream Principios y Métodos

6.2.2 Sistemas de mamíferos no humanos

chino Tipo salvaje

pedernal, 1976 Toby, 1962

Kao y Puck, 1968

CHO-pro3- CHO-K1 CHO-Toronto

Urlaub y Chasin, 1983 Cóctel, 1990 Thompson, 1971

CHO-MTXRIII CHO-DXB11 CHOK1SV CHO-S

Urlaub et al. 1986

Capítulo de células huésped | 6 117

4. ÿ[2-6] sialiltransferasa y ÿ[1-3/4] fucosiltransferasas.

118 SECCIÓN | II Procesos Upstream Principios y Métodos

7. Cepa albina del ratón doméstico Mus musculus.

Capítulo de células huésped | 6 119

TABLA 6.2 Productos biofarmacéuticos producidos en las líneas celulares de mieloma

Marca de producto anfitrión de producción Empresa de proteínas recombinantes Aprobación

Sp2/0 ReoPro Abciximab Centocora 1994 (EE. UU.), 1995 (UE)

Sp2/0 Simulecto Basiliximab Novartis 1998 (EE. UU., UE)

NS0 milotarg Gemtuzumab zogamicina Wyeth 2000 (EE. UU.) c

NS0 Soliris eculizumab Alexión 2007 (EE. UU., UE)

Sp2/0 Iliaris Canakinumab Novartis 2009 (EE. UU., UE)

NS0 Arzerra ofatumumab Novartis/Genmab 2009 (EE. UU.), 2010 (UE)

NS0 Benlysta Belimumab grupo glaxo 2011 (EE. UU., UE)

Sp2/0 Inflectra/Remsima Infliximabd Celltrion/Hospira 2013 (UE, 2016 (EE. UU.)

NS0 ciramza Ramucirumab Eli Lilly 2014 (EE. UU.)

120 SECCIÓN | II Procesos Upstream Principios y Métodos

6.2.3 Células humanas

TABLA 6.3 Productos bioterapéuticos producidos por líneas celulares humanas

HT-1080 Replagal Alfa galactosidasa humana Condado 2001 (UE)

HT-1080 Dynepo eritropoyetina Condado 2002 (UE) (retirado en 2009)

HT-1080 Elaprasa idursulfasa Condado 2006 (EE. UU.) 2007 (UE)

HT-1080 privado INN-velaglucerasa alfa Condado 2010 (EE. UU., UE)

Capítulo de células huésped | 6 121

8. Fosfoglicerato quinasa-E1 Retina Clon 6.

122 SECCIÓN | II Procesos Upstream Principios y Métodos

6.3 SISTEMAS MICROBIANOS

9. IPTG = isopropil ÿ-D-1-tiogalactopiranósido.

Capítulo de células huésped | 6 123

Genética simple Sesgo de codóna

Facilidad de manejo Formación de cuerpos de inclusión

Escalabilidad Replegamiento inadecuado de proteínas