INTERNATIONAL STANDARD

ISO 14698-1

Cuartos limpios y ambientes

controlados asociados
— Control de la Biocontamination—

Parte 1: Principios Generales y Métodos

Ing. Evelyn Artavia

2015
 La norma busca promover prácticas de
higiene apropiadas
 Los métodos de control de
biocontaminación o higiene
para hacer productos seguros y
estables.
 Factores: diseño,
especificación, operación y
control de cuartos y ambientes
controlados asociados.
 Procedimientos estándar de
ensayos =Adaptación
 Alcance
 Especifica los métodos
requeridos para monitorear
consistentemente zonas de
riesgo y aplicar controles
apropiados al grado de riesgo.
 En zonas de riesgo bajo se
puede utilizar como fuente de
información.
 3. Términos y definiciones
 Sistema Formal
Sistema de control de
biocontaminación con
procedimientos establecidos y
documentados
 Biocontaminación
Contaminación de materiales,
dispositivos, individuos,
superficies, líquidos, gases o
aire con partículas viables.
 Cuarto limpio Cuarto donde la
concentración de partículas
aéreas están controladas y su
construcción minimiza la
introducción, generación y
retención de partículas dentro
del cuarto, además los otros
parámetros relevantes como
temperatura, humedad y
presión están controlados
Términos 2
 Partículas viables
Partículas que son o soportan uno o
más microorganismo vivos.
 Unidad viable (VU)
Unas o más partículas que se
cuentan como una sola unidad (una
CFU puede consistir en una o más
VU).
 Bioaerosol
Agentes biológicos dispersados en un
ambiente gaseoso.
 Ambiente controlado
Zona definida donde las fuentes de
contaminación son controladas con
medios específicos.
 Punto de control (control point)
Lugar en un ambiente controlado donde
se realiza control y un riesgo se puede
prevenir, eliminar o reducir a niveles
aceptables.
 Zona de riego (risk zone)
Espacio definido y delimitado donde los
individuos, productos o materiales son
particularmente vulnerables a
contaminación.
Términos 3
 Dispositivo de contacto (contact
device)
Soporte especialmente diseñado que
posee un medio de cultivo estéril y
una superficie accesible utilizado para
realizar muestreo de superficie.
 Placa de contacto (contact plate)
Dispositivo de contacto donde el
contenedor es un disco rígido
 Plato fijo (settle plate)
Contenedor de tamaño apropiado que
contiene medio de cultivo estéril que
se abre por un periodo definido para
colectar partículas viables del aire.
 Muestreador de impacto (impact
sampler)
Dispositivo diseñado para muestrear
partículas en el aire u otro gas por
medio de colisiones en una superficie
sólida.
 Muestreador de inyección
(impingement sampler)
Dispositivo diseñado para muestrear
partículas en el aire u otro gas por
colisión con una superficie líquida y su
subsecuente entrada en el líquido.
 Placa de contacto Dispositivo de contacto Placa fija

Muestreador de choque
Muestreador de impacto
(líq.)
 Términos 4

 Nivel de acción (action level)  Nivel de alerta (alert level)

Nivel establecido por el usuario Nivel establecido por el usuario

que cuando se excede requiere la para brindar una prevención
intervención inmediata, incluye temprana de una fluctuación de
investigación de la causa y una las condiciones normales que
acción correctiva. cuando exceden requieren una
 Nivel meta (target level) mayor atención al proceso.
Nivel definido asignado por el
usuario como meta en
operaciones rutinarias, para uso
propio.
 Términos 5
Validación
 Confirmación, mediante
evidencia objetiva, que se han
llenado los requerimientos para
un uso específico o aplicación.
Verificación
 Confirmación, con evidencia
objetiva, que se han llenado los
requerimientos específicos.
 Nota: Se pueden utilizar
métodos de monitoreo y
auditaje, procedimientos y
ensayos, incluyendo muestreo
al azar y análisis.
 Occupancy states

• Instalación completa At-rest • La instalación

con todos los serv. funciona de manera
conectados y • Instalación completa específica, con un
funcionando, pero sin con equipo instalado número específico de
equipo de producción, y operando, pero no personal presente
materiales o personal con personal
presentes presente

As-built Operacional
4. Principios de la biocontaminación

 Un Sistema Formal de Control

de biocontaminación puede
Zonas de Riesgo
establecerse, implementarse, y riesgo potencial
Documentación

mantenerse con cuartos limpios

y ambientes asociados.
Límites
Monitoreo
capacitación de
 Asegura y controla factores que control
y horario

pueden afectar la calidad

microbiológica de los procesos
y producto. Acciones
Verificación
correctivas
 HACCP, FTA, FMEA
5. Establecimiento del Sistema Formal

 5.1 Requerimientos Generales

 Desarrollar, iniciar, implementar y documentar un Sistema Formal
para control de biocontaminación=detección de cond. adversas a
tiempo.
 Incluir un programa de capacitación apropiado.
 Programa de monitoreo diseñado e implementado minimizando la
posibilidad de que el muestreo contribuya a la contaminación del
producto, zona de riesgo o ambas.
 Clasificar las Zonas de riesgo según lineamientos, regulaciones y Sist.
Formal escogido. Acorde a nivel de biocontaminación aérea o
superficial= riesgo bajo, medio, alto o muy alto.
5.2 Niveles de alerta, acción y meta

 Apropiados al campo de aplicación, clasificación de zonas de riesgo y

tecnología.
 Los niveles meta microbiológicos pueden ser usados como una
alternativa de alerta microbiológica y niveles de acción en algunos
campos específicos.
 Revisar datos de niveles de biocontaminación para establecer o
confirmar la línea base para determinar los niveles de alerta y acción.
 Los niveles de alerta y acción se pueden relacionar a los niveles meta
en cada aplicación específica. Deben ser revisados y ajustados
5.3 Monitoreo de biocontaminación

 Plan de muestreo: métodos de muestreo y conteo de unidad de

viables. Anexos A,C, D y F.
 Usos: línea base en as-built, monitoreo de zonas de riesgo en as-
built y at-rest, y monitoreo rutinario es estado operacional.
 Dispositivo
Método
seleccionado

Procedimiento
escrito

Muestreo
 Dispositivo de muestreo
Método de
Tipo de partículas Tiempo y duración muestreo, material
viables del muestreo y propiedades del
medio

Efecto del
Condiciones
Sensibilidad del dispositivo de
ambientales en la
procedimiento muestreo en el
zona de riesgo
proceso o ambiente

Habilidad para
Precisión y Eficiencia de fluidos
Concentración detectar bajos
eficiencia de la de
esperada niveles de
colecta extracción/lavado
biocontaminación

Incubación y
Tipo de información
Flora microbiana Accesibilidad a las detección de part.
(cuantitativa,
nativa zonas de riesgo viables y método de
cualitativa)
evaluación
 Plan de muestreo

Desarrollado Durante el a. Plan de muestreo

por el Sist. estado inicial= punto de
operacional referencia o línea
Formal base
• Periodos de mayor
• Documentado estrés b. Plan de muestreo
• At-rest (diseño y rutinario= resultado
comportamiento) de implementación
del Sistema Formal
 Diseño de Plan de muestreo

Lugar de muestreo
Número de
y función de z. Frecuencia
muestras
riesgo

Disolventes, fluidos
Métodos de Volumen o área
de lavado,
muestreo que se cubrirá
neutralizantes

Factores
Impacto de
particulares que
operaciones,
afecten resultados
personal y equipo
del cultivo
 Frecuencia del muestreo
según Sist. Formal y se modifica cuando:

Niveles de alerta o acción se excedan consecutivamente

Prolongado paro de actividades

Detección de agentes infecciosos en zonas de riesgo

Trabajo de mantenimiento significativo en el sistema de ventilación

Cambios al proceso que afecte el ambiente del cuarto limpio

Reporte de resultados inusuales

Cambios en los procedimientos de limpieza o desinfección

Incidentes no planeados que podrían contribuir a la biocontaminación

Muestreo
Identificación de muestras
Sitios de muestreo Sitio
colecta
 Sistema Formal y Plan de
Fecha
muestreo. Desviación
y hora
 Más de una muestra de cada
Etiqueta o
lugar y diferentes números de código
muestras en diferentes lugares.
Medio
 Puntos de control Persona de
microbiológico definidos en cultivo
procedimientos escritos.
Actividad
5.4 Procesamiento de muestras

 La colecta, transporte y
procesamiento de muestras no
afectará la viabilidad y número
de organismos colectados
Factores
Condiciones y duración de
transporte/almacenaje

 Las muestras se colectarán en

contenedores y de forma que
no agreguen o inhiban la Uso de agentes
neutralizantes
biocontaminación.

Uso de solutos osmóticos

5.5 Cultivo de muestras

Ambiente

Condiciones
Proceso

Medio
Incubación
Cultivo
Equipo
M.O.
esperados
Medio de Cultivo
 No selectivo.
 Aditivos solo para minimizar
actividad microbiana residual.
 La superficie externa o sus
recipientes se mantendrán con
el nivel de limpieza apropiado a
su uso.
 Pueden requerir doble o triple
cubierta y proc. control de
calidad.
Incubación
 Temperatura
 Tiempo:
 2-5 días Bacterias
 5-7 días Hongos
 Condiciones atmosféricas y
tiempos de incubación
específicos para m.o. interés
(anaerobios, termófilos…)
 Observación en intervalos
5.6 Evaluación de los datos del muestreo

 5.6.1 General
 La evaluación de los datos de biocontaminación proveerá
suficiente información para acciones correctivas efectivas.
 Más información en ISO 14698-2.
 NOTA: El monitoreo de contaminación microbiana puede ser
realizada por medición de indicadores indirectos, ej. Medición
de ATP.
5.6.2 Conteos

 Métodos validados: Instrumentos y procedimientos pueden influenciar

los conteos.
 NOTA 1: Información del conteo de partículas viables se da en otras
fuentes.
 NOTA 2: Esta parte de la ISO 14698 no involucra o acepta ninguna
constante directa o relación causal entre las concentraciones de
partículas viables y no viables. Niveles de control para esos
parámetros pueden establecerse separadamente según se requiera.
5.6.3 Caracterización
 El monitoreo microbiológico no identifica ni cuantifica todas la
especies de microorganismos encontradas en ambientes controlados.
 NOTA
 Criticidad del área / Futura investigación
 Categorías amplias (morfología celular, propiedades de tinción y
otras).
 Identificación, a nivel de género, con métodos de laboratorio
establecidos.
 Evaluación de limpieza, desinfección, fuente de contaminación o
acción correctiva.
 Aislamientos de áreas críticas =antecedentes en áreas no críticas.
6. Expresión, interpretación y reporte
de resultados

Expresión Interpretación

• Unidades viables (VU) o • Tendencias según periodos

unidades formadoras de extensos
colonias (CFU) en • Resultados inusuales, y la
unidades SI aceptabilidad de las
• ISO 14698-2 operaciones o productos
procesados, según
revisión de
investigaciones y
resultados específicos
 Reporte de resultados

Método y Dispositivo de Sitio de Actividad y

Tipo de muestra
estándar colecta muestreo estado

Condiciones y Tiempo de
Duración N° personas en
duración examinación de Fecha y hora
muestreo el área
incubación muestras

Variaciones de Resultados desp Unidades SI en Descripción de Nombre de

método u otros de lectura inicial ensayos aislamientos responsable de
fact. y final cuantitativas (caracterización) reporte y fecha
7. Verificación del Sistema Formal
 Los resultados de monitoreo de biocontaminación se examinarán
periódicamente en orden para confirmar que el sistema escogido
funciona de acuerdo con los procedimientos establecidos y los
requerimientos específicos se han completado.
 NOTA
 Se requiere el uso de métodos de monitoreo y auditaje,
procedimientos y ensayos, incluyendo muestreo al azar y análisis.
 Podría requerirse también un sistema de verificación de todos los
pasos de trabajo y equipo.
 Desviaciones de los límites establecidos o cambios en la condición
microbiológica del ambiente controlado=acción correctiva.
 Si aplica, el Sistema Formal se modificará.
8. Capacitación

Anexo G
9. Documentación
Descripción del
Sistema Formal Reporte de aseguramiento de
riesgo

Plan de Muestreo Niveles de acción,

alerta y meta

Procedimientos de ensayo y
Reportes de ensayo,
muestreo
verificación y capacitación
 Anexo A
Guía en la determinación de biocontaminación del aire
 Método de colecta y
dispositivos de muestreo
apropiados, según Plan de
muestreo.
 En zonas de riesgo durante Muestreo Muestreo
estados as-built y at-rest, si Pasivo Activo
aplica, y rutinariamente bajo
operación normal.
Impacto,
 Selección de método y Placas Petri choque o
dispositivo, según finalidad filtración
de la muestra
Selección de dispositivos de muestreo
 No dispositivos de choque para muestreo aéreo =poco volumen,
cantidad, y su tendencia a romper agregados.
 No contaminar el ambiente que se muestrea o se reaspira
1. Tamaño y tipo de las partículas viables.
2. Sensibilidad de part. viables al proc.
3. Concentración esperada.
4. Habilidad para detectar altos o bajos niveles de biocontaminación
5. Medio de cultivo
6. Hora y duración del muestreo
7. Condiciones ambientales
8. Alteración del flujo de aire unidireccional
Propiedades del dispositivo de muestreo

1. Succión apropiada al flujo en niveles bajos de partículas viables en

el aire.
2. Velocidad apropiada de impacto/flujo de aire
3. Colecta precisa y eficiente
4. Facilidad de manejo y operación (bombas de vacío, agua,
electricidad)
5. Facilidad de limpieza y desinfección o esterilización
6. Posible adición intrínseca de partículas viables a la biocontaminación
Muestreo Pasivo (Sedimentación)

 Mide partículas viables que se

posan en las superficies
 Uso: evaluación cualitativa o
cuantitativa de la
contaminación del aire
 Conteo de placa por tiempo:
relación entre el área y el
tiempo de exposición.
Muestreo activo (1)
Niveles bajos (Biocontaminación normal)

Impacto y choque

 Velocidad de impacto:
1. alta, atrapar part. viables 1 μm
2. baja, sin daño mecánico o ruptura de agregados.
3. apropiada al medio de cultivo
 Volumen de muestra: grande, detectar niveles
muy bajos de contaminación y pequeña para
evitar la degradación física o química del medio
de colecta.
 Tasa de flujo: 1 m3 en un tiempo razonable, sin
secar medio.
Muestreo activo (2)
Niveles bajos (Biocontaminación normal)

Filtración
 Condiciones de filtración no afecten viabilidad
(ej. deshidratación).
 Eliminar electricidad estática que interfiera con
tasa de impacto.
 Mismo flujo de succión y velocidad de impacto
del aire que en m. de impacto.
 Contar con dispositivo que mida la tasa de
succión.
 Colocar y remover membranas de los filtros de
manera aséptica.
 ANEXO B

Guía de validación de muestreadores de aire

Colecta eficiente

Eficiencia
Física* Eficiencia
Biológica
Método experimental (1)
Ensayo en una cámara
• Aerosol en un cuarto de 1mx1m, flujo de aire
no unidireccional, filtro HEPA
• Suplir y extraer suficiente aire para presión
negativa y recircular con ventilador
• Método de muestreo de aire filtrado HEPA

Ensayo de cepa de m.o.

• Cepas para probar la eficiencia física:
Bacillus subtilis var. niger , esferas de
poliestireno u otros. Más fácil identificar m.o.
• Cepas para ensayos de eficiencia biológica:
bacterias típicas en el aire del cuarto, ej.
Staphylococcus epidermidis. Menos eficiente
que ensayo de eficiencia física
Método experimental (2)
Generación de partículas que transportan
m.o.
• Disco generador de aerosol de disco giratorio +
suspensión de m.o.= aerosol tamaño controlado
de partícula.
• Ecuaciones que determinan el tamaño de
partículas húmedas y sólidas

Ensayos
• Dentro de cámara o área adjunta turbulencia
similar a cuarto limpio.
• El muestreador y el soporte de filtro de
membrana (0,45 μm) se colocan a 1m del
generador de aerosol .Contador de part.*
• Tiempo de muestreo: unos pocos minutos.
Incubación: 2 días a 37°C
• Cinco soluciones con dif tamaño de partícula (d=
0,8 μm a 15 μm).
Resultados

 Usar campos del muestreador de prueba y el muestreador de filtro de

membrana del mismo volumen de aire para calcular la eficiencia.

 Graficar tamaño de partícula por eficiencia, para utilizar datos para

desviaciones estándar y eficiencias.
 ANEXO C

Guía sobre la determinación de biocontaminación de

superficies
Principio

 Conteo de microorganismo
1. Un dispositivo con un medio sólido de área conocida se pone en
contacto con una superficie= imagen espejo de las unidades viables.
2. Un hisopo se usa para muestrear un área
 Conteo de la tasa de deposición de m.o en una superfcie
 Una superficie con nutriente se expone un periodo conocido a la
deposición de m.o. y se incuba
Dispositivos de muestreo

Placas de
sedimentación

Hisopos

Dispositivo de
contacto ≥20 cm2
Expresión de resultados

 El número de partículas viables en las superficies debe

expresarse: unidades viables / 1 dm2
 O en el caso de placas: 1 dm2 /hora
 1 dm2 =100 cm2
 ANEXO D

Guía sobre la determinación biocontaminación de

textiles
Factores para selección de textiles

Generación de Efecto barrera

Tipo y forma Tela partículas y insuficiente por
dispersión filtración

Limpieza, Eficiencia en
Diseño de la
descontaminación o remoción de Permeabilidad
esterilización prenda
partículas
Causas de biocontaminación excesiva en
textiles

Pobre retención de Descontaminación

Uso incorrecto
partículas insuficiente

Ciclos de lavado Recontaminación

inapropiado después del lavado
Muestreo de contaminación

 Según Plan de muestreo

 Se utilizan dispositivos de contacto
 Expresión de resultados:
unidades de partículas viables por 1 dm2 de muestra de tela
 ANEXO E
Guía sobre la validación de los procesos de lavado
Método de ensayo

1. Suspensión de microorganismos conocidos se prepara en una solución

de proteína.
2. Un volumen conocido de la suspensión se aplica a las piezas de
ensayo.
3. Las piezas de ensayo se someten al proceso de lavado, carga normal
simulada. Se utilizan sólo una vez. Tamaño 10x5 cm, área
contaminada de 5x5 cm, extremos para adjuntarlas.
4. Conteo de m.o. piezas de prueba después del proceso de lavado
5. La reducción de la población de m.o. se mide y se compara con los
valores.
6. Prendas utilizadas en la carga normal simulada deben esterilizarse
antes reuso o se destruyen
Controles

• Conteo de unidades viables de suspensión inicial m.o.

A

• Conteo de unidades viables sobre piezas de control sometidas

al mismo procedimiento con la excepción del proceso de
B lavado

• Conteo de unidades viables sobre piezas de control sometidas

al mismo procedimiento y proceso de lavado, pero se
contaminan con la suspensión de m.o. después del proceso de
C lavado
Microorganismos

Esporas
Bacterias Hongos
bacterianas
• Enterococcus • Saccharomyces • Bacillus subtilis
hirae ATCC 10541 cerevisiae var. Niger
• Escherichia coli ATCC 9084 ATCC 6633
ATCC 10536 • Aspergillus niger • Inóculo ≥107
• Inóculo ≥108 ATCC 16404 células/mL
células/mL • Inóculo ≥107
células/mL
Suspensiones microbianas

Medio de
suspensión

Medio de Solución de
recuperación proteínas
Procedimiento

 Mezclar y dejar en contacto durante 5 min a temperatura ambiente 3

ml de la suspensión de microorganismos y 2 ml de la solución de
proteína C.
 Aplicar 0,5 ml de la suspensión resultante a la pieza de ensayo, por
cada microorganismo probado, se contaminan tres piezas de ensayo.
 Después del proceso de lavado, las piezas de control se llevan al
laboratorio lo antes posible.
 Se realiza diluciones, filtraciones e incubación y finalmente el conteo
de VU
Interpretación de resultados

 Calcular la relación entre el número N de microorganismos aplicado a

las piezas de control.
 Comprobar la reducción por un factor de al menos 105 de la cantidad
de bacterias y de 104 el número de levaduras y esporas de hongos.
 ANEXO F
Guía para la determinación de contaminantes en líquidos
Procedimiento

 La selección del método : naturaleza del líquido y el volumen de

muestra requerido.
 Ej. placa de vertido, placa de extensión, filtración por membrana u
otro.
 Presión del líquido reducida para muestrear .
 Según nivel de biocontaminación, la muestra se analiza directamente
o se realiza un tratamiento apropiado.
 Resultados: N° VU / 1 mL (1 cm3)
 ANEXO G

Guía de capacitación del personal

Elementos para programas de
capacitación estandarizados

Documentos de
Formación

Manual de Formación

Procedimientos de
control de
microbiológico y
biocontaminación
Verificación de la capacitación

Herramientas
Documentación
de evaluación
GRACIAS