Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Código: GUI-LE-05
Versión: Nº: 2
Fecha de entrada en vigencia: 10-juio-2019
RESUMEN: Este documento describe las actividades para la validación de Métodos de Ensayo
Microbiológicos que soliciten su acreditación ante el Organismo Argentino de Acreditación.
Este documento se distribuye como copia no controlada. Debe confirmarse su vigencia antes de
hacer uso de esta versión, por si ha sido modificada.
Página 2 de 14
GUÍA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
CONTENIDO
1. OBJETIVO ..................................................................................................................................... 3
2. ALCANCE ...................................................................................................................................... 3
3. DOCUMENTACIÓN DE REFERENCIA ........................................................................................ 3
4. ABREVIA TURAS Y DEFINICIONES............................................................................................ 4
5. RESPONSABILIDADES ................................................................................................................ 6
6. DESCRIPCIÓN.............................................................................................................................. 7
6.1. Requisitos generales para las actividades de validación y para la estimación de la incertidumbre
de medición ........................................................................................................................................... 7
6.2. Validación de los métodos ............................................................................................................. 8
6.3. Estimación de la incertidumbre de medición ................................................................................ 11
6.4. Expresión de la Incertidumbre de medición en los informes de ensayo ...................................... 13
OAA – Organismo Argentino de Acreditación
1. OBJETIVO
Establecer una guía, de aplicación no obligatoria, para la validación de métodos de ensayo no
normalizados, desarrollados o diseñados por el Laboratorio, métodos normalizados empleados fuera
del alcance previsto, ampliaciones y modificaciones de los métodos normalizados y para las
verificaciones necesarias para confirmar que puede aplicar correctamente los métodos normalizados
antes de utilizarlos para los ensayos. Establecer los principios y los requisitos para la evaluación de
la incertidumbre de medida en los ensayos y para la expresión de dicha incertidumbre. Esta guía está
dirigida a Laboratorios que realizan ensayos microbiológicos utilizados en el análisis de agua y de
alimentos destinados al consumo humano y la alimentación animal, a muestras ambientales en el
ámbito de la producción y manipulación de alimentos y, en productos farmacéuticos o cosméticos.
2. ALCANCE
Esta guía la pueden aplicar los laboratorios de ensayo acreditados ante el OAA, los laboratorios que
solicitan su acreditación, y los evaluadores y expertos técnicos que actúan en los procesos de
acreditación.
3. DOCUMENTACIÓN DE REFERENCIA
3.1. Norma IRAM - ISO/IEC 17025: vigente, Requisitos generales para la competencia de los
laboratorios de ensayo / calibración.
OAA – Organismo Argentino de Acreditación
3.2. Norma ISO 9000 vigente. Sistemas de Gestión de la Calidad - Fundamentos y vocabulario.
3.3. Norma ISO 16140: 2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol for the
GUI-LE-05 v2, F.e.V = 10-julio-2019
Especificidad: (para un tipo de matriz y un nivel de inoculación dado): Fracción del número total de
cultivos o colonias negativos que son asignados correctamente con el método utilizado (3.4).
Nota: También puede definirse como la capacidad de un método de no detectar el microorganismo
diana, si este no está presente.
GUI-LE-05 v2, F.e.V = 10-julio-2019
expresarse, por ejemplo, como ufc por la unidad de cantidad de muestra (ufc/ml ó ufc/g). Ejemplo: en
la determinación cuantitativa de Listeria en leche, el mensurando puede ser el resultado obtenido a
partir del recuento de colonias, luego que se han seguido todos los pasos especificados en el método
de ensayo.
Método cualitativo: método de análisis cuya respuesta es la presencia o ausencia del analito,
detectado de forma directa o indirecta en una cierta cantidad de muestra. (3.3).
Método cuantitativo: método de análisis cuya respuesta es la cantidad del analito medido de forma
directa (enumeración en masa o volumen), o indirecta (color, absorbancia, impedancia, etc.) en una
cierta cantidad de muestra (3.3).
Método de referencia: método internacionalmente reconocido y ampliamente aceptado (3.3).
Nota: (por ejemplo, NMKL, ISO, CEN, métodos de AOAC Internacional, métodos que se indican en la
Unión Europea, en las legislaciones nacionales y ciertas normas nacionales de calidad equivalente).
Método alternativo: método de análisis que demuestra o estima, para una dada categoría de
productos, el mismo analito que se mide utilizando el correspondiente método de referencia (3.3).
Precisión de medida: proximidad entre las indicaciones o los valores medidos obtenidos en
mediciones repetidas de un mismo objeto, o de objetos similares, bajo condiciones especificadas.
(3.15).
Nota: Es habitual que la precisión de una medida se exprese numéricamente mediante medidas de
dispersión tales como la desviación típica, la varianza o el coeficiente de variación bajo las condiciones
especificadas. Las “condiciones especificadas” pueden ser condiciones de repetibilidad, condiciones
de precisión intermedia, o condiciones de reproducibilidad
Precisión intermedia: precisión de medida bajo un conjunto de condiciones de precisión intermedia.
(3.15).
Nota: Este conjunto de condiciones incluye el mismo procedimiento de medición, el mismo lugar y
mediciones repetidas del mismo objeto u objetos similares durante un periodo amplio de tiempo, pero
que puede incluir otras condiciones que involucren variaciones.
Las variaciones pueden comprender nuevas calibraciones, patrones, operadores y sistemas de
medida. En la práctica, conviene que toda especificación relativa a las condiciones incluya las
condiciones que involucren variaciones y las que no.
Rango de validación: rango de número medio de partículas por porción analítica para el cual las
expectativas de las especificaciones de validación (en particular linealidad) han sido aceptablemente
Página 6 de 14
GUÍA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
demostradas.
Nota: por lo general se expresa como el rango de recuento de colonias “confiable” (3.4).
Repetibilidad: precisión de medida bajo un conjunto de condiciones de repetibilidad. (3.15).
Nota: Este conjunto de condiciones incluye el mismo procedimiento de medida, los mismos
operadores, el mismo sistema de medida, las mismas condiciones de operación y el mismo lugar, así
como mediciones repetidas del mismo objeto o de un objeto similar en un periodo corto de tiempo.
Reproducibilidad: precisión de medida bajo un conjunto de condiciones de reproducibilidad (3.15).
Nota: Este conjunto de condiciones incluye diferentes lugares, operadores, sistemas de medida y
mediciones repetidas de los mismos objetos u objetos similares. Los diferentes sistemas de medición
pueden utilizar diferentes procedimientos de medida. En la práctica, conviene que toda especificación
relativa a las condiciones incluya las condiciones que varían y las que no.
Robustez: capacidad de un método para mantenerse sin cambios ante pequeñas pero deliberadas
variaciones en los parámetros del método, que provee una indicación de su confiabilidad durante el
uso normal (3.18).
Nota; las variaciones a las que hace referencia la definición son por ejemplo, cambios en las
condiciones ambientales, en las condiciones de incubación (tiempo/temperatura), calidad y vida útil
OAA – Organismo Argentino de Acreditación
de medios de cultivo y reactivos, pH, etc. La información de la prueba de robustez puede utilizarse
para especificar las condiciones en que debe ser aplicado el método
Sensibilidad (para un tipo de matriz y un nivel de inoculación dado): Fracción del número total de
GUI-LE-05 v2, F.e.V = 10-julio-2019
cultivos o colonias positivos que son correctamente asignados con el método utilizado (3.4).
También puede definirse como la capacidad de un método de detectar el microorganismo diana,
cuando este está presente.
Tasa de Falsos Positivos (para un tipo de matriz y un nivel de inoculación dado): es la probabilidad
o frecuencia con que la muestra sea asignada como positiva cuando en realidad es negativa. Falsos
Positivos son aquellos que han sido asignados como tales conociendo que en realidad son negativos.
La incidencia de falsos positivos es igual a: 1 menos la especificidad (3.11).
Tasa de Falsos Negativos (para un tipo de matriz y un nivel de inoculación dado): es la probabilidad
o frecuencia con que una muestra conocida como positiva, sea asignada como negativa por el
método. La incidencia de falsos negativos es igual a 1 menos la sensibilidad (3.11).
Validación: Confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han cumplido los
requisitos para una utilización o aplicación específica prevista (3.2).
Verificación: Confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que se han cumplido los
requisitos especificados. (3.2).
Veracidad: proximidad entre la media de un número infinito de valores medidos repetidos y un valor
de referencia (3.15).
Nota: El verdadero valor de una cantidad es un concepto teórico y, en general, no puede ser conocido
exactamente. En la práctica el valor de referencia aceptado puede sustituir al valor verdadero. La
veracidad se expresa habitualmente en términos de sesgo o bias. Es aceptado, en los ensayos
microbiológicos cuantitativos, que no se tenga en cuenta al sesgo, en la estimación de la incertidumbre
de medición debido a la naturaleza empírica de los métodos microbiológicos. Es el procedimiento
analítico el que determina directamente el resultado de la medición, por ejemplo, el número de
unidades formadoras de colonias por unidad de muestra. Por lo tanto, no es posible en la práctica
determinar el valor verdadero que se requiere para determinar el sesgo. Incluso cuando se utilicen
materiales de referencia certificados, o los valores derivados de los Ensayos de Aptitud, sólo puede
evaluarse una parte del sesgo. En cualquier caso, aún cuando no se evalúe el componente de la
incertidumbre debida al sesgo, el laboratorio puede demostrar que se encuentra bajo control, por
ejemplo, mediante su participación en ensayos de aptitud o mediante el ensayo de materiales de
referencia certificados.
5. RESPONSABILIDADES
Se encuentran descriptas en el documento DC-SG-07, Responsabilidades y en el punto 6 de este
documento.
Página 7 de 14
GUÍA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
6. DESCRIPCIÓN
Un Laboratorio que realiza ensayos microbiológicos puede utilizar métodos cualitativos y/o
cuantitativos, los cuales se basan en la capacidad natural de los microorganismos de desarrollarse
en un determinado medio de cultivo, a fin de detectarlos y/o poder cuantificarlos.
El laboratorio debe utilizar métodos de ensayo, que satisfagan las necesidades del cliente y que sean
apropiados para los ensayos que realiza, es decir ajustados a su propósito.
Para ello puede utilizar:
− métodos normalizados: son aquellos métodos publicados como normas internacionales o
nacionales, o por organizaciones técnicas reconocidas (Ej.: ISO, NMKL, UNE, EN, AOAC, APHA,
FDA, EPA, Standard Methods for Water and Wastewater, USP, EP, etc.)
− métodos alternativos: se trata de métodos que han sido validados por comparación con el
método de referencia que corresponda, de acuerdo a un estándar aceptado (ej. ISO 16140, ISO/TR
13843, ISO 17994) y son reconocidos formalmente como equivalentes al método de referencia por
un organismo competente de acuerdo a unos datos experimentales obtenidos por ej. mediante
ensayos colaborativos.
− métodos no normalizados: pueden considerarse aquellos métodos normalizados modificados o
OAA – Organismo Argentino de Acreditación
utilizados fuera de su alcance. Por ejemplo: otra matriz, otros medios de cultivo, diferentes
tiempos/temperaturas de incubación, equipos con distintas tolerancias a las especificadas,
combinación de partes del método normalizado con partes de una referencia bibliográfica, etc.
GUI-LE-05 v2, F.e.V = 10-julio-2019
− métodos internos: son aquellos elaborados por el propio laboratorio y que no se encuentran en
normas o u otras colecciones de métodos.
a) identificar las distintas fuentes de incertidumbre, como por ejemplo, la homogeneidad de los
reactivos, la interpretación de los analistas, etc. y demostrar que se encuentran bajo control.
Esto puede realizarse de muchas maneras, tales como diagramas de flujo, tablas, listas o diagramas
GUI-LE-05 v2, F.e.V = 10-julio-2019
1 Método empírico: es un método que determina un valor al que sólo se puede llegar en términos del
método en cuestión y que, por definición, sirve como el único método para establecer el valor aceptado
del parámetro medido (AOAC). Un método de ensayo diferente (a menudo para el mismo analito)
puede dar un resultado diferente, dado que el mensurando se define en los términos del método. Por
esta razón, en los métodos microbiológicos cuantitativos, el sesgo o “bias” no contribuye a la
incertidumbre del método, dado que los resultados dependen de las condiciones definidas en el
método, tales como, la temperatura y tiempo de incubación, los medios de cultivo, etc. Es por ello que
la utilización de materiales de referencia certificados, cuyo valor se obtiene también de métodos
Página 12 de 14
GUÍA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
proceso de medida y, la poca disponibilidad de materiales de referencia certificados que representen
al microorganismo en su hábitat natural, el consenso actual sobre la estimación de la incertidumbre
en los ensayos microbiológicos cuantitativos es que la precisión es el componente más importante y
el único que puede determinarse de una manera práctica, mediante la utilización de datos
experimentales.
Por ello el Laboratorio puede utilizar los siguientes modelos:
6.3.2.1 Precisión intermedia, tal como se describe en la norma ISO 5725-3 incorpora la mayoría,
sino todas, las fuentes de incertidumbre significativas.
Este enfoque es aplicable para estimar la incertidumbre en ensayos microbiológicos cuantitativos,
cuando el recuento de los duplicados seleccionados para realizar la estimación se encuentra dentro
del rango de recuento especificado en el método que se trate.
Sin embargo, cuando se obtienen recuentos bajos o ningún recuento, ya sea en placa o por filtración
por membrana, lo cual para una matriz particular y para un ensayo dado puede ser la regla, no es
apropiado el cálculo de la precisión intermedia, dado que el coeficiente de variación (CV) aumenta
rápida y significativamente cuando disminuye el recuento.
En estos casos no se considera apropiado inocular las muestras con un adecuado número de
microorganismos para poder llevar a cabo el cálculo de la precisión intermedia, dado que se asume
OAA – Organismo Argentino de Acreditación
que la incertidumbre asociada con los recuentos bajos en placa o en membrana, es similar a la que
se obtiene para recuentos mayores y, además, no refleja ni representa la verdadera condición de
estas muestras.
GUI-LE-05 v2, F.e.V = 10-julio-2019
empíricos, constituye una herramienta útil para demostrar la competencia del laboratorio, pero no
deben ser utilizados para cuantificar el sesgo.
Página 13 de 14
GUÍA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
7. DOCUMENTACIÓN RELACIONADA
• CE-LE-06, Criterios específicos para la evaluación y acreditación de laboratorios que llevan a
cabo ensayos microbiológicos.
GUI-LE-05 v2, F.e.V = 10-julio-2019
Página 14 de 14
GUÍA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS