Determinación de Enzimas

DETERMINACIÓN DE ENZIMAS
Amparo Martínez
Conceptos básicos sobre las enzimas
 Las enzimas son proteínas altamente especializadas en la catálisis de las
reacciones biológicas, es decir, aceleran la velocidad de las reacciones en
las que intervienen.
 Están presentes en todas las reacciones de las rutas metabólicas.
 Características:
 Son extraordinariamente específicas respecto al sustrato (sustancia sobre la
que actúan).
 Tienen gran poder catalítico: pueden aumentar la velocidad de la reacción
miles de veces.
 Se sintetizan en el interior de las células (también están en fluidos
biológicos).
 Canalizan las reacciones biológicas hacia rutas útiles, sin malgasto de
energía.
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CONCEPTOS BÁSICOS
 ¿Qué son los enzimas?
Son proteínas, por lo tanto, se trata de
macromoléculas biológicas.
Son catalizadores, por lo tanto, aceleran la
velocidad de las reacciones químicas en las que
intervienen.
Así pues,
Los enzimas son proteínas con función catalítica
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CATALIZADORES
 Para que tenga lugar una reacción es necesario que los reactivos
adquieran un determinado nivel de energía, energía de activación.
 Un CATALIZADOR es una sustancia que añadida a la reacción disminuye la
energía de activación, con lo que aumenta la velocidad de la reacción.
 Características de un catalizador:
 No forma parte de la ecuación de reacción
 Se precisa en muy poca cantidad
 No se consume en la reacción
 No altera las variables termodinámicas
 Es específico para una determinada reacción
 No puede hacer posible una reacción que no se produciría en su ausencia
4
CINÉTICA QUÍMICA. Catalizadores
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LA REACCIÓN ENZIMÁTICA
QUÍMICA
ENZIMA
REACTIVOS
SUSTRATOS PRODUCTOS
 En las reacciones enzimáticas los reactivos se denominan

sustratos.
 Las enzimas son catalizadores biológicos, es decir actúan sobre
reacciones que tienen lugar en los seres vivos.
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CINÉTICA ENZIMÁTICA. Catalizadores biológicos
Energía
7 Curso de la reacción
LA REACCIÓN ENZIMÁTICA
1. Unión del S al E y formación del complejo ES

2. Transformación del S en P (formación del complejo EP, no representado)
3. Recuperación del E libre y liberación del P
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Nomenclatura y clasificación de las enzimas
Tipos de nomenclatura
Debido al gran número de enzimas, la clasificación y nomenclatura están
sistematizadas.
1. Nombre recomendado:
 Nombre corto y de uso habitual.
 Suele ser el que le asignó el descubridor del enzima.
2. Nombre sistemático. Consta de tres partes:
 el sustrato
 el tipo de reacción
 la terminación “asa”.
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Nomenclatura y clasificación de las enzimas
Tipos de nomenclatura
3. Número de clasificación. Establecido por la Unión Internacional de
Bioquímica (IUB). Consta de cuatro números precedidos por “EC”
(Enzyme Commission) y separados por puntos.
 1º: CLASE a la que pertenece el enzima. Indica el tipo de reacción:
 Clase 1: Oxido-reductasas
 Clase 2: Transferasas
 Clase 3: Hidrolasas
 Clase 4: Liasas
 Clase 5: Isomerasas
 Clase 6: Ligasas
 2º: Subclase dentro de cada clase. Indica el tipo de sustrato.
 3º: Sub-subclase. Indica el tipo de aceptor.
 4º: Número de orden dentro de su clase. Define específicamente la
enzima.
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Ejemplos
Nombre Nombre Nombre de la
recomendado sistemático Enzyme
Commission
Glucoquinasa ATP-glucosa E.C.2.7.1.2
fosfotransferasa
Lactato L-Lactato NAD+ E.C.1.1.1.27
deshidrogenasa Oxidoreductasa
Gamma glutamil Gamma glutamil E.C.2.3.2.2
transferasa transpeptidasa
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CLASIFICACIÓN INTERNACIONAL DE LAS ENZIMAS
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EC1. OXIDO-REDUCTASAS
Ejemplo. LDH o láctico deshidrogenasa
CH3-CHOH-COOH + NAD+CH3-CO-COOH + NADH + H+

Láctico Pirúvico
Ejemplo. GOD o Glucosa Oxidasa
CH2OH-(CHOH)4 -CHO + O2 CH2OH-(CHOH)4 –COOH

Glucosa Glucónico
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E.C.2. TRANSFERASAS
Ejemplo. ALT (alanina aminotransferasa) o GPT (glutámico pirúvico transaminasa)
CH3-CH-COOH + COOH-CH2-CH2-CO-COOH CH3-CO-COOH + COOH-CH2-CH2-CH-COOH

| |
NH2 NH2
Alanina Cetoglutárico Pirúvico Glutámico
Ejemplo. HK o Hexoquinasa
OHCH2-(CHOH)4 –CHO + ATP P-OCH2-(CHOH)4 –CHO + ADP

Glucosa Adenosintrifosfato Glucosa-6-Fosfato Adenosindifosfato
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E.C.3. HIDROLASAS
Ejemplo. Peptidasa
NH2-CH-CO-NH-CH-COOH + H2O NH2-CH-COOH + NH2 -CH-COOH

| | | |
R R R R
Dipéptido Agua Aminoácido Aminoácido
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E.C.4. LIASAS
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E.C.5. ISOMERASAS
Ejemplo. GPI o Glucosa Fosfato Isomerasa
P-OCH2-(CHOH)4 -CHO P-OCH2-(CHOH)3 -CO-CH2OH

Glucosa-6-fosfato Fructosa-6-fosfato
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E.C.6. LIGASAS
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Estructura del enzima y especificidad de sustrato
 Tiene estructura tridimensional con dos zonas de actividad:
 El centro activo: zona a la cual se une el sustrato.
 Le confiere la especificidad respecto al sustrato (centro de fijación) y
respecto de la reacción (centro catalítico).
 El centro alostérico: donde se unen moléculas reguladoras de la
actividad enzimática.
 La especificidad de la enzima por el sustrato puede ser:
 Absoluta: solo para una molécula.
 Relativa: puede unirse a un grupo de moléculas con afinidades
distintas.
 Sustrato natural
 Sustratos análogos
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ZONAS DE ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS
ENZIMA ALOSTÉRICA
CENTRO ACTIVO DE LA ENZIMA
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Cofactores enzimáticos
Algunas enzimas requieren para su funcionalidad, de componentes no
proteicos denominados cofactores.
 La holoenzima es el complejo enzima-cofactor:
 La parte proteica restante tras la separación del cofactor es la apoenzima
(inactiva).
 Los cofactores pueden ser:
 Iones metálicos: dan lugar a las metaloenzimas.
 Moléculas orgánicas. Pueden ser de dos tipos:
 Grupo prostético: unión cofactor-apoenzima fuerte.
 Coenzima: unión cofactor-apoenzima débil.
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Cofactores enzimáticos
 IONES METÁLICOS:
 Ejemplos: Zn2+ en la alcohol deshidrogenasa, Mg2+ en la ATPasa.
 GRUPOS PROSTÉTICOS:
 Ejemplos: grupo hemo de la peroxidasa.
 COENZIMAS:
 Son de naturaleza orgánica.
 Muchos se sintetizan a partir de vitaminas.
 Actúan como aceptores temporales de un fragmento del Sustrato.
 Ejemplos: la tiamina (B1), la riboflavina (B2), la piridoxina (B6), la cobalamina
(B12), la biotina o el ácido nicotínico; dinucleótidos como el NAD o el FAD.
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COFACTORES. IONES INORGÁNICOS
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COFACTORES. COENZIMAS Y GRUPOS PROSTÉTICOS
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COFACTORES. GRUPOS PROSTÉTICOS
GRUPO HEMO
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MODELOS DE UNIÓN ENZIMA - SUSTRATO
Modelo LLAVE – CERRADURA Modelo AJUSTE INDUCIDO
Supone que la estructura del sustrato El centro activo adopta la
y la del centro activo son conformación idónea sólo en
complementarias. presencia del sustrato.
Complejo E-S
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CINÉTICA ENZIMÁTICA
ESTADO DE TRANSICIÓN
• El estado de transición es aquel en
el que las moléculas presentan la
máxima energía.
• En este estado se producen las
interacciones atómicas que
conducen al cambio en los enlaces
químicos que darán lugar al
producto de la reacción.
• En las reacciones enzimáticas la
energía que este estado implica es
menor.
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Recuerda:
MECANISMO DE ACCIÓN ENZIMÁTICA. ETAPAS
1. Reconocimiento.
2.Formación del complejo enzima-
sustrato (E-S).
3.Transformación a complejo de
transición: acción enzimática.
4.Formación del complejo enzima-
producto (E-P).
5.Disociación del complejo E-P. Se
recupera la enzima libre.
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CINÉTICA QUÍMICA. Orden de la reacción.
 La cinética química estudia la velocidad de reacción:
 En una reacción de orden cero, la velocidad de formación del producto es
independiente de la concentración de reactivo: v = k
 En una reacción de primer orden la velocidad de formación de los productos
es directamente proporcional a la concentración del reactivo: v = k [A].
 Una reacción de segundo orden es aquella en la que la velocidad de
formación del producto depende de:
 la concentración de dos reactivos como en una reacción de condensación:
v = k [A] [B]
 del cuadrado de la concentración de un único reactivo (reacción de dimerización):
v = k [A]2
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CINÉTICA ENZIMÁTICA
 La cinética enzimática estudia la velocidad de reacción como:
Cantidad de P que se produce por unidad de tiempo.
Cantidad de S que se consume por unidad de tiempo.
 Factor principal a tener en cuenta en la v de reacción:
concentración de reactantes (sustrato, reactivos).
v = k [reactante]n
• K: constante de velocidad.
• n: nº de moléculas que deben reaccionar para formar los productos.
 Orden de la reacción según el valor de n:
De primer orden (n = 1): v es proporcional a [reactante].
De segundo orden (n = 2): v es proporcional a [reactante]2.
De orden cero (n = 0): v es independiente de [reactante].
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CINÉTICA ENZIMÁTICA. Ecuación de Michaelis-Menten
 El modelo más simple de estudio de la cinética enzimática está en
función de la concentración de un único sustrato [S] y se basa en la
desaparición del sustrato con 3 velocidades de reacción:
 Al estudiar la variación de la v en función de la [sustrato] observaron:

 A baja [sustrato] la v de formación de P es proporcional a la [sustrato] . Orden 1.
 A partir de cierta [sustrato] la v de formación de P va disminuyendo y no depende solo
de la [sustrato] . Orden mixto.
 A altas [sustrato] la v de formación de P se mantiene constante y es independiente de
la [sustrato] . Orden 0.
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• Cuando se representa la v0
(velocidad inicial) frente a la
concentración de sustrato da
lugar a una hipérbola equilátera.
• Se observa que las reacciones
catalizadas por enzimas
muestran el fenómeno de
saturación por el sustrato.
• cuando se alcanzan [S] elevadas, la
velocidad de la reacción se hace
independiente de la [S], y este es el
momento en que todo el enzima
presente está combinado con el
sustrato.
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 La ecuación de Michaelis-Menten es la expresión matemática que representa la v de

reacción de un enzima en función de la [sustrato]:
 Km es una relación de las 3 constantes de v de la reacción enzimática:

𝑘2 + 𝑘3
𝑘𝑚 =
𝑘1
 Los parámetros de la ecuación de Michaelis-Menten, Km y Vmax, dan una idea de
la afinidad del enzima por el sustrato, y de la eficiencia catalítica del enzima,
respectivamente.
 Así, cuanto mayor sea la Km menor será la afinidad, y cuanto mayor la Vmax, mayor
será la eficiencia catalítica.
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Parámetros de la Ecuación de Michaelis-Menten
 Vmax:
 Representa la máxima velocidad a la que el E es capaz de
transformar el S en P.
 Refleja la EFICACIA CATALÍTICA del E.
 km (constante de Michaelis):
 Representa la constante de disociación del complejo ES.
 Se define como la [S] para la cual la velocidad es la mitad de la
Vmax, por tanto tiene unidades de concentración.
 Es indicador de la AFINIDAD del E por el S (según una relación
inversamente proporcional).
http://www.wiley.com/legacy/college/boyer/0470003790/animations/enzyme_inhibition/enzyme_inhibition.htm
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FACTORES QUE INFLUYEN SOBRE LA CINÉTICA ENZIMÁTICA
1. El pH.
La conformación de
las proteínas, (y por
tanto del centro
activo), depende del
pH, en tanto que de
éste depende la carga
de los grupos
ionizables de sus aa. A
pH extremos la E se
desnaturaliza y pierde
su actividad.
El pH óptimo de la E
es aquel en el que su
actividad es máxima, y
es característico de
cada E.
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2. La temperatura.
Las reacciones químicas se
aceleran con la Tª, pero en las
reacciones enzimáticas a partir de
un determinado valor el efecto
desnaturalizante de ésta es
superior al de esta ley general.
La Tª óptima es la Tª a la cual la
actividad de la E es máxima.
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3. La fuerza iónica.
La fuerza iónica del medio, influye de manera que a mayor fuerza iónica
menor actividad enzimática.
4. Concentración de la E.
A mayor [enzima] mayor v de reacción, y, en condiciones de saturación del S,
esta v dependerá exclusivamente de la [enzima].
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INHIBICIÓN ENZIMÁTICA
 Los inhibidores enzimáticos son compuestos que, al unirse a la E, disminuyen o
anulan por completo la actividad de la E.
 TIPOS DE INHIBICIÓN ENZIMÁTICA REVERSIBLE
 Inhibición competitiva. El I se une a la E libre en el mismo centro activo de ésta,
compitiendo con el S por el sitio activo.
 Provocan un aumento de la km para el sustrato pero no modifican la Vmax.
 Poseen estructuras muy similares al S.
 Puede resolverse aumentando la [sustrato].
 Inhibición acompetitiva. El I se une al complejo ES y no a la E libre.
 Provocan una disminución de la km y de la Vmax.
 Inhibición no competitiva. En este tipo de inhibición el I puede unirse tanto a la E
libre como al complejo ES.
 Provocan la disminución de la Vmax sin que varíe la km.
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El I se une al complejo E-S
acompetitiva
competitiva
El I se une al enzima en el mismo

centro activo e impide la unión
del S
no competitiva
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REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
 La regulación del metabolismo se realiza a través de la regulación de las
actividades enzimáticas.
 Niveles de control de la actividad enzimática:
 Control genético
 Control por compartimentación celular
 Control mediante enzimas reguladoras
 Control mediante isoenzimas
 Control a través de zimógenos
 Control hormonal
 Control por retroalimentación
 Control por modificación estructural
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REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.
Control genético y regulación hormonal
 La velocidad de una reacción depende de la cantidad de enzima presente.
Muchas enzimas que catalizan puntos de regulación de una vía
metabólica se hallan en concentraciones muy pequeñas. La velocidad de
síntesis de estas enzimas puede ser aumentada o reprimida mediante la
acción de hormonas sobre los mecanismos que controlan la expresión
génica.
 Por ejemplo, la insulina es una hormona anabólica que induce la síntesis
de glucoquinasa, fosfofructoquinasa, piruvato quinasa y glucógeno
sintetasa mientras que reprime la síntesis de varias enzimas
gluconeogénicas.
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Control por compartimentación celular
 A menudo, las enzimas se encuentran en una parte específica de la célula
donde ejercen su función. La compartimentación significa que las enzimas que
son necesarias para procesos específicos se pueden conservar en los lugares
donde actúan, lo que asegura que encuentran listos sus sustratos, no dañan la
célula, y tienen el microambiente necesario para funcionar bien, además de
permitir la separación de las diferentes rutas metabólicas.
 Como ejemplo, las enzimas digestivas del lisosoma funcionan mejor a un pH
alrededor de 5,0 que se encuentra en el interior ácido del lisosoma, pero no en
el citosol que tiene un pH de unos 7,2. Las enzimas del lisosoma tienen baja
actividad al pH del citosol, lo que podría servir de "garantía" para la célula:
incluso si el lisosoma se rompe y derrama sus enzimas, estas no comenzarán a
digerir la célula porque ya no tendrán el pH adecuado para funcionar.
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Control mediante enzimas reguladoras
 Las enzimas reguladoras son aquellas enzimas
de una ruta metabólica, que tienen la menor
Vmax, condicionando la velocidad del resto de
enzimas de la vía metabólica.
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Control por isoenzimas
 Algunas enzimas presentan estructuras moleculares diferentes, aunque su
función biológica sea semejante. Estas enzimas se denominan isozimas o
isoenzimas.
 Podemos encontrar isozimas distintas en tejidos diferentes (LDH en músculo
esquelético y corazón), en distintos lugares de una misma célula
(malicodeshidrogenasa de mitocondria y citosol), o isozimas distintas según el
momento de la vida del individuo (enzimas de la glicolisis en el feto).
 Las diferencias de estructura se traducen en ligeras diferencias de sus
parámetros cinéticos, Km y Vmax, u otras propiedades como el pH óptimo, que
suelen hacer las isozimas más idóneos para la función que deben desempeñar
en cada tejido, cada compartimento celular o cada momento del desarrollo del
individuo.
45
Determinación específica de isoenzimas
46
Control por zimógenos
 Algunas enzimas no se sintetizan como tales, sino en
forma de moléculas precursoras sin actividad
enzimática (proenzimas o zimógenos). Para
activarse, los zimógenos sufren un ataque hidrolítico
que origina la liberación de uno o varios péptidos. El
resto de la molécula proteica se reorganiza y adopta
la conformación y las propiedades del enzima activo.
 Este mecanismo regulatorio se da en enzimas
digestivas como tripsina, quimotripsina y pepsina y
en enzimas que participan en el proceso de
coagulación de la sangre.
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Control retroactivo (retroalimentación)
 En el proceso de inhibición por retroalimentación, el producto final de una vía
metabólica actúa sobre la enzima clave que regula el ingreso a esa vía para evitar
sobreproducción del producto final.
 Cuando hay poca cantidad del producto, la enzima no se inhibirá y la vía transcurrirá sin trabas
para regenerar sus provisiones.
 Cuando hay demasiado producto acumulado, la enzima se bloqueará para impedir la
producción de producto nuevo hasta que se haya utilizado el existente.
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Control por modificación estructural
 Se trata de un tipo de regulación rápida de la actividad enzimática.
 Tipos:
 Modificación covalente: son enzimas que pueden presentarse en dos formas, una activa y
otra inactiva, que se interconvierten por modificaciones covalentes de su estructura. Las
modificaciones más frecuentes son : fosforilaciones y adenilaciones.
 Unión a cofactores.
 Modificación alostérica: estos enzimas, además del sitio activo tienen otros lugares de unión
(sitio alostérico), al que se unen efectores o modulares, que pueden ser positivos si
estimulan la reacción enzimática o negativos si la inhiben.
 Los enzimas alostéricos suelen tener varias subunidades (idénticas o diferentes). Son oligómeros.
 La unión de un efector al enzima produce un cambio conformacional que altera los parámetros cinéticos.
 Si el efector es el sustrato, recibe el nombre de homotrópico y, si es una molécula diferente, se llama
heterotrópico.
 Los enzimas alostéricos no siguen la cinética de Michaelis-Menten, presentan cinéticas de tipo sigmoide, y
suelen estar situados en los primeros pasos de una ruta metabólica o en las ramificaciones.
49
Regulación alostérica. Formas T y R.
50
Regulación alostérica. Cinética tipo sigmoide.
51
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y DIAGNÓSTICO CLÍNICO
CONCEPTO DE ENZIMOLOGÍA CLÍNICA
 La enzimología clínica es la aplicación del conocimiento de los
enzimas al diagnóstico, tratamiento y pronóstico de la enfermedad.
 Se basa la medida de la actividad de diversas enzimas en suero o
plasma y otros fluidos biológicos, así como investigación de la
distribución de isoenzimas.
 Generalmente no interesa conocer la [enzima] sino la capacidad del E presente
de transformar el sustrato. Actividad enzimática.
 Se lleva a cabo mediante la demostración in vitro de la actividad catalítica
que el E tiene in vivo.
 La actividad se mide mediante la determinación de la cantidad de S
transformado por unidad de tiempo.
 De entre todos los enzimas del metabolismo, los que se analizan de
forma rutinaria en el laboratorio de análisis clínicos, son unos doce.
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UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
 KATAL:
 Un katal es la cantidad de E capaz de transformar un mol de
S en un segundo.
 UI o U:
 Una UI (unidad internacional de actividad enzimática) es la
cantidad de E capaz de transformar un micromol de S en un
minuto.
 EQUIVALENCIA entre katal y UI:
1UI = 1,67 x 10-8 k = 16,7 nk
 La concentración catalítica se expresa en U/L o en katal/L.
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CINÉTICA ENZIMÁTICA. Aplicación a la
determinación de la actividad enzimática
En una curva de velocidad frente a [S] se
observan dos zonas: v
• A baja [S], la velocidad es una función
lineal de la cantidad de S (cinética de
PRIMER ORDEN).
• A elevadas [S], llega un momento en que
la velocidad se hace independiente de la orden cero
cantidad de S (cinética de ORDEN Vmax
CERO).
En las determinaciones de actividad
enzimática se debe trabajar en la parte de
la curva correspondiente al orden cero; en
esta zona la velocidad únicamente es
proporcional a la [E].
En la práctica esto se consigue con: ½ Vmax
• El mantenimiento de la Tª y el pH para 1er orden
que no se afecte el E.
• El empleo de una [S] al menos 10
veces superior a la KM.
KM
[Sustrato]
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LÍMITE DE LINEALIDAD EN LAS DETERMINACIONES
DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
1. Al comienzo del ensayo enzimático hay
un periodo de tiempo de adaptación
de los elementos a las condiciones de
ensayo.
2. Cuando tiene lugar la reacción
enzimática, el P formado aumenta
proporcionalmente con la [E], hasta
que la [E] excede a la cantidad de
sustrato disponible, y se agota todo el
sustrato antes de que finalice la
monitorización de la reacción.
3. En ese momento la reacción deja de ser
lineal y no refleja la actividad
enzimática.
4. Esto es lo que se denomina límite de
linealidad de una determinación de
actividad enzimática.
56
MÉTODOS CINÉTICOS FRENTE A MÉTODOS A PUNTO FINAL
Toda determinación cinética necesita
realizar varias lecturas a tiempos
determinados, (monitorización), que nos
confirman la reacción de orden cero o
velocidad de transformación constante.
• Con un sistema de medición simple o
de punto único, la misma actividad
aparente estaría dada por tres tipos de
reacciones diferentes.
• Es por ese motivo que se adopta un
método cinético, que confirma el
hecho de estar trabajando en la zona
en que el incremento de P formado
por unidad de tiempo es constante, e
informa de la actividad catalítica del
enzima presente en la muestra.
57
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Características de los enzimas a considerar para el uso diagnóstico de la
actividad enzimática:
 La vida media: para ser útil en el diagnóstico debe ser adecuada.
 El rango de normalidad: varía con factores como edad, sexo,
tratamientos, etc.
 La existencia de isoenzimas: si hacemos la determinación de los
distintos isoenzimas obtendremos información adicional.

 La estabilidad de la actividad: la mayoría lo son 2-7 días a 4°C.
58
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Consideraciones para la correcta determinación:
 La muestra debe ser preferentemente suero (ya que evita
interferencias debido a la presencia de anticoagulantes).
 Optimización del sistema reactivo, mediante el establecimiento
de condiciones estandarizadas de
 pH
 Temperatura
 Presencia de cofactores, etc.
 La hemólisis, con liberación de enzimas de los hematíes al
suero, origina falsos valores positivos.
 La lactescencia puede producir lecturas variables de absorción
en los métodos espectrofotométricos.
 Son esenciales
 la exactitud en el cronometraje.
 el empleo de una cristalería limpiada meticulosamente.
59
INTERÉS DE LAS DETERMINACIONES DE ENZIMAS
 No todas las células del organismo contienen la misma dotación enzimática, ni en las mismas
concentraciones, y aunque los enzimas exclusivos de un tejido son raros, la alteración en la concentración
sérica de un determinado enzima orienta hacia los tejidos más probablemente afectados.
 Como consecuencia de circunstancias fisiológicas, patológicas o terapéuticas que afectan a la velocidad
de liberación y distribución del enzima, o a la velocidad de eliminación o catabolismo, la concentración
sérica de los enzimas muestra alteraciones detectables que pueden ser identificadas y relacionadas con
alguna de estas circunstancias.
 Muchos enzimas presentan isoenzimas a menudo características de distintos tejidos.
 Cuando no es suficiente con el examen de un solo enzima se examinan dos o tres enzimas.
 Lo más frecuente es encontrar elevaciones causadas por un aumento de la permeabilidad o daño tisular,
aunque también es posible detectar disminuciones de la concentración sérica de enzimas a causa de
enfermedades crónicas que provocan una disfunción celular importante, envenenamiento por sustancias
inhibidoras de enzimas u otros efectos.
 En algunos casos es muy útil conocer el grado de variación de la concentración catalítica del enzima.
60
SIGNIFICADO DE LAS ENZIMAS PLASMÁTICAS
 Los enzimas son secretados por las células productoras y llegan a la circulación sanguínea, donde permanecen
hasta que son inactivados y/o eliminados.
 El plasma recibe los enzimas de los tejidos y de las células de la sangre. Podemos agrupar los enzimas en dos
grupos:
 Enzimas plasmaespecíficas. Desarrollan su función en el plasma.
 Enzimas no plasmaespecíficas. Actividades enzimáticas fisiológicas que tienen su origen en los procesos de
renovación celular, en la actividad muscular y en el paso de enzimas de los órganos secretores al torrente
circulatorio.
 Cuando los enzimas llegan al torrente circulatorio, existen sistemas encargados de captarlas, metabolizarlas y
eliminarlas, lo cual hace que las enzimas permanezcan en la sangre un determinado periodo de tiempo.
 Así pues, el conocimiento de la procedencia celular de los enzimas, de su distribución y difusión a través de la
sangre, linfa y tejido intersticial, así como de su vía de eliminación, nos ofrecerá datos para estudiar un
fenómeno patológico y su posterior evolución.
61
 Enzimas específicos del plasma:
 Su función fisiológica o actividad enzimática se realiza en el plasma.
 Se encuentran en concentraciones relativamente elevadas en el plasma.
 La alteración más frecuente es la disminución de su actividad debida a una

alteración en la síntesis.
 Con la lesión de su órgano de origen desciende la actividad de estos enzimas en el suero.
 La mayoría se sintetizan en el hígado.
 Son por ejemplo: la lipoproteinlipasa y los enzimas de la coagulación

sanguínea.
62
 Enzimas no específicos del plasma:
 Desarrollan su actividad en las células u órganos de destino.
 Su concentración en el plasma es baja y es debida a la renovación celular.
 La alteración se manifiesta con una elevación de la concentración, que sugiere destrucción celular y
tisular del órgano de origen superior a la tasa de renovación celular.
 Tipos según su origen:
 Enzimas de secreción: realizan su actividad fuera del origen. Ej. Enzimas de las células exocrinas del páncreas, de la próstata,
de la mucosa gástrica o de los huesos.
 Se elevan por aumento patológico de la secreción (tumores, inflamaciones), debido a obstrucción de la secreción o a
trastornos en la metabolización.
 Enzimas asociadas al metabolismo celular: realizan su actividad dentro de la célula. Ej. LDH (citosol), AST (60% en citosol y
40% en mitocondria).
 Cuando existe alguna lesión en la membrana de las células, el contenido citoplasmático y con él los enzimas intracelulares, son
vertidos al medio que los rodea.
 Si se liberan los enzimas mitocondriales la lesión se considera mayor.
63
ENZIMAS PRESENTES EN OTROS LÍQUIDOS BIOLÓGICOS
 Orina: amilasa para el diagnóstico de la pancreatitis aguda.
 Heces: tripsina y quimotripsina para descartar fibrosis quística.
 Líquido cefalorraquídeo: lactato deshidrogenasa (LDH) aumentada
indica tumor cerebral, meningitis bacteriana y trauma cerebral.
 Líquido sinovial: LDH aumentada en artritis agudas.
 Líquido pleural: adenosina desaminasa (ADA) aumentada en tuberculosis
y otras enfermedades infecciosas con respuesta inmune celular.
 Líquido ascítico: amilasa para descartar pancreatitis.
 Semen: fosfatasa ácida como medida de la función prostática.
64
PRINCIPALES ENZIMAS DE INTERÉS CLÍNICO
ENZIMAS DE INTERES CLÍNICO.
LDH (lactato deshidrogenasa). EC 1.1.1.27
 Está ampliamente distribuida por lo que es poco específica.
 Está formada por cinco isoenzimas, cada una con 4 cadenas que combinan 2
subunidades, la H y M:
 LDH-1 (HHHH). En corazón.
 LDH-2 (HHHM). En el SER (sistema retículo endotelial).
 LDH-3 (HHMM). En pulmones y otros tejidos.
 LDH-4 (HMMM). En riñón, placenta y páncreas.
 LDH-5 (MMMM). En músculo esquelético e hígado.
 Valores normales: de 230 a 460 U/L.
 Reacción que cataliza (reducción reversible del piruvato a lactato):
CH3-CHOH-COOH + NAD+ CH3-CO-COOH + NADH + H+
Láctico Pirúvico
66
LDH (lactato deshidrogenasa). EC 1.1.1.27
 Alteraciones de la LDH:
 Aumento en pacientes con Separación electroforética de las isoenzimas de la LDH:
necrosis hepática por
distintas causas.
 Diagnóstico y pronóstico
de enfermedades
neoplásicas.
 Aparecen incrementadas
en gran número de
situaciones.
 Determinación de la actividad
LDH:
 Por métodos cinéticos
(↑ó↓NADH).
 Identificación de isoenzimas
mediante electroforesis.
67
ALT (ALAT) (Alanina aminotransferasa). EC 2.6.1.2
 Antes denominada GPT o SGPT (Glutámico-pirúvico
transaminasa sérica).
 Enzima citosólica, de elevada concentración en el
parénquima hepático.
 Los niveles normales no sobrepasan las 36 UI.
- COO- -
COO-
COO COO +
+ C O H3N CH
H3N CH C O
+ CH2 + CH2
CH3 CH3
CH2 CH2
COO- COO-
Alanina Piruvato
-Cetoglutarato Glutamato
68
ALT (ALAT) (Alanina aminotransferasa). EC 2.6.1.2
Alteraciones de la ALT:
Enzima muy sensible y específica de la enfermedad
hepatocelular.
En las hepatitis víricas, el cociente ALT/AST (cociente de
DeRitis) es mayor de 1, mientras que en otras enfermedades
hepatocelulares es inferior a 1.
Puede aumentar en otras patologías: musculares o
cardiacas.
Determinación de ALT: por métodos cinéticos
(↑ó↓NADH).
69
ENZIMAS DE INTERES CLÍNICO
AST (ASAT) (Aspártico aminotranferasa). EC 2.6.1.1
 Antes denominada GOT o SGOT (Glutámico-oxalacético transaminasa sérica).
 Se encuentra en el citoplasma y en la mitocondria de hepatocitos, y en los músculos.
 Se determina en el diagnóstico del IMA (se valora junto a la CPK y la LDH) y en la
enfermedad hepática.
 Puede aumentar en otras patologías: musculares, hemolíticas etc.
 Los valores normales no sobrepasan las 35 UI.
 Pueden llegar a 700 UI en las hepatitis agudas y superar las 300 UI en las obstrucciones extrahepáticas
(litiasis biliar).
- COO- -
COO-
COO COO +
+ C O H3N CH
H3N CH C O
+ CH2 + CH2
CH2 CH2
CH2 CH2
COO- COO-
COO- COO-
Aspartato -Cetoglutarato Oxalacetato Glutamato

70
AST (ASAT) (Aspártico aminotranferasa). EC 2.6.1.1
 Alteraciones de la AST. Altas concentraciones
pueden indicar:
 Lesiones hepáticas: necrosis de los
hepatocitos.
 Necrosis de miocardio.
 Distrofia muscular.
 Necrosis tisular: embolia o infarto pulmonar.
 Determinación de AST: por métodos cinéticos
(↑ó↓NADH).
71
ALDO (Aldolasa). EC 4.1.2.13
 Interviene en la glucolisis
 En humanos presenta 3 isoenzimas, aldolasa A, B y C.
 Su valor diagnóstico es similar al del la AST o la CK, como indicador de
patologías musculares y hepáticas.
 Los niveles normales no sobrepasan las 60 mUI.
Fructosa-1,6-bisfosfato Dihidroxiacetona-fosfato + Gliceraldehído-3-fosfato

72
CPK (Creatinfosfokinasa) o CK (creatinkinasa). EC 2.7.3.2
 Cataliza la fosforilación de la creatina a partir del ATP.
 Se encuentra predominantemente en el músculo, miocardio y cerebro.
 Presenta tres isoenzimas por la combinación de las subunidades M (muscle,
músculo) y B (brain, cerebro).
 Así la CK-1 está compuesta por dos unidades B (propia del cerebro, que no pasa la
barrera hematoencefalica).
 la CK-2 por una B y otra M (presente en el miocardio).
 la CK-3 por las dos unidades M (fundamentalmente en el músculo esquelético).
 Los valores normales no superan las 170 UI en varones o 135 UI en mujeres.
CH3 CH3 O
ATP ADP
N CH2 COOH N CH2 CO O P O-
HN C HN C
NH2 O-
NH2
Creatina Creatin fosfato
73
Separación electroforética de isoenzimas de la CK
Creatina quinasa total (CK).
Alteraciones de la CK total: aumento de
los valores normales.
Sugiere lesiones en el corazón, el cerebro o
los músculos esqueléticos debidas a infarto
agudo de miocardio, daño muscular,
procedimientos quirúrgicos, insuficiencia
renal, hipo e hipertermia, hipo e
hipertiroidismo, intoxicación alcohólica, etc.
Determinación de la actividad CK total:
Los valores de referencia dependen de la
masa muscular: Varían entre hombres y
mujeres, con la edad, con la raza y la
actividad física.
Separación de isoenzimas por electroforesis.
74
 Creatina quinasa MB (CK-MB). Se encuentra principalmente en el tejido
cardiaco. Representa el 15-20 % de la CK del tejido cardiaco.
 Alteraciones de la CK-MB: aumento de la concentración.
 Se produce en las primeras 24 horas de una lesión miocárdica.
 Determinación de CK-MB. Dos variantes de ensayos disponibles:
 CK-MB masa: técnicas enzimoinmunológicas con anticuerpos monoclonales
específicos. Se evitan interferencias por hemolisis. Se expresa en ng/mL.
 Actividad de CK-MB: métodos de inmunoinhibición de CK-M.
 Según la relación CK-MB/CK:
 4-5 %: evidencia de daño muscular.
 > 20 %: presencia de macro-CK-BB resistente a la inhibición.
75
LIPASA EC 3.1.1.3
 Las lipasas son enzimas que hidrolizan los triglicéridos (ésteres del glicerol
con ácidos grasos).
 La de mayor valor diagnóstico es la lipasa pancreática.
 La causa más frecuente de su elevación, hasta diez veces los valores
normales, es la pancreatitis aguda.
 Su ascenso es paralelo al de la amilasa aunque al mantenerse elevada
más tiempo, permite el diagnóstico en etapas más tardías de la
enfermedad.
76
LIPASA EC 3.1.1.3
Alteraciones de la lipasa:
Aumento: mayor especificidad que la amilasa para el diagnóstico de
pancreatitis aguda.
Disminución: enfermedades pancreáticas crónicas (fibrosis quística).
Determinación de la lipasa: basada en la hidrólisis de triglicéridos.
Métodos turbidimétricos: el aclaramiento de la emulsión de triglicéridos
se mide por la disminución de la turbidez o de la luz dispersada.
Métodos espectrofotométricos: la hidrólisis da lugar a un compuesto
cuya velocidad de formación es proporcional a la concentración catalítica
de la lipasa, siendo su formación medida espectrofotométricamente.
77
alfa-Amilasa. EC 3.2.1.1
 Es una enzima hidrolítica producida por las glándulas salivales y el
páncreas (isoenzimas pancreática y salival).
 Cataliza la hidrólisis de los enlaces alfa 1→4 entre las glucosas del
glucógeno y el almidón.
 Es un marcador muy importante de afecciones pancreáticas agudas
(pancreatitis).
 Puede incluso aparecer en la orina, debido a su bajo peso molecular
(amilasuria).
78
alfa-Amilasa. EC 3.2.1.1
Alteraciones de la α-amilasa: elevación de los valores normales.
En la pancreatitis aguda la α-amilasa se eleva al comienzo del proceso:
valores normales no excluyen el diagnóstico.
Otras patologías que lo aumentan: cáncer de páncreas, cirrosis, etc.
Determinación de la actividad α-amilasa. Más de 200 métodos
analíticos que se agrupan en:
Ensayos amiloclásticos: monitorización del almidón como sustrato y valoración
de su disminución.
Ensayos sacarogénicos: utiliza oligosacáridos como sustrato seguido
de la monitorización de la producción de glucosa.
Ensayos cromogénicos: sustratos con cromógeno, medida del incremento
de absorbancia.
79
ALP o FA (fosfatasa alcalina) EC 3.1.3.1
 Hidroliza con baja especificidad fosfomonoésteres, a un pH alto o alcalino (de ahí el
nombre).
 Se encuentra en varios tejidos (diferentes isoenzimas), aunque sus mayores
concentraciones están en hígado (isoenzima FA1) y hueso (FA2).
 Se utiliza en el diagnóstico de enfermedades hepáticas y óseas.
 Aumenta mucho en la enfermedad biliar y en la cirrosis así como en los tumores
metastásicos en hígado.
 Se asocia con el crecimiento óseo por lo que aparece alta en edades de desarrollo, tumores
osteoblásticos, hiperparatiroidismo.
 Los niveles normales no superan las 120 UI en el adulto.
O O
R O P O- + H2O R OH + HO P O-
O- O-
80
ALP o FA (fosfatasa alcalina) EC 3.1.3.1
 Determinación de la actividad
de la FA:
 Mediante métodos cinéticos:
 La hidrólisis del 4-nitrofenil-
fosfato libera 4-nitrofenol.
 El 4-nitrofenol absorbe luz
entre 400 y 420 nm.
 Discriminación de los distintos
isoenzimas por métodos
electroforéticos.
81
GGT o -GT (gamma-glutamil transferasa) EC 2.3.2.2
 La GGT cataliza la transferencia de una porción de gamma-glutamil de
glutatión a un aceptor que puede ser un aminoácido, un péptido o una
molécula agua.
 Participa en la transferencia de aminoácidos y péptidos a través de la
membrana celular.
 Se encuentra en hígado y tracto biliar.
 Por otra parte es útil en la detección y seguimiento del alcoholismo crónico
 Es una enzima inducible, y su concentración en suero aumenta con
xenobióticos (alcohol, drogas, etc.)
 Los niveles normales no superan las 38 UI.
82
GGT o -GT (gamma-glutamil transferasa) EC 2.3.2.2
 Alteraciones de la γ-GT.
 Se observan niveles elevados en:
 Colestasis ( útil para excluir el origen óseo en el aumento de FA). No es
tan sensible para detectar la obstrucción biliar como la fosfatasa
alcalina, pero es más específica, ya que no se eleva por enfermedad
ósea.
 Personas con medicación anticonvulsionante y consumidores
habituales de alcohol.
 Determinación de la actividad γ-GT: métodos cinéticos.
 La cantidad de 5-amino-2-nitrobenzoato liberada es proporcional a la
actividad de la γ-GT y se mide fotométricamente.
83
LAP (Leucina aminopeptidasa) EC 3.4.11.1
 Las aminopeptidasas son enzimas proteolíticas, (peptidasas), que degradan el
residuo N terminal de los oligopéptidos, produciendo péptidos más pequeños y
aminoácidos libres. Las leucina aminopeptidasas (LAP) eliminan con más
eficacia el aa Leu.
 Se utiliza en el diagnóstico de enfermedades hepáticas, sobre todo para el
diagnóstico diferencial de los niveles altos de fosfatasa alcalina.
84
5’NU (5’-NUCLEOTIDASA) EC 3.1.3.5
 Es una fosfomonoesterasa alcalina que hidroliza específicamente los
nucleótidos con un radical fosfato unido en la posición 5' de pentosas.
 Se eleva en pacientes con hepatopatías, sobre todo por colestasis.
 Se emplea de forma similar a la GGT.
85
5’NU (5’-NUCLEOTIDASA) EC 3.1.3.5
 La determinación de 5’ nucleotidasa tiene poca
especificidad diagnóstica, pero aumenta la
especificidad diagnóstica de la fosfatasa alcalina.
 Un aumento de fosfatasa alcalina acompañado de
aumento de 5’ nucleotidasa y Leucinaminopeptidasa
indica alteración hepática.
86
ACP (fosfatasa ácida). EC 3.1.3.2
 Hidroliza monoesteres de fosfato en medio ácido.
 Se encuentra en varios tejidos aunque sus niveles más altos se
encuentran en la próstata.
 La isoenzima 1, fosfatasa ácida prostática (PAP) que es sensible a la acción del
tartrato (hecho que se utiliza en el diagnóstico), se utiliza para diagnosticar el
carcinoma prostático.
 Los valores normales no superan las 0,6 UI.
O O
R O P O- + H2O R OH + HO P O-
O- O-
87
pseudoCOLINESTERASA EC 3.1.1.8
 Enzima de síntesis hepática que hidroliza ésteres de colina.
 Habitualmente se determina la llamada pseudocolinesterasa que se halla en
el suero (la colinesterasa “verdadera” está en los hematíes y en el tejido
nervioso).
 Es útil en el estudio preoperatorio:
 Interviene en el metabolismo de la succinilcolina (relajante muscular), pero algunas
variantes no lo hacen (disminución de la actividad), dando complicaciones.
 Los valores normales se sitúan entre 8 y 18 UI.
88
pseudoCOLINESTERASA EC 3.1.1.8
 Alteraciones de la pseudocolinesterasa:
 Se utiliza para valorar el estado frente a la anestesia, ya que
la deficiencia de esta enzima lleva a aumentar y prolongar
sus efectos.
 La deficiencia de colintesterasa puede ser genética o
adquirida, frecuentemente por intoxicación con pesticidas.
 Determinación de la actividad:
 Determinación con/sin inhibidor competitivo para
determinar la fracción de colinesterasa normal y anormal.
89
PATRONES DE ALTERACIÓN ENZIMÁTICA
Enfermedad hepática
 Presenta valor diagnóstico la elevación de AST (GOT),
ALT (GPT), ALP (fosfatasa alcalina), GGT
(gammaglutamiltransferasa) e isoenzimas LDH-4 y LDH-5
de LDH.
 En las hepatitis víricas agudas suben las transaminasas
(en las crónicas y cirrosis en menor grado).
 En las obstrucciones hepatobiliares suben la ALP y la
GGT.
90
Infarto agudo de miocardio (IMA o IAM)
 Se produce un aumento rápido (6 horas) de
CK, sobre todo de la isoenzima CK-2 (MB).
 La AST (GOT) también se eleva pronto pero
igual que la CK desciende rápidamente.
 Sin embargo, la LDH es la última en elevarse
pero tarda hasta 2 semanas en normalizarse
(sube a expensas de la LDH-1).
91
Enfermedades musculares
 En las distrofias musculares aumenta la CK.
 En el daño muscular, además de la CK (a
expensas de la CK-3) aumentan también la AST
(GOT) y la LDH (sobre todo LDH-4 y LDH-5).
92
Enfermedades óseas
 La principal enzima en el diagnóstico de las
enfermedades óseas es la ALP, que participa en la
osificación del cartílago. Indica, por tanto, procesos
en que hay formación de hueso incluyendo los
fisiológicos (edades de crecimiento).
 La ACP se encuentra elevada en alguna patología
ósea como en la enfermedad de Paget.
93
Enfermedades hematológicas
En la anemia megaloblástica la LDH
sérica se encuentra muy elevada
(sobre todo la LDH-1).
94
RUTAS METABÓLICAS
95

Determinación de Enzimas

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DETERMINACIÓN DE ENZIMAS

 En las reacciones enzimáticas los reactivos se denominan

1. Unión del S al E y formación del complejo ES

CH3-CHOH-COOH + NAD+CH3-CO-COOH + NADH + H+

Ejemplo. GOD o Glucosa Oxidasa

CH2OH-(CHOH)4 -CHO + O2 CH2OH-(CHOH)4 –COOH

CH3-CH-COOH + COOH-CH2-CH2-CO-COOH CH3-CO-COOH + COOH-CH2-CH2-CH-COOH

OHCH2-(CHOH)4 –CHO + ATP P-OCH2-(CHOH)4 –CHO + ADP

NH2-CH-CO-NH-CH-COOH + H2O NH2-CH-COOH + NH2 -CH-COOH

Dipéptido Agua Aminoácido Aminoácido

Ejemplo. GPI o Glucosa Fosfato Isomerasa

P-OCH2-(CHOH)4 -CHO P-OCH2-(CHOH)3 -CO-CH2OH

 Al estudiar la variación de la v en función de la [sustrato] observaron:

 La ecuación de Michaelis-Menten es la expresión matemática que representa la v de

 Km es una relación de las 3 constantes de v de la reacción enzimática:

El I se une al complejo E-S

El I se une al enzima en el mismo

 El rango de normalidad: varía con factores como edad, sexo,

distintos isoenzimas obtendremos información adicional.

 La alteración más frecuente es la disminución de su actividad debida a una

 La mayoría se sintetizan en el hígado.

 Son por ejemplo: la lipoproteinlipasa y los enzimas de la coagulación

Aspartato -Cetoglutarato Oxalacetato Glutamato

Fructosa-1,6-bisfosfato Dihidroxiacetona-fosfato + Gliceraldehído-3-fosfato

Creatina Creatin fosfato

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