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Tomo 3. Cap 40. Fosforilación oxidativa

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del libro de bioquimica medica tomo 3, la fosforilación oxidativa,espero les sirva
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La fosforilación oxidativa es la síntesis de ATP acoplada al transporte de electrones.. v se lleva a cabo en la membrana interna de la mitocondria.

El transuorte de " electrones por los complejos de la cadena respiratoria culmina: con la producción de agua, con la formación de un gradiente de protones a través de la membrana interna de la mitocondria y con la síntesis de ATP. Éste se forma a partir del ADP y fosfato inorgánico (Pi), al utilizarse la energía contenida en ese gradiente de protones. En el transporte electrónico intervienen los 4 complejos que sedescribieron en el capítulo anterior; el quinto complejo, también presente en la membrana interna de la mitocondria, el de la ATPsintasa, es el responsable de la fosforilación oxidativa. En este capítulo se describirá la estructura y función de la ATP sintasa, y su mecanismo de acción. También se tratará de la producción de ATPque se obtiene de la oxidación completa de la glucosa, y por último de la regulación de la respiración celular.

Teoría quimioosmótica
En 1961, Peter Mitchell postula su teoría quimioosmótica de la fosforilación oxidativa. Este investigador planteó que el transporte electrónico a lo largo de la cadena resuiratoria formaba un eradiente electroouímico entre ambos lados de la membrana interna, al ser bombeados los protones a través de la membrana interna de la mitocondria, desde la matriz mitocondrial hasta el exterior. Esta concentración desigual de protones, generada entre ambos lados de una membrana impermeable a ellos, unido al potencial de esa membrana, resulta en una fuerza protón-motriz. Esta fuerza sería la utilizada en la síntesis del ATP, y al llevarse a cabo dicha formación se disiparía el gradiente. La llamada entonces ATPasa reversible mitocondrial sería la encargada de llevar a cabo este proceso. ! Muchos de los aspectos planteados por í Mitchellya se han demostrado, otros quedan aún sin resolver. Se conocen actualmente ciertas características de la membrana y de los transportadores que se encuentran en ella; también se conoce acerca de la composición del complejo enzimático que interviene en el proceso de la fosforilación oxidativa. Aunque se sabe que el proceso que acopla el transporte de electrones y la fosforilación oxidativa, es el gradiente de protones, y que éstesedisipa cuando se forma ATP, no se tiene aún una explicación completa de su mecanismo molecular.

-

Localización de los sitios fosforilantes
Uua vez conocidos los 4 coniplcjos dc la cadena respiratoria, se quiso conocer cuáles eran los sitios donde ocurría la fosforilaciún oxidativa y la rxplicación del número de ATPformados de acuerdo con el domador de electrouesa la cadena respiratoria. Varios mltodos fueron einpleados para lonilizarlos. Se utilizaron inliibidores, se realizó el cálculo de la energía que se liberaba al ser transportados los electrones en cada uno de los complejos, se aislaron e incorporaron cada uno de ellos a vesículas lipídicas, y se incubaron dichas vesículas con sus donantes y aceptores de electrones particulares. Con todosestos procedimientos todo parecía indicar que eran 3 los sitios donde se lleva a cabo la fosforilación oxidativa. Se describirá, como ejemplo, unade las formas con las cuales se lograron datos que reafirmaron la localización de los sitios de fosforilación oxidativa. Uno de los métodos que corroboran que eran 3 sitios donde ocurría la fosforilaciónoxidativa, era el del cálculo de la energía libre en relación con la diferencia de potencial de reducción involucrado en cada unode estos 3complejos. Aplicando la fórmula utilizada en elcapítulo anterior:

donde AE representa la diferenciadel potencial de reducción entre los 2 componentes redox -inicialesy final- que participan en cada complejo dela cadena transportadora de electrones. Como podemos ver en la figura 40.4,se puede calcular la energía libre asociada a cada unode estos complejos. Sise requieren al menos 73k d para la síntesis de un molde ATP,vemos como esto se cumple sólo en los complejos 1,111y IV.

Acontinuación se describirá la estructura y composición del complejo V ó ATP sintetasa, cuya función es la de lafosforilación oxidativa. Luego se tratará acerca de la cuantificación, localización y mecanismo de la fosforilación oxidativa.

Complejo V ó ATP sintasa

Situada en la membrana interna de la mitocondria, se han asociado a este comple.jo V 2 funciones,amhas debidas a l a actividad reversible de la enzima: 1.La síntesis de ATP, acoplada a la energía que hrinda el gradiente de protones, y que se formaduranteel transportede electrones. 2. La hidrólisis de ATP, al acoplarse a la traslocación de protones de la matriz al citosol, con el paso de los cationes como el K', Na*, Ca". Este capítulo trata solamente de la primera.

Estnidura del complejo V: la ATP sintasa
La descripciún quese brinda a continuación es la del compkjo V mitocondriai,& difiere algo del de procariotes y de algunas otros organismos unicelulares inferiores. En fotografías realizadas en el niicroscopio electrónico, este complejo aparece como pequeñitas esferas o hotones que se proyectan por el lado interno de la membrana interna mitocondrial, hacia el lado de la matriz. h a s fueron Ilamadas en un principio las partículas elementalcs. Kvalmente ellas representan sólo una parte de la ATPsintasa. El complejo V lo forman 3 porciones: la cabeza, la hase y el cuello (Figs. 40.1 y 40.2). La caheza, actnalmeute conocida como suhunidad F , , se corresponde con las proyecciones antes mencionadas. El diámetro de las esferas es de 8,s-Y nm. En ellas se localiza la actividad de síntesis de ATP. Están unidas por unos tallos de 5 x 3 iiin, el cuello, a la memhrana, donde se encuentra la tercera p o r c i h que sc corresponde con la hase. Esta iiltima es la suhunidad F,, de 6 x 1 2 nm, tambifn conocida como el canal de protones, por donde kstos pasan al disiparse el gradiente durante el mecanismo de forniación dcl ATP.

9 nm

4
I

inm
6 iim

La F, contiene5 clases de proteínas: dfa, beta,gamma, delta y épsilon. La relación mediante la quese unen es de alfa,heta,gamma,delta,épsilon,. 3 subunidades alfa Las se relacionan estrechamente entre si; también tienen una relación estrecha con las beta y se alternan. Las garnma están en contacto tanto con las alfa como con las beta, pues su segmento C terminal seinsinúa en el canal central qnedejan lasalfa y la? beta, y por el lado contrario se une al cuello. La OSCP (del cuello), ver en el próximo epígrafe, se relaciona tanto con las partículas aifa, como con las heta. Otros detalles de estas proteinas pueden verse en la tabla.
%bis.

Peso molecular y función de las proteínas de la partícula 17, Peso molecnlar Función Relación

Partícula

12 iiin

50-52

Centroactivo UnelaF, con la F,,

Se le unen ADP y ATP

Gamma

31-32

-

Cuando las F, son desprendidas de las membranas, por métodos experimentales, la membrana interna se vuelve permeahle a los protones, al parecer por la apertura de los canales formados por los proteolipidos en la F,,. Este canal se sella si se reunen la F,,con la F,.

El tallo o cuello, ausente del complejo V en procariotes y cloroplastos, pero presenteen el complejodelas mitocondrias,estáformado por 2 proteinas: la F,, que es indispensable para la unión de la F, con la F,,,y la llamada OSCP -01igumicinsensible conferring protein, es decir, proteina que le confiere a este complejo V la sensibilidad a !a o!igomirina, Sin enihargo,!a o!igomicina no se ?inea ésta,sino a una proteina de la base.

SubunidadF, o base
La base del complejo V, o subunidad F,,,unida a la membrana interna, contiene numerosas proteínas hidrofóbicas, proteolípidos, y es la traslocadora de protones o canal de protones. La forman 4 proteínas, una de ellas, la proteina de unión para la DCCD (diciclohexilcarhodiimida), está repetida 6 veces y se organiza alrededor de la base del cuello en forma de «cuñ'as de un pastel», pero en el centro deja un canal que secontinúa con el del cuello y donde se encuentran los residuos del aminoácido,ácido glutámico.

Cociente Pi/O
La reacción de formación de ATPes la siguiente:

También se utilizaron inhibidores para localizar los sitiosfosforilantes. Utilizando al NADH como donador de electrones, si se inhibe la citocromo oxidasa con C N y se aporta suficiente citncromo c oxidado, se ohtiene un Pi/O = 2. En este caso se ha impedido, con el inhibidor, que se puedan transportar electrones por el complejo IV. Asise compmhú quese formaba un A'I'Pmenos, y se crryódemostrar qiie en el complejo IV ocurre un acoplaniiento entre el transporte de electrones y la fosforilación oxidativa. Utilizando otros inhibidores se corroboró el acoplamiento de la fosforilación con el transporte electrónico en los otros comple,jos ya mencionados. Con experimentos y datos senie.jantes se localizó el segundo sitio entre la CoQ y elcitocromo c, y el prinlero entre el NADH y la CoQ. Estos resultados mostraron que los sitios íUsforilantes sc correspondían con los complejos 1,111p lV. Algunos investigadores dudaron en cuanto a si se forniaba Al'Pdirectaiiiente en cada uno de estos complejos, o si se iitilizaba la energía del gradiente total, formado por los 3 coniple,jos,en la forinación de los 3 ATP. Segun datos obtenidos más recientemente, la fosforilaciún oxidutiva no está localizada ensitios específicos en cadauno de los complejos mencionados, sino que entre los 3 complejos se genera la fuerza protún motriz que hace posible la síntesis de ATP.

Economía y eficiencia
EIIel capítulo 38del ciclo de Krebs Iiabíaiiios visto que eii él se formaliaii 3 NADII. un FADH, y uii GTP. Como por cada NADH oxidado en la cadena reqiir~toriase fonnan ~ ~ 2 3 A T P la fosforilaciún oxidativa, y porcada FADH, se forman 15, el total de ATP f0rniados apartirde ladegradación de un m d de acetil-~oAes 10 molde ATP. Pero de en la formación de &tos nose consume toda la energía qiie está contenida en un mol de acetil-COA.Una parte de esa energía se pierde como calor. Se ha calculado experimentalmente que la energía que se libera por niol de ATP Iiidrolizado es de 7 3 kcal, y la misma cuantía se eniplearía en su formación, pero como en la niitocondria la relación [ATP]I[ADPI[Pil es alta, es posible que se rrquieran haita 12 kcal.mol- en su síntesis. La oxidacióii de un NADH en la cadena transportadora de elechonesnos brinda -52,6 k d n ~ o lConio por cada NADH sefoniian 2 3 ATP,se conxr. varían 18,75 kcal.inol. La eficiencia en la conservaeiún dela energía será del 35,6 %.

Teoría que explica la fosforüación oxidativa
La teoría postulada por PeterMitchell como ya se niencion6,esla más aceptada enlaactualidad debido alos múltiplesdatos obtenidos a su favor. Este investigador señaló determinadas premisas que debían estar presentes y cnmplirse, para que se llevara a cabo la fosforilación oxidativasegún su hipótesis. Estas premisas son las siguientes:
l. Alser transportados loselectrones por los complejos dela cadena respiratoria, se creaun gradiente de protones. 2. La membrana interna dela mitocondria es impermeable a los protones, puesto que de lo contrario no se forma el gradiente. 3. Los transportadores de electrones o complejos están organizados en la membrana de forma vectorialde modo quelos protones son extraídos de la matriz hacia el espacio intermembranoso y asíse genera un gradiente de ellos. 4. La ATPasatamlnén estásituada de forma vectorial enla membrana y libera el ATP sintetizado por ella hacia lamatriz, y se pone en contactoeon los protones por el espacio intermembranoso.

La energía que se deriva de este gradiente protónico es la utilizada por el complejo de la ATPsintasapara formar el ATPen lamatrizinitocondrial.

Evidencias que apoyan la teoría quimioosmótica
De los estudios realizados acerca de la respiración celular se han ohtenido las conclusiones siguientes:

1.Con el transporte de electrones efectivamentese genera un gradiente de protones a través de la meiiil>ranainterna de la mitocondria. Se ha medido el pH en aiiilios lados lados de ella y se ha obtenido una diferencia en el valor del pH entreanil~os de la membranas de 1,4 unidades. 2. Si se aplica un gradiente de pA entre ambos ladosde la membrana interna de la initocoiidria, aun sin existir transporte deelectroucs,se forma ATP. Por e,jeiiiplo.si se incorpora el complejo V a vesículas lipídicas que se encuentran suspendidas en un bañoa un pH aproxiniadamente neutro. y de forma brusca se le cambia el pH del medio donde se hallan suspendidas las partículas, sc crea un gradiente ino~iiciitáneo entre ambos lados de la membrana, lo que provoca la síntesis de AI'P. 3. Con las enzimas solubles no se forma ,Vil', sólo ocnrre esto en compartiiiientos cerrados o vesículas, lo que nos confirma la necesidad de qne se foruie el gradiente y qnela membrana sea impermeable a los protones. 4. Lssuitanciasque timsportan protonesa trav&de la membrana, di.~ipan &~acIiente a el y desacoplanlas oxidadones de la fosforilación. A estas sustancias se las denomina desacopladores. S. La cadena transportadora de electrones y la AI'P sintasa están orientadas vectorialnieiite en la nienibrana iuterna mitoeondrial. Más adelante se describirá cónio puede conocerse la localizacibn vectorial de una inacromolécnla en una membrma

Asimetría de la membrana interna mitocondrial
Según la teoría qnimioosmótica son varios los procesos involucrados en la cadena respiratoria que deben cumplir con la característica de ser vectoriales. En primer Ingar, tenemos al sistema involncrado en el bombeo de protones, cuyos mecauismos propuestos se describieron en el capítulo 39. En segundo lugar, tenemos al sistema de la ATP sintasa o complejo V, en el que se realiza lasíntesis del ATP, pero siempre hacia la matriz. Existen técnicas de investigacióii que pueden demostrar la existencia o no de proteínas que se encuentran orientadas de forma específica en las membranas. Con procediniientos de laboratorio se pneden formar vesícnlas a partir de la membrana interna dela mitocondria qnea veces contengan ensu cara externa la misma cara que en la mitocondria intacta, pero que otras vecessea sil cara interna habitual la que esté hacia el exterior (Fig. 40.5). Cuando se usa la técnica de lasonicación -fragmentación delasmembranascon ultrasonido-se forman vesícnlas a partir delasmembranas rotas que contienen las partículas F, hacia el exterior. Esto hace que sean muy útiles para experimentos en los que se quiere tener lacara de la matriz de la membrana interna aseqnible a sustratos, inhibidores o marcadores. Si a estas mismas vesícnlas se les somete a una agitación mecánica, se pierden estas partículas, con lo cual se pierde la actividad de fosforilación oxidativa, pero no la del transporte electrónico. Si se reúnen las vesículas con las partículas recuperan la actividad perdida. Debcinos recordar que esta membrana es impermeable a iones, y mucho más a por moléculas mayores como el ATP, ADP, otros cofactores y ~woteínas, mencionar

Fig. 10.5. Ol>tcnci<inde vesieulas de la itieiiiIhmna interna niitocondrial. a) I'oi. iigitaciún iiierinica. b) I'or sonicación.

algunas. Los investigadores han usado ambos tipos de vesículas con el fin de unir un dcterniinadocompucsto a las proteínas que presenten alguna porción de ella^ expuestaa la superíicieexterna de la rrsícula pala marcarla. Si Iiicgodeniarcadas,seextraeu las proteínas y se purifican,se puede conocer su loialiaacióii en esa membrana. Por ejeniplo, una proteína X se marca con un reactivo utilizandoainbm tipos devesínilas, esto sugiere que es uiia proteína trausmembranal. Si sólo se niarca con el reactivo cuandose utiliza una sola de las vesículas,esto sugierequedicha proteína está expuesta U la snperficie y que está localizada en la cara que presentaha la vesícula al exterior (Fig. 40.6).

Fig. 40.6. Marcaje de lar proteinas de las membranas. Si una vesícula rnemhranosa cerrada contiene pruteinas, y se quiere conocer si Gstas son transmnnbrsnalcs o no, se uti. liza un marcador proteínico impermeable a la vericula. Lucgn de marcadas, las iesíeulas se lavan para eliminar el marcador lihrc y lar proteínas sc purWran. 1% quc qucd~n marcadas scrán las que presentaban nlgún área de su superlicic en contacto con la superiieic cxterna de In vesíruta.

Se han usado varios tipos de marcadores, entre ellos encontramos a los antieuerpos a proteínas específicas. Una condición que deben cumplir los reactivos marcadores empleados es queno pueden atravesar la membrana, y asísólo pueden iraccionar con la cara cxterna; estacondición lacumplen los anticuerpos.Si ésta queda niarcada con los anticuerpos específicos que fueron utilizados, por uno de sus lados solamente, querrá decir quees una proteína que está expuesta a esa superficie y queseencuentra en la cara de la membrana en la cual se adicionó el anticuerpo. De tale. investigaciones se ha demostrado que todos los complejos en los que se conserva la energía,atraviesan hmembrana, presentando una porción de ellos a amhos lados de esta última.

Mecanismo de la fosforüación oxidativa
Una vezdescritoloconocido acerca dela estructura del coniplejo Vó ATPsiutasa, y de las evidencias ohtenidas del estudio de este proceso, pudiéramos intentar describir, a grandes rasgos,cómo ocurm este proceso. Consideremos entonces que inmersw en la membrana interna de la mitocondria se Iiallan los coinple,jos que integran la cadena respiratoria (Fig. 40.7). El transporte electrónico se está llevando a rabo en los complejos del 1 al IV, y a la vez está ocurriendo el bonibeo de protones de la matriz hacia el espacio intermeinbrauoso. Además dc tener cantidades suficientes desustratos ouidables que aporten los electrones a la cadena respiratoria y O,, también estarán presentes eiilamatnz,concentracioncs adecuadas de AUPy Pi qn6«culran el centroactivo dela ATPsintasa. Dehido al transporte de protoncs se crea la l'uerra protón niotriz necesaria, y cuando el gradiente electroquímico alcanm uiia fuerza p r o t h motriz de 0,ZZ V, el flujo de protones abre el canal del complcji) V y se introduce en él. Esto produce la encrgizacióii de este complejo. El flu,jo de 3H4,a través de éste, disiparía el gradiente y uno dc los H'sería el responsable de liberar al ATP formado en el centro activo.

Cofactores reducidos

3

Procesos catabólicos Ciclo de Krebs

H'

1, 1 1 y IV: trcs de los coniplejos de la cadena transpoitadora de electrones: V : ATP 1 sintetasa: T, : traslocador ATP-ADP; T1: transportlidor de foihto.

Relación entre la fuerza protón motriz y la síntesis reversible de ATP
Laenergía que genera el gradientede protones liasido cuantificada por la Iormiila conocida:

La AP, en este caso, es la diferencia de potencial entre ambos lados de la membrana generada por el gradiente electroquímico, también llamada fuerza protón motriz; la componen 2 tipos de fuerzas que se generan a través de la membrana: una fuerza derivada del gradiente eléctrico (Av) y la otra derivada del gradiente químico de protones (ApH). Fuena protón motriz = A y - Z (ApH) 1 1ApH,diferencia de pH entre ambos lados dela membrana, llega a alcanzar 1,4 5 de unidadcs, y el A~,difcrencia potencial cntre ambos lados de la membrana, llega a ser dc 0,14 V. La Z de la fórniula constituye una constante y es de 0,06 V a 37 "C. Efechiaiidola fórmula Iiallaremos un valor de fuena protón motriz dc 0J2V para 1mol de protones, lo que aplicado a la priniera lórmnla da una energía libre equivalente a -5,16 kca .mal.'. Comoporcadamol de ATPformadose translocan3 molesde protones, se produce suficiente energía para la producción de nn ATP.

Algunas características del centro activo
La modificación covalente de la F, con inhibidores análogos al ATP, indican que la subunidad beta es la eatalítica, aunque existen datos que parecen señalar que el centro activo se encuentra formado por ambas subunidades, la alfa y la beta. Como grupos catalíticos parecen intervenir 2 tirosinas, una arginina, una lisina y un carbodo.

Mecanismo íntimo de la catálisis del complejo V
En primer lugar, el nucleótido debe estar unido al ion de magnesio (Mg") para poderse fijar al sitio catalítico. La fijación de cada uno de los 3 nucleótidos en cada

+H

H'

+H

H*
+H

H+

-, Pi + + +++
;4-.

P'

.

,...,, .i;~
~

v
'

~

~

~

~~~

~

~

+++

l,.iC,

,,,, ,,

Icaet,ircs iiiiplic;idl,s la t<,rf'orileci6norid;iiirz. En el con>plc,jo \: a partir dcl I'i y r l r l i D P . se fOma cl I'P.

una de las 3 subunidades, se lleva acahocon una cooperatividad positiva. La tijacibn del sustrato en una de las subunidades favorece la unión en laseguuda, y la unibn en la tercera es aún niás fácil.

interaccionei de las subunidadesdurante el mecanismo de síntesis del ATP Las 3 subunidades beta tienen interacciones cooperativas. Las 3 se encuentran en estadosconformacionales y hincionales distintos y sealterna un estado con el otro, de forma cíclica. La síntesis del ATPpuededividirse en3 etapas.En la primerasefijaríau al centro activo el Pi y el ADP-Mg". En esta etapa la unibn delos sustratos a la enzimaes débil y puede realizarse un intercambio de ellos con otros del medio. La segunda etapa implica la síntesis del ATP, y en a t a etapa. también reversible, tanto sustratos como productos etán fuertemente unidos a la enzima y ninguno de ellai puede intercambiarie con otros del medio. El paso de los protones a través del canal impulsalalihenicibn del A'I'P. En la tercera etapa, ya formado el ATP, vuelve a ser débil la unión con la enzima, y se puede intercambiar cou ATPdel medio. Estas mismas etapas, en sentido inverso, ocurrirían en la hidrólisis del ATP, con lo que se energizarian las membranas y se podría utilizar esta energía en cl transporte de iones (Ca", por ejemplo). Los investigadores hansugerido la existencia de3 conformaciones diferentes en las cahezasdeeste coniplejo. Estas 3conformaciones se alternarían regularmente durante la actividad de la sintetasa. En cada subunidad beta se alternanan las siguientesconfnrniaciones: la L, la T y la O. ATP

La unión de ADP y Pi en una subunidad L provocaría la unión fuerte y síntesis de ATPa la segunda subunidad T, mientras que en la tercera, O, se promovería la liberacibn del ATP. Ahora,en la O transformada en L,sefíjarian lassustratos, en la L transformada en T sesinteiizaría ATP, mienhay queen la T transformada en O se liberaría ATP. El paso de los protones por el interior de la ATPsintasa provoca la liberación del ATP al promover el cambio de T en O.

Control de la respiración celular
La respiracibn celular es regdada,fundamentalmente,por el potencial energético celular, niveles de ATP, ADP y AMP, annque contribuyen todos los factores que se requieren en los diferentes procesos que forman parte de ella. El ~hjodelos~rotones~del ckoplasmático a la matriz energiza este complejo, lado y se produce la liberación del A'l'Pen lasubunidad correspondiente. La unión del ADP, sobre todo, pero también la del fosfato, activan la A~Psintasa abriendo el canal para que se prodnzca el paso de los protones. Forman parte de la respiracibn celular, el ciclo de Kmbs y la cadena respiratoria, y en ésta se encuentran acoplados los procesos de la cadena transportadora de electrones y la fosfonlación oxidativa. Enipecemos por esta última.

Regulación de la ATP sintasa En el año de 1962se descubrió una proteína que inhibía la ATPasa mitocondrial. Posteriormentese vio que también inhibía la reacción directa del comple,jo V, la síntesisdel ATP. Se ohervó que esta protehainhibidorase une a las snbunidades b e b de la F, cuando se encuentra presente el ATP-Mg", lo que provoca la inhibición de la enzima tanto en su reacción hidrolítica como biosintética. La desinbibición se logra por la fuerza protón motriz, y en presencia de ADP y Pi. La regulación de la ATP sintasa mitocondrial por esta proteína inhibidora se relaciona íntimamente con la Iionieostasiscelulardel Caz*.La recaptura de Ca" por lai mitocondrias utiliza la fuerza protón motriz, y como la fuerza impulsara de la fosforilaeiónoxidativa es también la fuerza protón niotriz, anibas pueden, en determinadas circunstancias, conipetir por ella. Sin enihaigo. con Mn" presente, puedc ser recapturado el Ca" sin inhibirse la síntesis de ATP. Se haeeneeesario estudiar ni& profund;~inente inhibición para llegar a tener esta mayores conociniientos acerca de su función fisiológica.

De esta forma se une o no el ADP a esta partícula. En resumen, la ATPsintasa se inhibe al unirsele la proteína iiiliihidora, lo que ocurre en presencia de Ca", un pobre gradiente protónico y un potencial energético alto. En cambio, se desinhibe cuando el potencial energético es ba,jo, y se eleva la fuerza protón motriz. Esia ultima depende del transporte de electrones. La ATP sintasa tamhién se encuentra regulada por las concentraciones mitocondriales de ATP y ADP. Estos nucleótidos no pueden atravesar la membrana interna mitocondrial, sin embargo el ATPdebe salir al citoplasma y ser utilizado en diferenlrs pmclsos. en tanto que el ADPy el Pi dekii entrar, pues a partir de ellos sc fonna el ATP. El paio de estos compuestos depende de sus transportadores (capítulo37).

Aspedos generales de la regulación de la respiración celular
A lo largo de este capítulo y el anterior se Iian visto los factores implicados en la regulación de la respiración celular. Éstos se encuentran esquematizados en la figura 40.8. Entre los factores fisiológicosque pueden afectar el transporte electrónico, podemos citar la concentración de los cofxtores reducidos. Estos compuestos que transportan hidrógenos a la c-ndena transportadora deelectrones pueden acelerar o deprimir su funcionamiento en dependencia de sus concentraciones. Otro factor que se debe tener en cuenta es el «xigeno. puesto que este conipuesto es el aceptar final de los electrones. También es mny importante la intensidad del gradiente quese forma eu el proceso de la traslocación de los protones. Independientemente de la forma en que se produzca el mecanismo íntimo de la fosforilación oxidativa y el bombeode los protones, como ambos procesos se encuentran acoplados, al inhibirse de alguna forma uno de ellos, el otro también queda inhibido. Por último, el ciclo de Krebs es uno de los factores fundamentales que regulan la respiración celular, puesto que desu función depende, en gran medida,el aporte de los cofactoresreducidos. El ciclo de los ácidos tricarbomlicos requiere del sustrato oxidable, el acetil-COA,que proviene del catabolismo de glúcidos,del de los aminoácidos,~ de

los lipidos, y de la anaplerosis que provee la restitución de los rnetabolitos intermediano rios. Pero también requiere los cofactures oxidados y que sus enzin~as seatcuentren inhihidas. No dehernos olvidar el potencial energético celul:ir, la relación entre las concentracioues (le ATP y las de ADP, fundamentalniente. Para que ocurra la Fosforilación oxidativa se requiere la presencia de ADPen la matriz initocondrial, y que las concentraciones dc ATP no estén altas. Esto depende de las necesidades energéticas celulares. El intercambio entre estos 2 nucleótidos selleva a cabo por el traslocador de ATP-ADP, que depende a su vez del gradiente de protones, y esto casi cierra un ciclo, porlo que se puede decir que las oxidaciones celulares se autorregulan (Fig. 40.8). Sostrato~ oxidahle~ Acetil - COA

1

transporte

Fosforilación oxidativa

i

Procesos celulaes que consumen ATP Factoi-es que inl~ihen procesos los

Fig. 40.8. Heplaeibn de la rcspiraciiin relular.

Factores que activan los procesos

Desacopladores e inhibidores de la fosforilaci6n
Desacopladores
El 2,4 dinitrofenol (a) yotros compuestos, al disolverse en la nieinhrana y pasar a través de ella, transportan protones, captándolos en el exterior y liberándolos en el interior, y corno consecneneia se disipa el gradiente. Es por ello que desacoplan el transporte electrónicode la fosforilaeiónoxidativa: no se pmduce ATPpor la carencia

del gradiente protónico necesario, pero a su vez, el transporte de electrones se ve grandemente favorecidoal podcrse traslocar mayor cantidad de protones; de esta formase consume mác oxígeno. Al disiparse el gradiente,se pierde el potencial energélico contenido en él, y la cnergía selihera en forma decalor. Por esto eldesacoplamiento es un mecanisnio biolbgico que gciiera calor. De hecho, el tejido adiposo oscuro es muy rico en niitocondrias, y se encuentra especializado en este proceso dc la tennogénesis. Otros desacopladores son el dicoun~irol y la A-carbunüuanumfenilhidnzona (c). (h)

Muchos han sido los inhibidores de la fosforilaciónoxidativa que se han empleado para iiivesiigar este proceso. Estos conipuestos interfieren en la síntesis del ATPpor el complejo V initocondrial sin intervenir en el Lransporte electrónico. Sin emhargo, este ultimo proceso se ve afectado cuando se usan inhibidores de la fosforilación, ya que ambos procesos se encuentran acoplados. La aurovertina D es un inhibidor de la fosforilaciónoxidativa y es fluorescente. Su fluorescenciase incrementa al unirse a la ATPsintasa, sobre todo en presencia de ADP, pero en presencia dc ATP esta fluortscencid se elimina. Este inhibidor se une a los 3 sitios de unión de las F,, al nivel de las subunidades beta, pero con desigual afinidad para cada sitio. La efrapeptina es otro inhibidor de este proceso y actúa inipidiendo la unión del fosfato. Compite con el fosfatoy el ADPdurantela síntesis de ATP. La oligoinicina interfiereal unirse a una de las proteínas de la base de la ATPsinlasa.

Resumen
La fosforilaaón oxidativa e~la sintesis del ATF'amplada al transporte de elnes, y se Ueva a cabo en la membrana interna de la miiomndria En el transporte de , el&nes parücipan 4 cnmplejm, pero sólo 3d e d o s , el 1el III y el N, intervienen en la fosforilación oxidativa Al ser transprtadm lm electrones a lo largo de estos mmplejm, y por un meranismo aún no bien aclarado, se produce un bombeo de prntones de la matriz a través de la membrana interna, haaa el espacio intermembranow. Esto produce un gradiente eleetroquúnim entre ambos lados de la membrana interna que cuaudo alcama una hiena prnión motriz de O p V, y por memismos todavía poco

conoc¡dos, vuelven a fiuirlos pmtones a través del complejo V 6 ATPsintasa, lo que la eney se s i n t e h ATP. La ATF'sintasa se subdivide para su estudio en 3 partes: cabeza o partícula F,, que se proyecta hacia la matriz mitocondrial, el tallo o porción intermedia o cueLlo, que une a la F, a la base o partícula F, Ésta se sitúa en la membrana interna y es transmembranal. La cabeza contiene S proteínas diferentes y se subdivide, a su vez, en 3 subunidades.En cada una de estas subunidadesse s i o t e h ATF'defomm alternada v consecutiva. al i r cambiando la conformación de ellas. Este oroceso de fosforilación oxidativa depende del paso de los pmtones a través de la ATF'sintasa, lo que disipa el gradiente; también depende de la unión de las moléculas de ADP y Pi a los centros activos. El paso de los protones ocurre a lo largo del canal que recorre tallo, cuello y cabeza y, como yn se mencionó, cuando el gradiente electmqumiico llega a un cierto nivel. La energía que estaba contenida en los cofactoresreducidos es muy bien aprovechada en la súitesis de ATF'. La regulación de la síntesis del ATF'está muy relacionnda con la regulación del transporte electrónico y con el ciclo de Krebs. El ATF', al unirse a una pmteina inhibidora asociada al complejo V, lo inhibe, pero tamhién se debe recordar que el ATF' a su vez inhibía el cielo de Krebs, lo que pmvoca menor producción de cofactores reducidos. Esia falta de s u s t r a h enlentece la cadena transportadora y disminuye la f o m a ó n del gradiente protónico. La desinhibiaón de todo el sistema se logra con la presencia de mayores roncentraciones de ADP y Pi, al ser el ATF' consumido por el organismo. La presencia de ADP activa enzimas del ciclo de Krebs siempre que exista el alimentador correspondiente (el acetü-COA)y suñcienies meiabolitos intermediarios -sobre todo 4cido oxalacético. Esta activación del cielo aumenta la producción de cofactores reducidos, lo que activa el transporte de electronesy aumenta el gradiente protónico que, a su vez, se está disipando a través del canal de la ATPsintetasa, ya que éste se encuentra abierto debido a que los centros activos se hallan ocupados por ADP y Pi, lo que ha provocado el desplazamiento de la proteína del centro activo.

Ejercicios
1. Haga un esquema que justifique la síntesis total de ATPque se obtendría de la oxidación de un m01 de acetil-COA. 2. Relacione todas las proteínas que iiitervendriaiien la producción del prinier mol de ATPdel prol>leo~a anterior. 3. Si incorporáramos a un liposoma el coiiiple,jo 111y el V, ¿,qué otros factorcs se tendrían que adicionar para quese llevara a cabo la síntesis de ATP? 4. ¿Cómo podría demostrarse, tcbricainente, con el uso de ioliibidoresquc el complejo 1 es un sitio en el cual se libera suficiente energía para que se produzca la fosforilaciónoxidativa? Mencione los iiihibidores que se emplearían. 5. :,Podría ocurrir la síntesis de ATPcn ausencia de la E,? Explique su mpuesta. 6. Haga un csqucina que relacione el ciclo de Krclx con el transporte de electrones y la fosforilación oxidativa. Basándose en este esquciiia, explique la regulación de la respiración celular: a) Ciiando la relación cofactorcs reducidoslcofactoresoxidados es alta. b) Cuando la relación ADPl ATPes alta. c) Cuando disminuye el PO, debido a una isqiiemia.

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